HPLC法測定丁白貼劑成分含量的研究

張慧，張麗美，劉善新，蘇酩，李瑩，趙立建

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014)

漿細(xì)胞性乳腺炎(Plasma cell mastitis)又稱為乳腺導(dǎo)管擴(kuò)張癥，是以乳腺導(dǎo)管阻塞導(dǎo)致擴(kuò)張、漿細(xì)胞受到浸潤為病變基礎(chǔ)的慢性非細(xì)菌性乳腺炎癥[1]。目前漿細(xì)胞性乳腺炎的治療方法主要包括西醫(yī)的手術(shù)切除法和中醫(yī)療法，中醫(yī)療法包括中藥內(nèi)治法和外治法兩種，其中中藥外治法由于直接作用于病灶，見效快，副作用小，能夠徹底治愈等優(yōu)點(diǎn)而具有明顯優(yōu)勢。

丁白貼劑來源于臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)方，具有溫通化瘀的功效，用于初期及中期漿細(xì)胞性乳腺炎的治療。貼劑由花椒(Zanthoxyli pericarpium)、丁香(Caryophylli flos)、赤芍(Paeoniae radix rubra)等中藥組成，對處方中的藥材經(jīng)過提取純化，再以熱塑性壓敏膠為基礎(chǔ)膠黏劑，加入其他基質(zhì)制成貼劑，使用方便，可隨時(shí)貼敷和停用，無創(chuàng)傷性，可持續(xù)給藥。丁香酚為丁香的主要成分，現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，丁香酚具有消炎、鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、促進(jìn)透皮吸收等作用[2-3]。赤芍主要含有芍藥苷、羥基芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等[4]。具有清熱涼血，散瘀止痛的功效，現(xiàn)代臨床研究表明芍藥苷具有增強(qiáng)免疫功能、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[5]。為制定該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，參考有關(guān)文獻(xiàn)[6-7]對其所含的丁香酚、芍藥苷進(jìn)行了含量測定研究，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀；Ultimate 3000紫外檢測器，Chromeleon7工作站(美國Thermo公司)；色譜柱： Lichrospher C18柱(江蘇漢邦科技有限公司)；HH-4數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(江蘇金壇市晶玻廠)；Sartorius BP211D電子天平(德國Sartorius公司)。

1.2 試藥

處方中赤芍等飲片購于山東百味堂中藥飲片有限公司，均為2015年版《中國藥典》一部[8]各藥材項(xiàng)下收載的正品飲片；芍藥苷對照品(批號110736-201438)、丁香酚對照品(110725-201615)均購自中國食品藥品檢定研究院；純凈水(杭州娃哈哈)；所用試劑甲醇、乙腈均為分析純或色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 條件與制備

2.1.1 色譜條件

2.1.2 供試品溶液的制備

丁香酚：取本品膏體約2 g，剪碎，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱重，超聲(頻率40 kHz，功率300 W)30 min，放冷后稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，以0.45 μm濾膜濾過，即得供試品溶液Ⅰ。

芍藥苷：取本品膏體5 g，剪碎，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷稱重，甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，水浴蒸干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次15 mL，水液用水飽和的正丁醇萃取4次，每次15 mL，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，以甲醇稀釋至刻度搖勻，以0.45 μm濾膜濾過，即得供試品溶液Ⅱ。

2.1.3 對照品溶液的制備

丁香酚：精密稱取丁香酚對照品，加甲醇配成濃度為47.2 μg·mL-1的溶液作為丁香酚對照品溶液。

芍藥苷：精密稱取芍藥苷對照品，加甲醇分別配制成濃度為27.3 μg·mL-1、54.6 μg·mL-1溶液作為對照品溶液。

2.1.4 空白對照溶液的制備

按處方比例，分別稱取除丁香、赤芍以外的其他藥材，模擬本品的制備工藝和供試品的制備方法，分別制成缺丁香空白對照溶液、缺赤芍空白對照溶液。

2.2 測試結(jié)果

2.2.1 空白干擾實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取丁香酚對照品溶液、供試品溶液Ⅰ、缺丁香空白對照溶液和濃度為27.3 μg·mL-1的芍藥苷對照液、供試品溶液Ⅱ、缺赤芍空白對照溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按2.2.1色譜條件檢測，結(jié)果表明丁香酚、芍藥苷對照液和供試品溶液在相同的保留時(shí)間均呈現(xiàn)吸收峰，而缺丁香、缺赤芍空白液在與對照品相應(yīng)的位置上未見色譜峰出現(xiàn)，見圖1、圖2，這表明本測定無干擾。

圖1 丁香酚含量測定HPLC圖Fig. 1 HPLC chromatogram for the determination of eugenol content

圖2 芍藥苷含量測定HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram for the determination of paeoniflorin content

2.2.2 線性關(guān)系考察

分別精密吸取丁香酚對照品溶液1、3、5、7、10 μL進(jìn)樣測定，濃度為54.6 μg·mL-1的芍藥苷對照品溶液1、3、5、7、9 μL進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，結(jié)果丁香酚線性范圍為0.0472～0.472 μg，回歸方程為：Y=14.52X-0.044，相關(guān)系數(shù)R=1.000 0；芍藥苷線性范圍為0.054 6～0.491 4 μg，回歸方程為Y=19.81X+0.079，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9。

2.2.3 精密度

分別精密吸取丁香酚對照品溶液、芍藥苷對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，連續(xù)測定5次，測得丁香酚的峰面積積分值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.119%，芍藥苷的峰面積積分值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.448%。

2.2.4 穩(wěn)定性

分別精密吸取丁香酚供試品溶液和芍藥苷供試品溶液各10 μL，在0，3，6，9，12，24 h 各進(jìn)樣一次，共進(jìn)樣測定6次，測其峰面積積分值，丁香酚相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.197%，芍藥苷相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.647%。

2.2.5 重復(fù)性考察

丁香酚：取同一批樣品(批號：20170206)約2 g，共取6份，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液Ⅰ方法制備供試液并測定丁香酚的含量，結(jié)果6次測定的丁香酚的平均含量為0.404 8 mg·g-1，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.62%。

芍藥苷：精密稱取同一批(批號：20170206)樣品膏體5 g，平行操作6份，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液Ⅱ方法制備供試液并測定芍藥苷的含量，結(jié)果6次測定的芍藥苷平均含量為0.02681 mg·g-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.35%。

2.2.6 回收率

丁香酚：采用加樣回收法，精密稱取已測知丁香酚含量的同一批樣品(批號：20170206)約1 g，共6份，分別加入0.431 mg丁香酚混勻，制成供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下方法測定，結(jié)果丁香酚的平均回收率為97.18%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.96%。

芍藥苷：采用加樣回收法，精密稱取已測知芍藥苷含量的同一批樣品(批號：20170206)膏體2.5 g，分別加入芍藥苷對照品0.068 mg，混勻，平行6份，制成供試品溶液測定，結(jié)果芍藥苷平均回收率為98.56%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.24%。

2.2.7 樣品的測定

分別精密吸取丁香酚、芍藥苷對照品溶液與3批供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，并計(jì)算各批樣品中丁香酚、芍藥苷的含量，結(jié)果見表1。

表1 3批樣品含量測定結(jié)果(每貼含量)

3 討論

本貼劑的膏體較粘稠，在芍藥苷測定供試品溶液的制備中選用加熱回流提取法，將制劑中的有效成分提取更完全。對提取液純化時(shí)先用乙酸乙酯萃取除去脂溶性雜質(zhì)，再以水飽和的正丁醇提取富集芍藥苷，經(jīng)處理后的供試品溶液適宜于高效液相進(jìn)樣分析。

本研究確定的丁白貼劑中丁香酚、芍藥苷的含量測定方法可行性、重復(fù)性好，可作為本制劑的含量測定方法，為制定可行可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也可以為同類制劑的含量測定提供參考。

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