角鯊烯對HepG2細(xì)胞LDLR表達(dá)的影響及機(jī)制初探

李 婷，趙麗萍，余超超，田 男，范春雷

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310053)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是誘發(fā)腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，膽固醇代謝紊亂是AS發(fā)生的關(guān)鍵因素，降低血液膽固醇水平可減少AS的發(fā)病率和死亡率[1]。體內(nèi)大部分膽固醇結(jié)合于低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)，通過低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)進(jìn)入肝臟代謝，因此,上調(diào)LDLR的表達(dá)是降低血液膽固醇濃度的主要手段。膽固醇合成受固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding protein, SREBP)及其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白(sterol regulatory element binding protein cleavage activating protein, SCAP)的調(diào)節(jié)。臨床上，他汀類降膽固醇藥，是一類羥甲基戊二酰輔酶A(hydroxy methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑[2-4]。但部分患者長期服用他汀類藥物后會出現(xiàn)相關(guān)不良反應(yīng)，如肝功能損害等[5]。因此，篩選新型降膽固醇藥物是調(diào)血脂藥物的研究重點(diǎn)。

角鯊烯是由 6個異戊二烯連接而成的不飽和三萜類化合物，具有廣泛的生物活性[6-7]。Shin等[8]研究發(fā)現(xiàn)，外源性角鯊烯可以降低HMG-CoA還原酶的活性，抑制膽固醇的合成；Smith等[9]報道，角鯊烯能夠通過激活過氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。目前關(guān)于角鯊烯是否能夠上調(diào)LDLR的表達(dá)，及可能的作用機(jī)制尚未見報道。

胰島素誘導(dǎo)基因( insulin-induced gene, Insig)是調(diào)控脂肪分化和脂質(zhì)代謝的新基因，其編碼的Insig2蛋白是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合蛋白[10]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度較高時，其結(jié)合于SCAP的固醇敏感結(jié)構(gòu)域，并以Insig2-SREBPs-SCAP 復(fù)合物形式附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，阻止SCAP 護(hù)送SREBPs至高爾基體,調(diào)控 LDLR基因的轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平[11-13]。實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建有青色熒光蛋白(cyan fluorescent protein，CFP)標(biāo)簽的Plv-CFPSCAP質(zhì)粒和黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)標(biāo)簽的Plv-YFP Insig2質(zhì)粒，通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法將二者共轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)的報告基因細(xì)胞系，用于該靶點(diǎn)藥物的研究。本研究檢測不同濃度角鯊烯對HepG2細(xì)胞內(nèi)源性LDLR表達(dá)活性的影響，通過熒光能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)技術(shù)，從細(xì)胞信號調(diào)控角度分析角鯊烯對SCAP蛋白和Insig2蛋白相互作用的影響，闡明角鯊烯降膽固醇的機(jī)制。

1 材料

1.1細(xì)胞與試劑人肝癌細(xì)胞HepG2購自中科院上海細(xì)胞所；CFPSCAP/YFPInsig2/HepG2報告基因細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室前期建立。角鯊烯(CAS：111-02-4)購自梯希愛(上海)化成工業(yè)有限公司，批號S3626；細(xì)胞膜紅色熒光探針 (DiI)，購自杭州碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C1036。

1.2儀器Guava EasyCyte 8微流式細(xì)胞分析儀(美國EMD Millipore公司)；DS-5M-L1熒光倒置顯微鏡(日本尼康儀器有限公司)；細(xì)胞能量代謝實(shí)時檢測系統(tǒng)(德國FLUOstar Omega公司)，型號BMG LABTECH。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞呈貼壁生長，用含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，采用0.25%胰酶消化，每3 d按1 ∶3的比例傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2MTT實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，以5×103個/孔的密度接種于96孔板，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行藥物處理，設(shè)置空白對照組和終濃度分別為100、150、200、250、300、350、400 μmol·L-1的角鯊烯藥物處理組，每組6個復(fù)孔。MTT具體操作按照試劑使用說明書進(jìn)行。細(xì)胞增殖抑制率/%=(1-處理組吸光度/對照組吸光度)×100%。

2.3LDL的分離純化和DiI-LDL的制備參考文獻(xiàn)[13]，利用密度梯度超速離心法分離人血漿中的LDL，通過Sepharse 6B凝柱層析進(jìn)一步純化，得到高純度LDL。取4 mg DiI和l00 mg不溶性馬鈴薯淀粉用4 mL磷酸鹽緩沖液( pH 7.4 )溶解后，置于試管中渦旋振蕩，然后加入含1% DiI的甲醇溶液60 μL , 4℃放置 l h，冷凍干燥后，加入 2 mL 10 mmol·L-1三(羥甲基)甲基甘氨酸-疊氮化鈉緩沖液(pH 8.2)。4℃冰箱中孵育，每隔2 h取出混勻1次；48 h后，4℃、2 000 r·min-1離心15 min；取上清4℃、2 000 r·min-1離心15 min；所得上清含有DiI-LDL，分裝4℃保存。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測角鯊烯對HepG2細(xì)胞LDLR表達(dá)活性的影響將HepG2細(xì)胞分為A、B實(shí)驗(yàn)組，每個實(shí)驗(yàn)組分別加入0、5、15、25 μmol·L-1的角鯊烯處理細(xì)胞，每個藥物濃度設(shè)3個復(fù)孔。將細(xì)胞分別加藥后搖勻，置于37℃、5% CO2中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液上清，在實(shí)驗(yàn)A組中均加入5 mg·L-1DiI-LDL，實(shí)驗(yàn)B組內(nèi)均加入5 mg·L-1DiI-LDL和10 mg·L-1膽固醇溶液，置37℃、5% CO2中避光培養(yǎng)4 h，然后置4℃避光培養(yǎng)0.5 h后取出細(xì)胞，吸去上清，胰酶消化，離心取細(xì)胞沉淀，加入PBS溶液重懸細(xì)胞，再加入4%甲醛，吹勻靜置10 min。離心棄去上清，用PBS溶液清洗3次，最后在每管細(xì)胞沉淀中加入300 μL PBS溶液重懸，用倒置熒光顯微鏡觀察紅色熒光亮度，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞中的DiI熒光量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中各組細(xì)胞平均紅色熒光強(qiáng)度反映LDLR的活性。

2.5FRET檢測角鯊烯對SCAP蛋白和Insig2蛋白相互作用的影響取對數(shù)期生長的CFPSCAP/YFPInsig2/HepG2細(xì)胞，以1.2×106個/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中。實(shí)驗(yàn)分為5組，第1組為空白對照組，不加任何藥物；第2組為模型對照組，加入終濃度為10 mg·L-1的膽固醇溶液，不加角鯊烯；第3-5組為給藥組，分別給予5、15、25 μmol·L-1的角鯊烯處理細(xì)胞。各組細(xì)胞置于37℃、5% CO2中培養(yǎng)12 h。然后各組細(xì)胞1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，沉淀分別加入2 mL PBS溶液洗2遍。最后每組細(xì)胞沉淀用1 mL PBS溶液重懸，以每孔1×104個細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)5個復(fù)孔。使用FLUOstar Omega多功能熒光酶標(biāo)儀檢測SCAP蛋白和Insig2蛋白之間的相互作用，結(jié)果以每10 000個細(xì)胞的平均YFP熒光值表示。

3 結(jié)果

3.1角鯊烯對HepG2細(xì)胞活性的影響不同濃度的角鯊烯與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，MTT法測定角鯊烯對HepG2細(xì)胞抑制率的影響。Fig 1結(jié)果顯示，角鯊烯在0～400 μmol·L-1范圍內(nèi)對HepG2細(xì)胞抑制率均小于20%，未達(dá)到50%抑制率時的角鯊烯藥物濃度(IC50)。因此，我們選取0～25 μmol·L-1濃度范圍研究角鯊烯對細(xì)胞LDLR表達(dá)的影響。

Fig 1 Effect of squalene on proliferation

Fig 2 Effects of different concentrations of squalene on activity of LDLR in HepG2 cells(×20)

3.2角鯊烯上調(diào)HepG2細(xì)胞LDLR的表達(dá)活性Fig 2的倒置熒光顯微鏡結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)過角鯊烯處理后，HepG2細(xì)胞的DiI-LDL紅色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，并呈濃度依賴性。Tab 1的流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果表明，角鯊烯明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞 LDLR的表達(dá)活性，并且在0～25 μmol·L-1范圍內(nèi)，隨著角鯊烯濃度的增高，LDLR表達(dá)活性增強(qiáng)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

Tab 1 Effect of different concentrations of squalene on LDLR activity in HepG2 cells by flow cytometry

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.3角鯊烯對SCAP蛋白和Insig2蛋白相互作用的影響Tab 2的FRET檢測結(jié)果顯示，與模型對照組相比，角鯊烯組YFP熒光值降低，而在5～25 μmol·L-1范圍內(nèi)，隨角鯊烯濃度的增高，YFP熒光值降低。YFP的平均熒光值越低，說明角鯊烯能夠降低SCAP與Insig2的結(jié)合率，激活了SCAP/SREBP固醇調(diào)控通路，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

4 討論

肝臟是人體脂蛋白及LDL-C代謝的主要臟器，所以選用人肝細(xì)胞系 HepG2 細(xì)胞，該細(xì)胞系能夠正常表達(dá)參與膽固醇和脂質(zhì)代謝有關(guān)的酶類和蛋白，目前已被廣泛應(yīng)用于LDLR作用途徑及調(diào)脂藥物篩選和作用機(jī)制的研究。

Tab 2 Effect of squalene on SCAP and Insig2 protein binding shown by FRET results

**P<0.01vsmodel control

采用MTT法檢測角鯊烯對HepG2細(xì)胞的毒性。前期經(jīng)過一系列MTT預(yù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明，角鯊烯在400 μmol·L-1濃度內(nèi)對細(xì)胞的毒性較小,當(dāng)角鯊烯的濃度超過25 μmol·L-1時，藥效已達(dá)到飽和，再選取更高濃度已沒有意義。所以我們以此為參照，選取低、中、高3個不同濃度的角鯊烯進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。DiI 是一種羰花青染料，可以與脂蛋白結(jié)合，獨(dú)有的羰花青探針可以嵌入細(xì)胞膜做側(cè)向擴(kuò)散運(yùn)動，從而標(biāo)記整個細(xì)胞。流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果顯示，在同一角鯊烯濃度下，實(shí)驗(yàn)A組的平均熒光強(qiáng)度值均高于實(shí)驗(yàn)B組，實(shí)驗(yàn)B組中加入10 mg·L-1膽固醇，胞內(nèi)膽固醇濃度增高，膽固醇能特異性吸收DiI-LDL標(biāo)記的LDLR, 最終降低了LDLR的表達(dá)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)B組細(xì)胞的平均紅色熒光值低于A組。因此，我們推測角鯊烯與膽固醇之間有競爭抑制作用，可能競爭作用于SCAP/SREBP通路。

FRET技術(shù)是指能量從一種受激發(fā)的熒光基團(tuán)轉(zhuǎn)移到另一種熒光基團(tuán)的檢測方法，目前廣泛應(yīng)用于研究細(xì)胞內(nèi)的蛋白分子間的相互作用[14]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有較高膽固醇濃度時，膽固醇結(jié)合于固醇敏感結(jié)構(gòu)域，并使SCAP與Insig2結(jié)合形成緊密的復(fù)合體。此時，細(xì)胞用440 nm的激發(fā)光激發(fā)CFPSCAP融合蛋白上的CFP，CFP產(chǎn)生490 nm熒光能量，被鄰近的YFPInsig2融合蛋白上的YFP吸收而產(chǎn)生527nm的黃色熒光。當(dāng)細(xì)胞用固醇位點(diǎn)競爭結(jié)合藥處理時，膽固醇失去作用，CFPSCAP與YFPInsig2分離，此時細(xì)胞用440 nm的激發(fā)光激發(fā)CFPSCAP融合蛋白上的CFP，CFP產(chǎn)生490 nm熒光[15]。利用這一機(jī)制并應(yīng)用FRET技術(shù)可分析角鯊烯對細(xì)胞內(nèi)SCAP蛋白與Insig2蛋白結(jié)合的影響，檢測結(jié)果中YFP的熒光值，可以間接反映SCAP與Insig2的結(jié)合情況。建立CFPSCAP/YFPInsig2/HepG2細(xì)胞系用于膽固醇競爭結(jié)合位點(diǎn)靶點(diǎn)新藥的研究。當(dāng)細(xì)胞用角鯊烯處理后，YFP的熒光值降低，說明SCAP與Insig2的結(jié)合率降低，SCAP/SREBP固醇調(diào)控途徑激活，SCAP與SREBPs形成復(fù)合物，并通過囊泡運(yùn)輸?shù)姆绞竭M(jìn)入到高爾基復(fù)合體。SREBPs在高爾基體中經(jīng)過兩步剪切后，釋放出活性氨基末端“堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈”(bHLH-ZIP)并進(jìn)入核中，在細(xì)胞核內(nèi) bHLH-ZIP與靶基因上游的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合，從而激活靶基因LDLR的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)LDLR的表達(dá)。因此，我們推測角鯊烯可能是通過與膽固醇競爭結(jié)合，降低了SCAP與Insig2的結(jié)合率，激活了SCAP/SREBP途徑。

綜上所述，我們建立了一個新型的降膽固醇藥選靶系統(tǒng)，通過流式細(xì)胞術(shù)和熒光倒置顯微鏡表明角鯊烯能夠上調(diào)HepG2細(xì)胞LDLR表達(dá)活性，F(xiàn)RET實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平初步證明角鯊烯與膽固醇在固醇敏感結(jié)構(gòu)域靶點(diǎn)競爭結(jié)合，從而激活SCAP/SREBP途徑，上調(diào)LDLR的表達(dá)。因而角鯊烯可能是一個具有潛在價值的降膽固醇新藥。

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