不同根瘤菌菌株對(duì)鹽脅迫下甘農(nóng)9號(hào)苜蓿生長(zhǎng)及生理特性的影響

祁 娟，王 婷，白小明，焦 婷，馬國(guó)珍，楊英東，何凌峰

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心，甘肅 蘭州 730070)

土壤鹽堿化在全世界廣泛存在，怎樣利用、恢復(fù)及改良鹽堿地是目前農(nóng)牧業(yè)發(fā)展亟需解決的瓶頸問(wèn)題。篩選有較強(qiáng)耐鹽堿能力且能增加土壤肥力的耐鹽豆科植物，無(wú)疑是鹽漬地改良利用的一項(xiàng)有效途徑。紫花苜蓿 (MedicagosativaL.)是世界上廣泛種植的較耐鹽植物，它不但能為牲畜提供優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，而且在鹽漬地的改良中能充分發(fā)揮生物固氮的功能，減少環(huán)境污染，對(duì)大力發(fā)展畜牧業(yè)，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展意義重大。國(guó)內(nèi)外在苜蓿耐鹽性方面做了大量研究并將其引入鹽堿地改良[1,2]，尤其是苜蓿與根瘤菌形成固氮共生體對(duì)土著菌缺乏的土壤改良效果尤為明顯，所以為鹽漬地紫花苜蓿選擇抗逆性強(qiáng)的相匹配根瘤菌具有重要意義。土壤本身是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，土壤的類(lèi)型、pH值以及其它理化性質(zhì)都能影響根瘤菌的接種效果。所以，對(duì)于不同地區(qū)的土壤應(yīng)選擇最適宜的根瘤菌作為接種劑，才能獲得最佳的增產(chǎn)效果[3,4]。

國(guó)內(nèi)外研究表明，苜蓿根瘤菌對(duì)苜蓿品種具有一定的選擇性，同一菌株同時(shí)接種不同的苜蓿品種，或者同一苜蓿品種分別用幾株菌株接種，都會(huì)出現(xiàn)不同的共生效果，而且彼此間差異較大[5]。國(guó)際上非常重視根瘤菌與苜蓿匹配優(yōu)良組合的篩選研究，但是根瘤菌與豆科植物共生關(guān)系是細(xì)菌、植物及環(huán)境三方相互作用的結(jié)果，而不只是細(xì)菌與植物間的相互對(duì)話(huà)[3]。因此進(jìn)行根瘤菌選種時(shí)必須針對(duì)種植的生態(tài)環(huán)境及寄主植物兩方面因素來(lái)選擇根瘤菌的最佳匹配，只考慮與寄主關(guān)系很可能是田間接種效果不穩(wěn)定的主要原因。土壤特性對(duì)根瘤菌與宿主植物的結(jié)合及其生存與代謝活動(dòng)有影響[6]。植物-土壤-根瘤之間存在復(fù)雜的關(guān)系，影響其共生體系穩(wěn)定性的因素很多[7]，只有篩選出與苜蓿品種相匹配且能夠在土壤環(huán)境中大量繁殖、促生效果較好的優(yōu)良根瘤菌株，才能達(dá)到提高苜蓿產(chǎn)量及品質(zhì)的目的。

逆境脅迫可以影響豆科植物根瘤的形成、發(fā)育和根瘤菌的固氮效率[8]。高濃度的鹽可以提高植物根部的滲透壓，抑制根瘤呼吸及光合作用產(chǎn)物向根瘤的供應(yīng)，使根瘤的固氮活性和植物的生長(zhǎng)都受到不同程度的影響[9]，從而在一定程度上抑制根瘤菌固氮并降低豆科植物的產(chǎn)量[10,11]。目前，關(guān)于不同根瘤菌菌株接種對(duì)苜蓿生長(zhǎng)及耐鹽性的影響研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究選用5株前期試驗(yàn)中篩選出的與甘農(nóng)9號(hào)苜蓿匹配較好的菌株，了解鹽脅迫環(huán)境下，根瘤菌與苜蓿共生對(duì)其生長(zhǎng)及抗逆性特性的影響，為優(yōu)良菌株的進(jìn)一步篩選及苜蓿耐鹽性育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

碘伏滅菌的甘農(nóng)9號(hào)苜蓿種子(來(lái)自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院)和5株經(jīng)初步篩選的與甘農(nóng)9號(hào)苜蓿匹配較好的根瘤菌株Da99、Ga66、Wa32、DL58、QL31B(均由本課題組分離純化自紫花苜蓿根部)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 幼苗培養(yǎng) 試驗(yàn)于2016年3-6月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院光照培養(yǎng)室進(jìn)行。選用甘農(nóng)9號(hào)苜蓿種子，在其中挑選出飽滿(mǎn)均勻的種子，先對(duì)種子進(jìn)行表面滅菌消毒，將苜蓿種子用清水洗凈放入碘伏溶液(0.455%～0.55% w·v-1,德州消毒制品公司)中浸泡2min，然后用無(wú)菌水沖洗6～10次，最后將消毒好的種子50粒播種到盛有滅菌沙子的培養(yǎng)缽中(6.0cm×7.5cm，每杯中裝沙400g)。種子萌發(fā)出苗后，每盆定植20株，轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)室，光照14h·d-1，光通量密度400μmol·m-2·s-1)，晝夜溫度分別為(25±1)℃，相對(duì)濕度60%。在播種第15天，給對(duì)照和每個(gè)處理均加無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液200mL，F(xiàn)ahraeus無(wú)氮植物營(yíng)養(yǎng)液配方參照韓梅等研究方法[12]，為了減少干擾，無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液僅加1次。

1.2.2 菌懸液制備及接菌 根據(jù)接種時(shí)間，將保存的根瘤菌加入無(wú)菌水制成菌液后接種到Y(jié)MA斜面上進(jìn)行活化擴(kuò)大培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到Y(jié)MA液體培養(yǎng)基中， 置于轉(zhuǎn)速180 r·min-1，溫度28 ℃搖床中培養(yǎng)，測(cè)定根瘤菌懸浮液光密度值(OD600)，OD600>0.5時(shí)，將全部供試菌株配制成光密度值一致為0.5的菌懸液，注入苜蓿幼苗根部。

1.2.3 鹽脅迫處理及根瘤菌接種 待苜蓿苗長(zhǎng)出第三片葉子時(shí)，將不同濃度的NaCl溶液(0、0.4%、0.8%、1.2%)40 mL 澆入培養(yǎng)缽內(nèi)，3d后再澆一次，待溶液完全吸收后(6d左右)，將菌液接種到苜蓿根部，每個(gè)培養(yǎng)缽接種20mL菌液，以不接種根瘤菌為空白對(duì)照，每個(gè)處理4次重復(fù)，共25個(gè)處理。

1.3 優(yōu)良菌株組合篩選實(shí)驗(yàn)和指標(biāo)測(cè)定

待幼苗生長(zhǎng)種植60d后收獲，分別測(cè)定形態(tài)指標(biāo)、根瘤數(shù)及生理指標(biāo)。

1.3.1 甘農(nóng)9號(hào)苜蓿幼苗形態(tài)指標(biāo)及根瘤數(shù)測(cè)定

(1)株高與根長(zhǎng) 待幼苗種植60d后收獲，收獲時(shí)用水沖洗干凈根部，在4個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取10株苜蓿幼苗，從子葉痕處至離生長(zhǎng)點(diǎn)最近的展開(kāi)的葉頂端測(cè)定其株高，從子葉痕處至根尖測(cè)定根長(zhǎng)。

(2)地上部分和地下部分鮮重及干重的測(cè)定 將幼苗收獲后用水沖洗干凈根部，再用濾紙將根部水分吸干，將每個(gè)重復(fù)中10株苜蓿幼苗地上部分與地下根部從第一片子葉葉痕處分開(kāi)，自然條件放置使其自然風(fēng)干至恒重，稱(chēng)取不同處理中每個(gè)重復(fù)所對(duì)應(yīng)的地上部分干重和地下部分干重。

(3)將幼苗收獲后用水沖洗干凈根部，再用濾紙將根部水分吸干，分別在不同處理中隨機(jī)取10株苜蓿幼苗，測(cè)定每個(gè)重復(fù)的有效根瘤數(shù)，呈粉紅色、形態(tài)飽滿(mǎn)。

1.3.2 甘農(nóng)9號(hào)苜蓿幼苗生理指標(biāo)的測(cè)定 脯氨酸含量(酸性茚三酮法)、丙二醛含量(硫代巴比妥酸法)、可溶性糖含量(蒽酮法)、可溶性蛋白含量(考馬斯亮藍(lán)G-250染色法)的測(cè)定參照王學(xué)奎[13]方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 隸屬函數(shù)計(jì)算方法 采用下述公式計(jì)算各指標(biāo)具體隸屬值：當(dāng)指標(biāo)與抗性呈正相關(guān)時(shí):F=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)，當(dāng)指標(biāo)與抗性呈負(fù)相關(guān)時(shí)：F=1-[(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)]。式中，F(xiàn)為測(cè)定指標(biāo)的具體隸屬函數(shù)；Xj表示某個(gè)指標(biāo)的測(cè)定值；Xmin表示某一指標(biāo)所有測(cè)定值中的最小值；Xmax表示某一指標(biāo)所有測(cè)定值中的最大值；然后將每一指標(biāo)的具體隸屬值進(jìn)行累加，求平均值得到該指標(biāo)的隸屬度。

1.4.2 本次試驗(yàn)采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽濃度下不同根瘤菌株接菌對(duì)苜蓿株高的影響

接入不同苜蓿根瘤菌后對(duì)其幼苗株高均有一定程度影響,見(jiàn)圖1。同一菌種隨著鹽濃度增大，苜蓿幼苗株高基本呈降低趨勢(shì)。在0、1.2%鹽濃度下，QL31B菌種處理下的幼苗株高與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，分別較對(duì)照增長(zhǎng)了18.2%、37.9%，其它菌種次之；在0.4%鹽濃度下，Ga66、Wa32、DL58、QL31B菌種處理下的幼苗株高與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，但菌株之間對(duì)株高的影響不顯著；在0.8%鹽濃度下，Da99、Ga66、Wa32、DL58、QL31B菌種處理下的幼苗株高與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，菌株之間對(duì)株高的影響亦不顯著(圖1)。

圖1 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌對(duì)苜蓿幼苗株高的影響Fig.1 Effects of different rhizobia strains on height of alfalfa seedling under different NaCl concentrations

2.2 不同鹽濃度下不同根瘤菌株接菌對(duì)苜蓿幼苗根長(zhǎng)的影響

同一菌種隨著鹽濃度增大，苜蓿幼苗根長(zhǎng)基本呈降低趨勢(shì)。在同一鹽濃度下，大部分菌株相對(duì)于對(duì)照，對(duì)根生長(zhǎng)促進(jìn)作用不顯著。但菌株QL31B不同鹽濃度處理下的幼苗根長(zhǎng)與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，且其根長(zhǎng)分別較對(duì)照增長(zhǎng) 7.5%、19.7%、16.2%、11.8%(圖2)。

2.3 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌株接菌對(duì)苜蓿幼苗地上部分干重的影響

從圖3可以看出，同一菌種隨著鹽濃度增大，苜蓿幼苗地上部分干重基本呈降低趨勢(shì)。在同一鹽濃度下，經(jīng)根瘤菌接菌處理后，在各個(gè)不同根瘤菌組合處理下的苜蓿幼苗地上部分干重較對(duì)照，大部分處理干重變化不大。在鹽濃度為0條件下，QL31B菌種處理下的幼苗地上干重與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，增長(zhǎng)了32.2%；在1.2%鹽濃度下，QL31B菌種處理下的幼苗地上干重與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，增長(zhǎng)了37.3%，Da99、Ga66、Wa32、DL58菌種處理下的幼苗地上部分干重與對(duì)照相比差異不顯著。

2.4 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌株接菌對(duì)苜蓿幼苗根干重的影響

同一菌種處理下，隨著鹽濃度增大，苜蓿幼苗地下部分干重基本呈降低趨勢(shì)。在同一鹽濃度下，經(jīng)根瘤菌組合處理后，在各個(gè)不同根瘤菌組合處理下的苜蓿幼苗地下干重高低差異明顯，但大多數(shù)處理地下部分干重差異不大。在鹽濃度為0條件下，QL31B菌種處理下的幼苗地下干重與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，增長(zhǎng)了46.2%，Da99、Ga66、Wa32、DL58菌種處理下的幼苗地下干重與對(duì)照相比差異不顯著；在0.4%鹽濃度下，QL31B菌種處理下的幼苗地下干重與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，增長(zhǎng)了35.1%，Da99、Ga66、Wa32、DL58菌種處理下的幼苗地下干重與對(duì)照相比差異不顯著；在0.8%鹽濃度下，QL31B、DL58菌種處理下的幼苗地上干重與對(duì)照相比差異比較顯著，增長(zhǎng)了15.8%、11.2%；在1.2%鹽濃度下，Da99、Ga66、Wa32、DL58、QL31B菌種處理下的幼苗株高與對(duì)照相比差異不顯著(圖4)。

圖2 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌對(duì)苜蓿幼苗根長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of different rhizobia strains on root length of alfalfa seedling under different NaCl concentrations

圖3 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌對(duì)苜蓿幼苗地上部分干重的影響Fig.3 Effects of different rhizobia strains on above-ground dry weight of alfalfa seedling under different NaCl concentrations

圖4 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌對(duì)苜蓿幼苗地下部分干重的影響Fig.4 Effects of different rhizobia strains on underground dry weight of alfalfa seedling under different NaCl concentrations

2.5 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌株接菌對(duì)苜蓿幼苗結(jié)瘤數(shù)的影響

同一菌種處理下，隨著鹽濃度增大，苜蓿幼苗單株結(jié)瘤數(shù)基本呈降低趨勢(shì)。在同一鹽濃度下，各個(gè)不同根瘤菌組合處理下的苜蓿幼苗結(jié)瘤數(shù)較對(duì)照看，處理結(jié)瘤數(shù)有所增加。在鹽濃度為0條件下，Da99、Ga66、QL31B菌種處理下的幼苗單株結(jié)瘤數(shù)與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，分別增長(zhǎng)了36.6%、44.6%、53.5%，Wa32、DL58菌種處理下的幼苗單株結(jié)瘤數(shù)與對(duì)照相比差異較顯著；在0.4%鹽濃度下，Ga66、QL31B菌種處理下的幼苗單株結(jié)瘤數(shù)與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，分別增長(zhǎng)了36.7%、52.9%，Da99、Wa32、DL58菌種處理下的幼苗單株結(jié)瘤數(shù)與對(duì)照相比差異較顯著；在0.8%鹽濃度下，Da99、Ga66、QL31B菌種處理下的幼苗單株結(jié)瘤數(shù)與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，分別增長(zhǎng)了57.5%、63%、65.8%；在1.2%鹽濃度下，Da99、DL58、QL31B菌種處理下的幼苗單株結(jié)瘤數(shù)與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，分別增長(zhǎng)了69.8%、69.8%、81.2%，Ga66、Wa32菌種處理下的幼苗單株結(jié)瘤數(shù)與對(duì)照相比差異顯著(圖5)。

2.6 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌株接菌對(duì)苜蓿幼苗丙二醛含量的影響

從圖6可以看出，在各個(gè)不同根瘤菌組合處理下，大部分處理苜蓿幼苗丙二醛含量較對(duì)照變化不大。在鹽濃度為0條件下，Da99、Wa32菌種處理下的幼苗丙二醛含量與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，分別增長(zhǎng)了20.8%、13.4%，DL58與對(duì)照相比丙二醛含量，下降14.6%；在0.4%鹽濃度下，Da99、Wa32、DL58菌種處理下的幼苗丙二醛含量與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，分別下降9.2%、17.7%、16.1%；在0.8%鹽濃度下，Da99、Ga66、Wa32、DL58、QL31B菌種處理下的幼苗丙二醛含量與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，分別下降18.5%、14.1%、17.5%、20.5%、5.4%；在1.2%鹽濃度下，Da99、DL58菌種處理下的幼苗丙二醛含量與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，分別增長(zhǎng)了11.3%和5.7%。

圖5 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌對(duì)苜蓿幼苗結(jié)瘤數(shù)的影響Fig.5 Effects of different rhizobia strains on nodule numbers of alfalfa seedling under different NaCl concentrations

圖6 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌對(duì)苜蓿幼苗丙二醛含量的影響Fig.6 Effects of different rhizobia strains on MDA content of alfalfa seedling under different NaCl concentrations

2.7 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌株接菌對(duì)苜蓿幼苗可溶性糖含量的影響

從圖7可以看出，在各個(gè)不同組合處理下，大部分苜蓿幼苗可溶性糖含量較對(duì)照變化幅度大。在鹽濃度為0條件下， Da99、Wa32菌種處理下的幼苗可溶性糖含量與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，分別增長(zhǎng)了38%、46.1%，DL58、QL31B與對(duì)照相比可溶性糖含量有所下降，分別下降29.5%、33.8%；在0.4%鹽濃度下，Da99、Ga66、Wa32菌種處理下的幼苗可溶性糖含量與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，分別增長(zhǎng)了18.3%、59.2%、43.9%，DL58、QL31B與對(duì)照相比可溶性糖含量有所下降，分別下降31.3%、30.2%；在0.8%鹽濃度下，Ga66菌種處理下的幼苗可溶性糖含量與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，增長(zhǎng)了57.5% ，Da99、Wa32、DL58、QL31B與對(duì)照相比可溶性糖含量有所下降，分別下降45.3%、20.4%、12.8%、24.5%；在1.2%鹽濃度下，Da99、Wa32、DL58、QL31B菌種處理下的幼苗可溶性糖含量與對(duì)照相比有所下降(P<0.05)，分別下降43%、40.4%、27.5%、36.8%。

2.8 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌株接菌對(duì)苜蓿幼苗可溶性蛋白含量的影響

從圖8可以看出，在各個(gè)不同組合處理下，大部分處理苜蓿幼苗可溶性蛋白含量較對(duì)照變化不大。在鹽濃度為0條件下，Wa32、DL58、QL31B菌種處理下的幼苗可溶性蛋白含量與對(duì)照相比差異不顯著，Da99、Ga66與對(duì)照相比可溶性蛋白含量有所下降；在0.4%鹽濃度下Ga66、Wa32、DL58、QL31B菌種處理下的幼苗可溶性蛋白含量與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，分別增長(zhǎng)了8.5%、9.7%、7.5%、10.2%，Da99菌種處理下的幼苗可溶性蛋白含量與對(duì)照差異不顯著；在0.8%鹽濃度下，Da99、Ga66、Wa32、DL58、QL31B菌種處理下的幼苗可溶性蛋白含量與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，分別增長(zhǎng)了33.8%、36.6%、37.1%、15.8%、37.9%；在1.2%鹽濃度下，Da99、Ga66、Wa32、DL58、QL31B菌種處理下的幼苗可溶性蛋白含量與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，分別增長(zhǎng)了29.1%、30.2%、27.1%、31.1%、33.1%。

圖7 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌對(duì)苜蓿幼苗可溶性糖含量的影響Fig.7 Effects of different rhizobia strains on soluble sugar content of alfalfa seedling under different NaCl concentration

圖8 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌對(duì)苜蓿幼苗可溶性蛋白含量的影響Fig.8 Effects of different rhizobia strains on soluble protein content of alfalfa seedling under different NaCl concentrations

2.9 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌株接菌對(duì)苜蓿幼苗脯氨酸含量的影響

從圖9可以看出，在鹽濃度為0條件下，Da99、Ga66、Wa32、DL58、QL31B菌種處理下的幼苗脯氨酸含量與對(duì)照差異顯著(P<0.05)，分別增長(zhǎng)了50%、28.1%、23.9%、4.7%、15.7%；在0.4%鹽濃度下Da99、Ga66、Wa32、QL31B菌種處理下的幼苗脯氨酸含量與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，分別增長(zhǎng)了41.2%、58.6%、8.7%、26.2%；在0.8%鹽濃度下，Da99、Ga66、Wa32、DL58、QL31B菌種處理下的幼苗脯氨酸含量與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，分別增長(zhǎng)了35.1%、43%、37.5%、29.6%、15.8%；在1.2%鹽濃度下，Da99、Ga66、Wa32、DL58、QL31B菌種處理下的幼苗脯氨酸含量與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，分別增長(zhǎng)了66.2%、37.5%、40.1%、15.3%、23%。

2.10 鹽脅迫下不同菌株對(duì)苜蓿生長(zhǎng)及生理特性影響的隸屬函數(shù)綜合分析

由表1可以看出，同一菌株在不同鹽濃度處理下，所有菌株平均隸屬函數(shù)值大于對(duì)照，尤其是菌株QL31B，隸屬函數(shù)值較對(duì)照提高了68.76%，其次為菌株Ga66，較對(duì)照提高了63.93%。在同一含鹽量水平下，所有菌株均不同程度提高了苜蓿的生長(zhǎng)及生理特性，尤其是在鹽濃度為 0.8% 及1.2% 時(shí)所有菌株都能明顯促進(jìn)苜蓿的生長(zhǎng)及耐鹽性的提高。

圖9 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌對(duì)苜蓿幼苗脯氨酸含量的影響Fig.9 Effects of different rhizobia strains on Pro content of alfalfa seedling under different NaCl concentration

菌株Strains不同鹽濃度 Different salt concentration00.4%0.8%1.2%隸屬度值Subordinate valuesDa990.5270.4190.5740.3670.472Ga660.3350.6300.8150.7060.621Wa320.4390.5370.5230.4460.486DL580.4360.4840.4630.5020.471QL31B0.7340.6830.7040.7490.717CK0.3330.1670.1270.2690.224隸屬度值Subordinate values0.4670.4870.5340.507

3 討 論

3.1 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌株接菌對(duì)其幼苗形態(tài)特征的影響

有研究表明，接種處理苜蓿幼苗的生長(zhǎng)速度接近全氮處理，而且在荒漠和干旱、貧瘠的土地上人工接種根瘤菌可有效地提高幼苗成活率和生長(zhǎng)速度[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下不同苜蓿根瘤菌株接菌對(duì)苜蓿的株高、根長(zhǎng)、地上生物量、地下生物量以及單株結(jié)瘤數(shù)等指標(biāo)都產(chǎn)生了一定的影響，較對(duì)照都有明顯的提高，且不同菌株對(duì)苜蓿形態(tài)指標(biāo)的影響差異顯著。這說(shuō)明苜蓿形態(tài)特征的變化能初步反映出脅迫環(huán)境下根瘤菌對(duì)其生長(zhǎng)特性的影響，也就是說(shuō)根瘤菌接菌能降低脅迫環(huán)境對(duì)宿主植物造成的傷害，豆科-根瘤菌共生體系在非生物脅迫環(huán)境下，根瘤菌可以通過(guò)固氮，提供給豆科植物細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)發(fā)育所需要的氮素營(yíng)養(yǎng)[15]，因而有效地促進(jìn)豆科植物生長(zhǎng)發(fā)育。研究亦發(fā)現(xiàn)植株根瘤差別較大，有的植株根瘤數(shù)目很多，但根瘤比較小。Abdel Wahab A M等[16]研究表明，高鹽濃度(120mmol NaCl)對(duì)根瘤菌數(shù)量影響較大，而較低水平的鹽度對(duì)根瘤菌數(shù)量影響不大，這與本研究結(jié)果一致。

3.2 不同鹽濃度下不同苜蓿根瘤菌株接菌對(duì)苜蓿幼苗生理特性的影響

可溶性糖是一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在逆境脅迫下，植物可溶性糖含量積累增加，表明其抗性增強(qiáng)[17]。丙二醛是脂質(zhì)過(guò)氧化作用的產(chǎn)物，含量越高，表明植物抗性越低[17]。在正常情況下，植物體內(nèi)脯氨酸含量很低，在鹽脅迫等逆境條件下，脯氨酸含量增加，表明其抗性增強(qiáng)[18]。植物體內(nèi)蛋白質(zhì)含量與鹽濃度呈正相關(guān)，非生物脅迫環(huán)境可以引發(fā)許多植物的生理生化變化[19]。豆科植物接種根瘤菌后，改善植物生長(zhǎng)狀況的同時(shí)，還能增強(qiáng)植株的抗逆性。根瘤菌通過(guò)影響苜蓿植株的內(nèi)在變化來(lái)影響苜蓿植株對(duì)鹽脅迫的抗性[14]。根瘤菌對(duì)豆科植物在非生物脅迫下的生理反應(yīng)確有積極作用。本研究發(fā)現(xiàn)甘農(nóng)9號(hào)苜蓿接種根瘤菌后，在未進(jìn)行脅迫處理下，通過(guò)固氮作用促進(jìn)其生長(zhǎng)，接菌且鹽脅迫環(huán)境下，根瘤菌-苜蓿共生系統(tǒng)協(xié)同作用，通過(guò)對(duì)植物自身生長(zhǎng)特性及生理應(yīng)答機(jī)制的調(diào)控來(lái)達(dá)到降低脅迫的危害。在同一鹽濃度下，接種根瘤菌的甘農(nóng)9號(hào)苜蓿其可溶性糖、脯氨酸含量相比對(duì)照有所增加，而丙二醛含量較之對(duì)照基本都減少，可溶性蛋白含量與對(duì)照相比基本處于一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)，說(shuō)明接種根瘤菌的苜蓿能更好地維持細(xì)胞的穩(wěn)定性，減少脂質(zhì)過(guò)氧化作用對(duì)細(xì)胞膜的損害，提高苜蓿的抗鹽性，這與楊培志[20]的研究結(jié)果一致。苜蓿接種根瘤菌后被激活，具有較強(qiáng)的抗氧化和滲透調(diào)節(jié)能力[21-22]，因而其耐鹽能力提高，而且不同菌株調(diào)節(jié)植株生理變化的能力不同，這與菌株本身及苜蓿接種根瘤菌后形成的共生體耐鹽性可能發(fā)生變化有關(guān)。

3.3 鹽脅迫下不同根瘤菌株對(duì)甘農(nóng)9號(hào)苜蓿生長(zhǎng)及生理特性影響的綜合評(píng)價(jià)

逆境脅迫下，植物的不同性狀發(fā)生不同程度的變化，憑借單一的指標(biāo)有時(shí)很難準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)植物整體抗逆性。將模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)評(píng)判法應(yīng)用到植物抗脅迫能力的綜合評(píng)價(jià)中，可以準(zhǔn)確地反映植物的抗逆性特征[23]。本研究經(jīng)隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，在未進(jìn)行脅迫處理下，所有根瘤菌并不能使同一品種甘農(nóng)9號(hào)苜蓿獲得同樣的接種效果，這說(shuō)明不同根瘤菌由于本身遺傳背景的不同，導(dǎo)致其與苜蓿匹配效果差異顯著。但是在脅迫環(huán)境下，所有接菌后的苜蓿相比對(duì)照(未接菌)而言都具有較高的隸屬度值，說(shuō)明苜蓿接菌對(duì)促進(jìn)其生長(zhǎng)及抗性有很強(qiáng)的作用。尤其要提到的是QL31B菌株，和其它菌株相比，在任何鹽濃度脅迫下均能明顯地促進(jìn)其生長(zhǎng)及提高苜蓿的抗鹽性，且隨著鹽濃度的增大，其作用效果越明顯，這可能與該菌株本身具有優(yōu)良的促生及抗性基因有關(guān)，而且也可以說(shuō)明該菌株的共生基因與宿主植物有較高的相關(guān)性。這些研究結(jié)果表明對(duì)苜蓿接種根瘤菌是十分必要的，尤其在貧瘠、干旱及鹽堿化區(qū)域種植紫花苜蓿并接種根瘤菌意義重大。這為下一步對(duì)該菌株與甘農(nóng)9號(hào)苜蓿共生關(guān)系的進(jìn)一步深入研究奠定了基礎(chǔ)。

4 小 結(jié)

1)根瘤菌接菌對(duì)甘農(nóng)9號(hào)苜蓿生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，但是不同菌株對(duì)同一苜蓿品種促生效果明顯不同。

2)鹽脅迫下，所有菌株均能通過(guò)對(duì)苜蓿形態(tài)及生理特性的調(diào)控來(lái)提高苜蓿的抗鹽性，但是不同菌株提高苜蓿耐鹽程度不一。在不同鹽濃度下，所有菌株對(duì)苜?？果}性影響的能力為QL31B>Ga66>Wa32>Da99>DL58。

3)大部分菌株在低鹽水平(0、0.4%)對(duì)苜蓿促生效果及耐鹽性提高程度不及高鹽水平(0.8%和1.2%)，5個(gè)菌株(Ga66、Da99、Wa32、DL58及QL31B)在0.8%鹽水平下對(duì)苜蓿生長(zhǎng)及耐鹽性都有很好的作用。經(jīng)過(guò)綜合評(píng)價(jià)，所有菌株中QL31B與苜蓿匹配效果最佳，其次為Ga66。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊青川，韓建國(guó)．RAPD技術(shù)在苜蓿耐鹽遺傳育種中的應(yīng)用[J]．草地學(xué)報(bào)，2003，11(1)：27-32．

[2] 陳利云. 鹽漬地紫花苜蓿根瘤菌研究[D]. 蘭州：蘭州大學(xué)，2009.

[3] 陳文新，汪恩濤，陳文峰．根瘤菌-豆科植物共生多樣性與地理環(huán)境的關(guān)系[J]．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37(1)：81-86.

[4] 竇新田，程恒昌，李樹(shù)藩，等. 大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicuum)在黑龍江省接種效果與接種有效性的研究[J]．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1989，22(5)：62-70.

[5] 馬曉彤.苜蓿根瘤菌與苜蓿品種共生匹配優(yōu)良組合篩選的研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2009.

[6] Han L L，Wang E T，Han T X. Unique community structure and biogeography of soybean rhizobia in the saline-alkaline soils of Xinjiang, China [J]. Plant Soil，2009，324(1): 291-305.

[7] Moran J, Fbecana M, Iturbe-Ormaetxel, et al. Drought induces oxidative stress in pea plants [J]. Planta，1994，194 ( 3 ) : 346-352.

[8] Sprent J I. Effects of water stress on nitrogen fixation in root nodules[J]. Plant and Soil，1971，35(1): 225-228.

[9] Swaraj K， Bishnoi N R. Effect of salt stress on nodulation and nitrogen fixation in legumes [J]. Indian Journal of Experimental Biology，1999，37(9)：843-848.

[10] Ashraf M，Iram A. Drought stress induced changes in some organic substances in nodules and other plant parts of two potential legumes differing in salt tolerance [J]. Flora，2005，200(6)：535-546.

[11] Clement M，Lambert A，Herouart D，et al. Identification of new up-regulated genes under drought stress in soybean nodules[ J]. Gene，2008，426 ( 1-2 ) ：15-22.

[12] 韓 梅，王 卓，韓曉日.1株高效花生根瘤菌的篩選與鑒定[J]．微生物學(xué)雜志，2013，33(1)：44-47.

[13] 王學(xué)奎.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2006.

[14] 王 華.沙冬青與根瘤菌和叢枝菌根真菌共生關(guān)系影響因素的研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2008.

[15] Sprent J I. The effects of water stress on nitrogen-fixing root nodules[J]. New Phytologist，1972，70(3): 9-17.

[16] Abdel Wabab A M，Shabcb M S A，Younis M A M. Studies on the effect of salinity，drought stress and soil type on nodule activities ofLablabpurpurcus(L.) sweet(Kasbrangeeg)[J]．Journal of Arid Environments，2002，5l(4)：587-602.

[17] 王智明，張峰舉，許 興. 植物耐鹽生理生化指標(biāo)研究進(jìn)展[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53(7):1493-1496.

[18] 陳愛(ài)萍，王玉祥，張 博. NaCl脅迫對(duì)6個(gè)苜蓿品種的部分生理指標(biāo)的影響[J]. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，34(5)：403-406.

[19] 劉晶，才華，劉瑩，等. 兩種紫花苜蓿苗期耐鹽生理特性的初步研究及其耐鹽性比較[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22(2)：250-256.

[20] 楊培志. 紫花苜蓿根瘤菌共生對(duì)干旱及鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

[21] 王衛(wèi)棟，楊培志，張 攀，等．共生根瘤菌對(duì) NaCl 脅迫下紫花苜?？寡趸蜐B透調(diào)節(jié)能力的影響[J]．草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22(5)：120-127.

[22] 王雪翠，馬曉彤，韓 梅，等.青海箭筈豌豆根瘤菌的篩選及其共生體耐鹽性研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2016，25(8)：145-153.

[23] 謝賢健，蘭代萍，白景文. 三種野生巖生草本植物的抗旱性綜合評(píng)價(jià)[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18(4)：75-80.