新型膠原膜的研制及降解性能初探

鈕春子 程浩德 李宇 李德華

引導(dǎo)骨再生 (GBR)，是種植醫(yī)學(xué)上用以增加缺牙區(qū)骨量的重要技術(shù)，是口腔種植醫(yī)學(xué)發(fā)展過(guò)程中的里程碑。其成功的關(guān)鍵在于利用屏障膜隔絕外部的上皮和結(jié)締組織，穩(wěn)定血凝塊，促進(jìn)血管再生和成骨細(xì)胞的增殖，實(shí)現(xiàn)骨再生［1－2］。膠原膜作為一種可生物降解的屏障膜，因其良好的生物相容性、促進(jìn)止血和傷口愈合，在臨床上應(yīng)用廣泛［3－4］。不同的膠原原料種類、提取方法、加工成膜技術(shù)以及是否使用人工交聯(lián)等，都會(huì)影響膠原膜的性能［5－6］。人工交聯(lián)可以提高膠原膜的酶穩(wěn)定性，增強(qiáng)膜的機(jī)械強(qiáng)度，但殘留的交聯(lián)劑通常具有細(xì)胞毒性，抑制組織愈合和血管化進(jìn)程［7－8］。Bio-Gide膜是目前臨床上應(yīng)用廣泛的非交聯(lián)膠原膜，大量研究證實(shí)了其在引導(dǎo)骨再生中促進(jìn)缺損區(qū)成骨的可靠性，但其價(jià)格昂貴且降解速率偏快，有專家建議覆蓋雙層膜以增加其屏障時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)采用新的成膜技術(shù)，以牛皮來(lái)源的I型膠原為原料，利用溶劑揮發(fā)法研制一種新型膠原膜，以期延緩膠原的降解，延長(zhǎng)膠原膜的屏障時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

本實(shí)驗(yàn)使用提取自牛皮的I型膠原，由常州藥物研究所提供;Tris-鹽酸緩沖液(TBS，北京雷根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)0906A17);I型膠原酶(collagenase type I，C0130，Sigma-Aldrich，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟

1.2.1 I型膠原膜的制備 將I型膠原溶于稀鹽酸，形成膠原混懸液，離心除去混懸液中的小分子和氣泡。將膠原勻漿置于真空干燥箱中梯度真空干燥，形成結(jié)構(gòu)致密的I型膠原膜。包裝后環(huán)氧乙烷滅菌:溫度37℃、相對(duì)濕度40%，環(huán)氧乙烷濃度1 000 mg/L，滅菌3 h。常溫干燥環(huán)境下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 I型膠原膜的形貌觀察及特征峰檢測(cè) 將I型膠原膜的表面、橫縱界面形成自然斷面，表面噴金、鉑，掃描電子顯微鏡 (HITACHI，S-3400N，日本)觀察其表面形貌;利用能譜儀 (EDAX-GENESIS，美國(guó))分析其元素組成;采用傅里葉紅外光譜儀 (SHIMADZU，F(xiàn)TIR-8400S，日本)分析檢測(cè)膠原特征峰。

1.2.3 I型膠原膜的體外降解實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組:I型膠原膜;對(duì)照組:Bio-Gide(BG)膠原膜;每組設(shè)3個(gè)重復(fù)樣。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的膜裁剪成5 mm×5 mm方形大小，分別置于1.5 ml離心管中，加入I型膠原酶溶液(1 mg/ml的 TBS溶液，含 0.005 mol/L CaCl2·2H2O)1 ml，于37℃恒溫箱中進(jìn)行酶解反應(yīng)。分別于10、40 min后取出膜，立即用去離子水潤(rùn)洗3次，－80℃預(yù)凍24 h，－50℃真空凍干24 h。干燥后的膜表面噴金、鉑，掃描電鏡觀察膜的孔徑變化。

2 結(jié)果

2.1 I型膠原膜的形貌觀察及特征峰檢測(cè)結(jié)果

掃描電鏡示I型膠原膜表面平坦，結(jié)構(gòu)致密，無(wú)明顯孔隙;放大可見(jiàn)膠原纖維典型的串珠樣結(jié)構(gòu)，纖維與纖維間緊密排列形成較粗的纖維束，無(wú)其他雜質(zhì)結(jié)構(gòu);斷面示膠原膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)緊密，無(wú)明顯分層(圖1A～1D)。能譜分析示I型膠原膜的主要元素組成為C、O、N元素，第四處吸收峰為噴金、鉑后的鉑的吸收峰，無(wú)其余雜質(zhì)成分(圖1E)。傅里葉紅外光譜分析示I型膠原膜、BG膠原膜上典型的膠原酰胺鍵吸收峰:3 400 cm－1附近(NH)、1 650 ～1 655 cm－1(C=O鍵)、1 480 ～1 600 cm－1(NH、CN)、1 200 ～1 360 cm－1(NH、CN)，紅色為BG膠原膜，藍(lán)色為I型膠原膜(圖 1F)。

2.2 I型膠原膜體外降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A～D:掃描電鏡圖(A:×100，B:×1000，C、D:×10 000);E:能譜分析圖;F:傅里葉紅外光譜分析圖圖1 I型膠原膜形貌結(jié)構(gòu)及特征峰檢測(cè)圖A－D:SEM images(A: ×100，B:×1000，C，D: ×10 000);E:The energy spectrum analysis;F:Fourier infrared spectrum analysisFig 1 The structure and characteristic peak detection of the type I collagen membrane

圖2 I型膠原膜和BG膠原膜體外膠原酶降解后的孔隙變化圖Fig 2 The pore size changes of the type I collagen membrane and BG membrane after degradation in vitro

在體外I型膠原酶的作用下，I型膠原膜和BG膠原膜均逐漸降解。降解10 min時(shí)，I型膠原膜結(jié)構(gòu)致密，未見(jiàn)明顯孔隙(圖2);BG膠原膜致密層出現(xiàn)直徑大于10μm的孔隙，且孔隙向其內(nèi)部延伸(圖2)。降解40 min時(shí)，I型膠原膜結(jié)構(gòu)仍較完整，可見(jiàn)部分直徑小于2μm的微小孔隙(圖2);而此時(shí)BG膠原膜進(jìn)一步降解，致密層的結(jié)構(gòu)明顯破壞，大的孔洞相互交通，膜的屏障作用顯著減弱(圖2)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:此I型膠原膜的孔徑變化明顯慢于BG膠原膜。

3 討論

GBR和GTR是基于成骨細(xì)胞和或牙周細(xì)胞增殖與分化的再生技術(shù)，利用屏障膜阻隔快速增殖的上皮和結(jié)締組織，為缺損區(qū)的成骨細(xì)胞或牙周組織提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的再生環(huán)境。通常認(rèn)為在GTR中需要4周才能實(shí)現(xiàn)牙周再生［3，9］;而成骨細(xì)胞需要4－6個(gè)月才能形成較成熟的新骨［10－11］。因此屏障膜應(yīng)在上述時(shí)間內(nèi)保持一定的完整性，才能真正發(fā)揮其屏障作用［12］。目前通常通過(guò)測(cè)量降解過(guò)程中膜的厚度、面積或質(zhì)量的變化，來(lái)評(píng)價(jià)膜的降解程度［12－16］。膜剩余量的測(cè)量直觀、方便，但其并不能直接反應(yīng)膜的屏障作用。屏障膜作用的本質(zhì)應(yīng)體現(xiàn)在其在缺損區(qū)成骨過(guò)程中發(fā)揮的阻攔作用，成纖維細(xì)胞的直徑約為10～15 μm，若在降解過(guò)程中若形成足夠大的、貫穿全層的孔洞，則剩余的膠原膜亦無(wú)法發(fā)揮完整的屏障作用。

傳統(tǒng)的凍干法制備的膠原膜具有較高的吸水膨脹率，且酶穩(wěn)定性較差。本實(shí)驗(yàn)采用溶劑揮發(fā)法制備的I型膠原膜，結(jié)構(gòu)致密。以I型膠原酶作為體外降解酶檢測(cè)此膠原膜的酶穩(wěn)定性［12，17－18］。降解 10 min 時(shí) I型膠原膜表面未見(jiàn)明顯孔隙，而B(niǎo)G膜的致密層已經(jīng)出現(xiàn)大量直徑大于10μm的孔隙;進(jìn)行到40 min時(shí)，I型膠原膜表面出現(xiàn)少量直徑小于2μm的微小孔隙，而此時(shí)BG膜的致密層可見(jiàn)大的孔洞相互交通向膜的內(nèi)部延伸。BG膜的結(jié)構(gòu)相對(duì)疏松，纖維束之間存在一定空隙，這使得膠原酶在破壞其表面的同時(shí)易于向其深層滲透，表層和深層均受到破壞，屏障作用大大減弱。因此盡管BG膜仍有大量剩余，但相互貫通的孔洞和塌陷的纖維可能已經(jīng)無(wú)法阻止成纖維細(xì)胞的侵入。而I型膠原膜以其均勻的致密結(jié)構(gòu)延緩了膠原酶的降解和滲透，在觀察時(shí)間內(nèi)仍保持完整的屏障作用。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示此I型膠原膜的屏障作用明顯強(qiáng)于BG膜。值得注意的是，體外降解實(shí)驗(yàn)存在一定局限性，無(wú)法完全模擬在體環(huán)境，仍需后續(xù)進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)此I型膠原膜的屏障作用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)溶劑揮發(fā)法制備結(jié)構(gòu)致密的I型膠原膜，在體外膠原酶降解過(guò)程中呈較強(qiáng)的酶穩(wěn)定性，屏障作用明顯增強(qiáng)，為膠原膜的研究提供一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ Tal H，Pitaru S，Moses O，et al.Collagen gel and membrane in guided tissue regeneration in periodontal fenestration defects in dogs［J］.J Clin Periodontol，1996，23(1):1－6.

［2］ Melcher AH.On the repair potential of periodontal tissues［J］.JPeriodontol，1976，47(5):256 －260.

［3］ Bunyaratavej P，Wang HL.Collagen membranes:A review［J］.J Periodontol，2001，72(2):215 －229.

［4］ 曹良菊，唐玲，王汝麗.Bio-Oss和膠原膜治療牙周炎重度垂直骨吸收的臨床觀察［J］.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008，24(6):867－870.

［5］ Sheikh Z，Qureshi J，Alshahrani AM，et al.Collagen based barrier membranes for periodontal guided bone regeneration applications［J］.Odontology，2017，105(1):1 －12.

［6］ Patino MG，Neiders ME，Andreana S，et al.Collagen as an implantable material in medicine and dentistry［J］.J Oral Implantol，2002，28(5):220 －225.

［7］ Schwarz F，Rothamel D，Herten M，et al.Angiogenesis pattern of native and cross-linked collagen membranes:An immunohistochemical study in the rat［J］.Clin Oral Implants Res.2006，17(4):403 －409.

［8］ Rothamel D，Schwarz F，Sager M，et al.Biodegradation of differently cross-linked collagen membranes:An experimental study in the rat［J］.Clin Oral Implants Res，2005，16(3):369－378.

［9］ Becker W，Becker BE，Berg L，et al.New attachment after treatment with root isolation procedures:Report for treated Class III and Class II furcations and vertical osseous defects［J］.Int JPeriodontics Restorative Dent，1988，8(3):8 －23.

［10］ McAllister BS，Haghighat K.Bone augmentation techniques［J］.JPeriodontol，2007，78(3):377 －396.

［11］ Hutmacher DW，Kirsch A，Ackermann KL，et al.A tissue engineered cell-occlusive device for hard tissue regeneration——A preliminary report［J］.Int JPeriodontics Restorative Dent，2001，21(1):49 －59.

［12］ Bozkurt A，Apel C，Sellhaus B，et al.Differences in degradation behavior of two non-cross-linked collagen barrier membranes:An in vitro and in vivo study［J］.Clin Oral Implants Res，2014，25(12):1403 －1411.

［13］ Rothamel D，Schwarz F，F(xiàn)ienitz T，et al.Biocompatibility and biodegradation of a native porcine pericardium membrane:Results of in vitro and in vivo examinations［J］.Int J Oral Maxillofac Implants，2012，27(1):146－154.

［14］ Kozlovsky A，Aboodi G，Moses O，et al.Bio-degradation of a resorbable collagen membrane(Bio-Gide)applied in a double-layer technique in rats［J］.Clin Oral Implants Res，2009，20(10):1116－1123.

［15］ Moses O，Vitrial D，Aboodi G，et al.Biodegradation of three different collagen membranes in the rat calvarium:A comparative study［J］.JPeriodontol，2008，79(5):905 －911.

［16］ 王新木，董研，張存寶，等.幾丁糖膠原可吸收膜的體內(nèi)埋植及降解實(shí)驗(yàn)研究［J］.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，26(3):298－301.

［17］ Niu LN，Jiao K，Qi YP，et al.Intrafibrillar silicification of collagen scaffolds for sustained release of stem cell homing chemokine in hard tissue regeneration［J］.FASEB J，2012，26(11):4517－4529.

［18］ Song JH，Kim HE，Kim HW.Collagen-apatite nanocomposite membranes for guided bone regeneration［J］.J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2007，83(1):248 －257.