響應面法優(yōu)化樟芝胞外多糖的發(fā)酵條件

王正齊,張薄博,陳 磊,*,關 鋒,2,*

(1.江南大學生物工程學院,糖化學與生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122; 2.西北大學生命科學學院,陜西西安 710069)

樟芝(Antrodiacinnamomea,A.cinnamomea)又名牛樟芝、牛樟菇等,是臺灣特有的珍稀藥食兩用真菌,隸屬于擔子菌門、擔子菌亞門、同擔子菌綱、無摺菌目、多孔菌科、薄孔菌屬[1],素有“神芝”、“森林中的紅寶石”之稱。樟芝主要生長于幽暗、潮濕且溫度稍低的海拔450～2000 m的臺灣東海岸山脈闊葉林地區(qū),適宜于中性偏酸的環(huán)境。近年來,隨著越來越多的人關注真菌多糖,作為一種藥食兩用真菌的活性產(chǎn)物,樟芝胞外多糖也受到了青睞[2]。研究表明樟芝胞外多糖具有抗炎癥[3-5]、抗腫瘤[6-7]、抗氧化[8]等多種作用。然而由于樟芝的生長對環(huán)境要求苛刻,因此樟芝多糖的來源及產(chǎn)量成為限制其開發(fā)的重要因素。

目前樟芝的人工培育方式主要有三種:段木栽培法、液態(tài)發(fā)酵法以及固態(tài)發(fā)酵法。相比而言,液態(tài)發(fā)酵法具有周期短且易于工廠放大培養(yǎng)的優(yōu)點,適合大規(guī)模生產(chǎn)[2]。但在實際發(fā)酵過程中,培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成及發(fā)酵條件都會影響到胞外多糖產(chǎn)量。已有研究發(fā)現(xiàn)麥芽糖和葡萄糖是適宜的碳源,在4%的麥芽糖和4%的葡萄糖培養(yǎng)10 d的發(fā)酵液中胞外多糖產(chǎn)量達到最大[9],且當碳氮比為40∶1時既有利于菌絲生長又能提高胞外多糖產(chǎn)量[10]。pH對樟芝生長及其多糖的產(chǎn)生都有重要影響,研究表明樟芝細胞生長的最適pH為4.0,而合成胞外多糖的最適pH為5.0[11]。Lin等優(yōu)化出樟芝液態(tài)發(fā)酵合成胞外多糖的最適條件為28 ℃,培養(yǎng)14 d,5%(w/v)葡萄糖,0.5% Ca(NO3)2,0.1% FeSO4和0.1%煙酸能使多糖產(chǎn)量達到最大(0.49 g/L)[12]。本文在前期的研究基礎上首先對碳氮源進行篩選,然后應用響應面法(Response Surface Methodology,RSM)優(yōu)化了樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的條件,在提高產(chǎn)量的同時合理的解決了培養(yǎng)基本身所含大分子物質(zhì)對后期樟芝自身合成多糖的分離純化所造成的干擾這一問題,為樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的工業(yè)生產(chǎn)提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樟芝 上海福茂食用菌有限公司;葡萄糖標品 美國Sigma公司;酵母浸粉 安琪酵母股份有限公司;其他試劑 國藥集團化學試劑有限公司。

電熱恒溫水浴鍋 廣州越秀醫(yī)療器械廠;電熱恒溫培養(yǎng)箱 連云港醫(yī)療器械設備廠;高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;全溫搖床柜 太倉市實驗設備廠;電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;電熱鼓風干燥箱 上海博訊醫(yī)療設備廠;超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限公司;超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基條件 樟芝接種于加富PDA斜面,28 ℃避光培養(yǎng)7 d,4 ℃保藏。

孢子懸浮液制備:利用無菌水將加富PDA斜面表層的孢子洗下,玻璃珠打散后鏡檢,使孢子數(shù)達到1×106個/mL。

液態(tài)種子培養(yǎng)基:葡萄糖50 g/L,酵母浸粉10 g/L,MgSO4·7H2O 1.0 g/L,K2HPO40.5 g/L,檸檬酸0.5 g/L,pH自然。裝液量120 mL/500 mL三角瓶,接種量10 mL,28 ℃,3 d,130 r/min。

1.2.2 單因素實驗設計

1.2.2.1 主要營養(yǎng)物質(zhì)對樟芝液態(tài)發(fā)酵合成胞外多糖的影響 a.氮源種類及添加量:控制樟芝液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖50 g/L,維生素B10.5 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,分別加入10 g/L的蛋白胨、酵母浸粉、玉米漿粉、牛肉浸膏、大豆水解液、硫酸銨、檸檬酸銨、酒石酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀和硝酸鈣作為氮源,初始pH自然。裝液量100 mL/500 mL,接種量10%,28 ℃,130 r/min培養(yǎng)10 d,篩選出最適宜樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的氮源后,并對其添加量進行優(yōu)化,添加量設定為5、10、15、20和25 g/L,每組重復三次。

b.碳源種類及添加量:控制樟芝液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母浸粉15 g/L,維生素B10.5 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,分別加入50 g/L的葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖作為碳源,初始pH自然。裝液量100 mL/500 mL,接種量10%,28 ℃,130 r/min培養(yǎng)10 d,篩選出最適宜樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的碳源后,并對其添加量進行優(yōu)化,添加量設定為30、40、50、60和70 g/L,每組重復三次。

c.KH2PO4添加量：控制樟芝液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖50 g/L,酵母浸粉15 g/L,維生素B10.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,KH2PO4添加量設定為0.2、0.5、0.8、1.1和1.4 g/L,初始pH自然。裝液量100 mL/500 mL,接種量10%,28 ℃,130 r/min培養(yǎng)10 d,測定樟芝液態(tài)發(fā)酵生物量和胞外多糖產(chǎn)量,每組重復三次。

d.MgSO4·7H2O添加量:控制樟芝液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖50 g/L,酵母浸粉15 g/L,維生素B10.5 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O添加量設定為0.2、0.5、0.8、1.1和1.4 g/L,初始pH自然。裝液量100 mL/500 mL,接種量10%,28 ℃,130 r/min培養(yǎng)10 d,測定樟芝液態(tài)發(fā)酵生物量和胞外多糖產(chǎn)量,每組重復三次。

1.2.2.2 發(fā)酵條件對樟芝液態(tài)發(fā)酵合成胞外多糖的影響 a.接種量:控制樟芝液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖50 g/L,酵母浸粉15 g/L,維生素B10.5 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,初始pH自然。裝液量100 mL/500 mL,接種量設定為5%、10%、15%、20%、25%,28 ℃,130 r/min培養(yǎng)10 d,測定樟芝液態(tài)發(fā)酵生物量和胞外多糖產(chǎn)量,每組重復三次。

b.初始pH:控制樟芝液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖50 g/L,酵母浸粉15 g/L,維生素B10.5 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,初始pH設定為3、4、5、6、7、8。裝液量100 mL/500 mL,接種量10%,28 ℃,130 r/min培養(yǎng)10 d,測定樟芝液態(tài)發(fā)酵生物量和胞外多糖產(chǎn)量,每組重復三次。

c.培養(yǎng)溫度:控制樟芝液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖50 g/L,酵母浸粉15 g/L,維生素B10.5 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,初始pH自然。裝液量100 mL/500 mL,接種量10%,培養(yǎng)溫度設定為22、25、28、31、34 ℃,130 r/min培養(yǎng)10 d,測定樟芝液態(tài)發(fā)酵生物量和胞外多糖產(chǎn)量,每組重復三次。

d.搖床轉速:控制樟芝液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖50 g/L,酵母浸粉15 g/L,維生素B10.5 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,初始pH自然。裝液量100 mL/500 mL,接種量10%,28 ℃,搖床轉速設定為70、100、130、160、190 r/min培養(yǎng)10 d,測定樟芝液態(tài)發(fā)酵生物量和胞外多糖產(chǎn)量,每組重復三次。

e.裝液量:控制樟芝液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖50 g/L,酵母浸粉15 g/L,維生素B10.5 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,初始pH自然。裝液量設定為50、100、150、200、250 mL/500 mL,接種量10%,28 ℃,搖床轉速設定為130 r/min培養(yǎng)10 d,測定樟芝液態(tài)發(fā)酵生物量和胞外多糖產(chǎn)量,每組重復三次。

1.2.3 Plackett-Burman實驗設計 本實驗中使用Design-Expert 8.0軟件,設計了包含10個待篩選因素的12組Plackett-Burman實驗。根據(jù)單因素實驗的結果,每個待篩選因素設定一個高水平(+1)和低水平(-1),同時結合Plackett-Burman實驗中因子水平越接近最優(yōu)值越有代表性[13]及某些因素高低水平的差值不能過大,以防掩蓋其他因素重要性的原則[14]。具體Plackett-Burman實驗水平設計如表1所示(每組實驗均重復三次)。

表1 Plackett-Burman實驗因素和水平編碼表Table 1 Plackett-Burman experiment factors and coded value of variance

1.2.4 Box-Behnken實驗設計 根據(jù)Plackett-Burman實驗的結果,選擇發(fā)酵液的初始pH、KH2PO4添加量、溫度和MgSO4·7H2O添加量為自變量,胞外多糖產(chǎn)量為響應值,對發(fā)酵條件進行Box-Behnken優(yōu)化實驗,設計因素水平見表2。每個不同變量X1,X2,X3,X4表示不同的參數(shù),其中每個參數(shù)的低、中和高水平分別為-1,0,+1,具體算法如下[15]:

表2 Box-Behnken實驗因素和水平編碼表Table 2 Box-Behnken experiment factors and coded value of variance

1.2.5 檢測與分析方法

1.2.5.1 樟芝液態(tài)發(fā)酵生物量的測定 樟芝發(fā)酵液經(jīng)紗布過濾,去離子水洗滌菌體至無色后,50 ℃烘干至恒重并稱重。

1.2.5.2 樟芝液態(tài)發(fā)酵胞外多糖的測定 取經(jīng)抽濾的樟芝發(fā)酵液濃縮后,加入3倍體積的無水乙醇,4 ℃靜置24 h,6000 r/min離心15 min,重復醇沉一次后利用苯酚-硫酸法測定多糖含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 Plackett-Burman設計響應值按照一次多項式回歸方程模型進行回歸分析[16]

Box-Behnken設計響應值按照二次多項式回歸方程模型進行回歸分析[16]

式中：Y為響應預測值,xi為自變量,β0為截距,βi為線性系數(shù),βii為平方系數(shù),βij為交互作用系數(shù)[17]。方差分析采用Design-Expert 8.06和SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件進行,作圖采用Orign 9.0軟件處理。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 主要營養(yǎng)物質(zhì)對樟芝液態(tài)發(fā)酵合成胞外多糖的影響

2.1.1.1 氮源種類及添加量對樟芝液態(tài)發(fā)酵合成胞外多糖的影響 由圖1可知,在不同氮源添加量統(tǒng)一在10 g/L的條件下,樟芝液態(tài)發(fā)酵生物量與胞外多糖產(chǎn)量均有較大差異。在大豆水解液、玉米漿粉、蛋白胨、牛肉浸膏和酵母浸粉等有機氮源培養(yǎng)條件下，樟芝液態(tài)發(fā)酵生物量和胞外多糖產(chǎn)量明顯高于硫酸銨和檸檬酸銨等無機氮源;而無機氮源中硫酸銨、檸檬酸銨、酒石酸銨等銨態(tài)氮中胞外多糖的產(chǎn)量明顯高于硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸鈣等硝態(tài)氮，這說明銨態(tài)氮比硝態(tài)氮更有利于促進胞外多糖的合成。據(jù)此我們可以得出氮源對樟芝液態(tài)發(fā)酵合成胞外多糖的影響效果為:有機氮>銨態(tài)氮>硝態(tài)氮。幾種有機氮源對樟芝液態(tài)發(fā)酵菌絲體生長促進作用影響不明顯,其中玉米漿粉對樟芝液態(tài)發(fā)酵菌絲體生長的效果最好,菌體量可以達到9.53 g/L。然而就樟芝液態(tài)發(fā)酵合成胞外多糖而言,酵母浸粉是最佳氮源,多糖產(chǎn)量可以達到0.72 g/L。此外,考慮到培養(yǎng)基本身所含多糖會對樟芝液態(tài)發(fā)酵合成的胞外多糖的計算造成干擾,我們對比了酵母浸粉和玉米漿粉本身多糖含量,發(fā)現(xiàn)二次醇沉后酵母浸粉不含多糖,而玉米漿粉中多糖含量為2%。綜上可得樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖培養(yǎng)基的最佳氮源為酵母浸粉。

圖1 氮源對樟芝液態(tài)發(fā)酵生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of various nitrogen sources on the biomass and production of exopolysaccharide in submerged fermentation of A. cinnamomea

確定最佳氮源后,對氮源添加量進行優(yōu)化,結果如圖2所示。由圖可知,酵母浸粉的添加量對樟芝液態(tài)發(fā)酵的生物量有一定影響,隨著酵母浸粉含量的增加,生物量先增加后趨于穩(wěn)定，而胞外多糖則呈現(xiàn)先增后減的趨勢。當酵母浸粉的含量達到20 g/L時,胞外多糖的產(chǎn)量最大達到1.00 g/L。因此,以酵母浸粉添加量20 g/L為中心點進行顯著因素篩選實驗。

圖2 酵母浸粉添加量對樟芝液態(tài)發(fā)酵 生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different concentrations of yeast extract on the biomass and production of exopolysaccharide in submerged fermentation of A. cinnamomea

2.1.1.2 碳源種類及添加量對樟芝液態(tài)發(fā)酵合成胞外多糖的影響 由圖3可知,碳源的種類對樟芝液態(tài)發(fā)酵的生物量和胞外多糖產(chǎn)量均有非常明顯的影響。以葡萄糖、果糖等單糖為碳源的生物量和胞外多糖產(chǎn)量明顯高于蔗糖和乳糖等二糖,說明樟芝液態(tài)發(fā)酵對單糖的利用效率比二糖好。單糖中以葡萄糖為碳源對樟芝液態(tài)發(fā)酵的胞外多糖產(chǎn)量略高于果糖,分別為0.80和0.77 g/L。因此樟芝液態(tài)發(fā)酵最優(yōu)碳源為葡萄糖。

圖3 碳源種類對樟芝液態(tài)發(fā)酵 生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of various carbon sources on the biomass and production of exopolysaccharide in submerged fermentation of A. cinnamomea

如圖4所示,培養(yǎng)基中葡萄糖的添加量對樟芝液態(tài)發(fā)酵的生物量和胞外多糖的產(chǎn)量都有一定的影響。在30～50 g/L之間生物量和胞外多糖的產(chǎn)量隨葡萄糖添加量的增加而增加，此后生物量趨于穩(wěn)定，但胞外多糖卻表現(xiàn)出下降的趨勢。當葡萄糖含量為50 g/L時,胞外多糖的產(chǎn)量最高可達到0.90 g/L。因此選擇葡萄糖添加量50 g/L為中心點進行顯著因素篩選實驗。

圖4 葡萄糖添加量對樟芝液態(tài)發(fā)酵 生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different concentrations of glucose on the biomass and production of exopolysaccharide in submerged fermentation of A. cinnamomea

2.1.1.3 無機鹽添加量對樟芝液態(tài)發(fā)酵合成胞外多糖的影響 確定了樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的最適碳氮源之后,對KH2PO4和MgSO4·7H2O兩種無機鹽的添加量進行了優(yōu)化,結果如圖5和圖6所示。由圖可知,兩種無機鹽對樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖均有明顯影響,且趨勢一致,均先增加后減少,在添加量為0.8 g/L時,多糖產(chǎn)量最大分別為0.85和0.76 g/L。結果表明K、P、Mg等微量元素在樟芝液態(tài)發(fā)酵合成胞外多糖中起著重要作用,這與王麗星等[18]人研究結果一致。因此,在后續(xù)的顯著因素篩選實驗中KH2PO4和MgSO4·7H2O添加量均以0.8 g/L為中心點。

圖5 MgSO4·7H2O添加量對樟芝液態(tài)發(fā)酵 生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of different concentrations of MgSO4·7H2O on the biomass and production of exopolysaccharide in submerged fermentation of A. cinnamomea

圖6 KH2PO4添加量對樟芝液態(tài)發(fā)酵 生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of different concentrations of KH2PO4 on the biomass and production of exopolysaccharide in submerged fermentation of A. cinnamomea

2.1.2 發(fā)酵條件對樟芝液態(tài)發(fā)酵合成胞外多糖的影響

2.1.2.1 接種量對樟芝液態(tài)發(fā)酵合成胞外多糖的影響 由圖7可知,隨著接種量的加大,樟芝液態(tài)發(fā)酵的生物量呈現(xiàn)不斷上升的趨勢,而胞外多糖的產(chǎn)量卻先升高后下降,當接種量為15%時,胞外多糖的產(chǎn)量最高(0.93 g/L)。增大接種量可使延滯期縮短,但營養(yǎng)物質(zhì)也會被過快消耗,導致合成胞外多糖的前體物質(zhì)減少,反而會使產(chǎn)量降低;接種量過小,生長延滯期過長,提高了實驗成本。因此,選擇接種量15%為中心點進行下一步實驗。

圖7 接種量對樟芝液態(tài)發(fā)酵 生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of different inoculum concentrations on the biomass and production of exopolysaccharide in submerged fermentation of A. cinnamomea

2.1.2.2 初始pH對樟芝液態(tài)發(fā)酵合成胞外多糖的影響 由圖8可知,樟芝液態(tài)發(fā)酵的生物量和胞外多糖的產(chǎn)量隨著發(fā)酵液初始pH的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢,初始pH為自然(此時測得發(fā)酵液pH為5.37)時最利于菌絲體的生長,此時胞外多糖的產(chǎn)量也達到最大值1.00 g/L。表明樟芝液態(tài)發(fā)酵合成胞外多糖的最適pH為弱酸性環(huán)境,這與已有的結果相一致[11]?？紤]到后續(xù)試驗的可操作性，選擇初始pH=5為中心點進行下一步實驗。

圖8 初始pH對樟芝液態(tài)發(fā)酵 生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of different initial pH values on the biomass and production of exopolysaccharide in submerged fermentation of A. cinnamomea

2.1.2.3 發(fā)酵溫度對樟芝液態(tài)發(fā)酵合成胞外多糖的影響 由圖9可知,生物量和胞外多糖的產(chǎn)量隨著培養(yǎng)溫度的提高均呈現(xiàn)先升后降的趨勢,當發(fā)酵溫度為28 ℃時樟芝液態(tài)發(fā)酵生物量與胞外多糖產(chǎn)量同步達到最大值,此時胞外多糖的產(chǎn)量可以達到0.86 g/L。因此,選擇發(fā)酵溫度為28 ℃作為中心點進行下一步實驗。

圖9 溫度對樟芝液態(tài)發(fā)酵生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of different temperatures on the biomassand production of exopolysaccharide in submerged fermentation of A. cinnamomea

2.1.2.4 搖床轉速對樟芝液態(tài)發(fā)酵合成胞外多糖的影響 由圖10可知,隨著搖床轉速的增大,胞外多糖的產(chǎn)量上升,但當搖床轉速超過一定的范圍,胞外多糖的產(chǎn)量隨著搖床轉速的增大而逐漸降低。這可能是由于隨著轉速的進一步增大,菌體所受的剪切力也隨之增大,影響了菌體的正常生長進而影響胞外多糖的合成。當搖床轉速為100 r/min時最有利于胞外多糖的合成,此時產(chǎn)量為1.02 g/L。同時測量不同轉速下菌球的直徑發(fā)現(xiàn),在100 r/min時,菌球直徑達到最大(d=2.92 mm),并且隨著轉速的繼續(xù)增加呈現(xiàn)遞減的趨勢。而當轉速過低(70 r/min)時發(fā)現(xiàn)菌體出現(xiàn)結塊現(xiàn)象,影響了生物量和胞外多糖產(chǎn)量,導致二者產(chǎn)量急劇下降。這可能跟低轉速下溶氧不足有關,而樟芝為好氧真菌,對溶氧有一定要求[19]。因此,在顯著因素篩選實驗中直接以100 r/min作為低水平值。

圖10 轉速對樟芝液態(tài)發(fā)酵生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.10 Effect of different rotation speed on the biomass and production of exopolysaccharide in submerged fermentation of A. cinnamomea

2.1.2.5 裝液量對樟芝液態(tài)發(fā)酵合成胞外多糖的影響 由圖11可知,不同裝液量對樟芝液態(tài)發(fā)酵生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響存在一定差異,當裝液量為150 mL/500 mL時生物量達到最大值9.49 g/L;而當裝液量為100 mL/500 mL時,胞外多糖產(chǎn)量達到最大值0.80 g/L。在搖瓶實驗階段,裝液量主要通過影響發(fā)酵液中溶氧水平來影響生物量及其代謝產(chǎn)物的含量,當裝液量過低或過高時均不利于樟芝生長和合成胞外多糖。因此,選擇裝液量100 mL/500 mL作為中心點進行下一步實驗。

圖11 裝液量對樟芝液態(tài)發(fā)酵 生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.11 Effect of different capacity on the biomass and production of exopolysaccharide in submerged fermentation of A. cinnamomea

2.2 Plackett-Burman實驗設計結果及分析

根據(jù)單因素實驗結果,設計了10因素的Plackett-Burman實驗,實驗設計及實驗結果如表3所示,每組實驗的響應值取三次重復實驗的平均值。

表3 Plackett-Burman實驗設計和實驗結果 表3 Plackett-Burman design and results

通過分析結果可得最優(yōu)回歸方程為:

Y=0.8156+0.0467X1-0.0106X2-0.0861X3+0.0761X4+0.0278X5+0.0356X6-0.0817X7-0.2556X8-0.0028X9+0.0344X10

表4 胞外多糖產(chǎn)量回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance for the exopolysaccharide regression model

表5 模型偏回歸系數(shù)與顯著性檢驗Table 5 Regression coefficients and significance for the model

2.3 Box-Behnken實驗設計結果及分析

根據(jù)4因素3水平的響應面實驗設計,共設立29個實驗點,Box-Behnken實驗設計及響應值見表6。

表6 Box-Behnken實驗設計和實驗結果Table 6 Box-Behnken design and results

運用Design-Expert 8.0對表6的數(shù)據(jù)進行完全二次回歸擬合,Box-Behnken實驗設計回歸分析結果見表7?；貧w方程如下:

回歸方程的決定系數(shù)R2=0.9412,說明回歸方程的擬合程度很好,預測值與實測值之間具有高度的相關性,偏差較小。p值常用來反映每個變量的顯著性以及變量間的交互作用強弱[22],在α=0.01水平上回歸模型高度顯著(p<0.0001),而失擬項在α=0.05水平上不顯著(p>0.05),表明可以利用該模型預測最優(yōu)的樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖條件。

表7 胞外多糖產(chǎn)量回歸方程方差分析Table 7 Analysis of variance for the exopolysaccharide regression model

由圖12c、e及f可以看出培養(yǎng)溫度與其他三種因素之間均有比較明顯的交互作用,其交互作用的強弱順序為:X1X4>X2X4>X3X4。擬合曲面均為凸形有最大值,通過Design Expert 8.06軟件求解方程,得出預測的最優(yōu)條件為KH2PO40.75 g/L,MgSO4·7H2O 0.77 g/L,初始pH=4.95,培養(yǎng)溫度27.06 ℃,在該條件下樟芝液態(tài)發(fā)酵胞外多糖產(chǎn)量最高,預測產(chǎn)量為1.17 g/L。考慮實際操作,將擬合的最優(yōu)條件修正為pH=5.0,培養(yǎng)溫度27 ℃,KH2PO40.75 g/L,MgSO4·7H2O 0.77 g/L。為檢驗結果的可信度,采用修正后的條件進行驗證實驗,測得胞外多糖產(chǎn)量為1.23 g/L(結果為3次重復實驗平均值),與模型預測值偏差-4.9%,二者基本吻合,具有良好的擬合性,優(yōu)化模型可靠。該優(yōu)化結果比優(yōu)化前(0.72 g/L)提升了71%,比已有研究結果(0.49 g/L)[12]高出1.51倍,在搖瓶階段達到一個相對較高產(chǎn)量。同時相比麥芽膏、玉米漿粉等[11,24-25]常規(guī)碳氮源,本文以葡萄糖和酵母浸粉為碳氮源,不僅產(chǎn)量上有大幅提升,而且發(fā)酵液本身不含多糖,保證了最終發(fā)酵液中所含多糖為樟芝真菌本身合成所得,結果更為準確。并且對胞外多糖的單糖組成分析發(fā)現(xiàn)優(yōu)化前后單糖組成一致,沒有差異,這也說明了該工藝方法可靠可行,同時也可為其他菌株液態(tài)發(fā)酵法合成胞外多糖的研究提供參考。

圖12 各因素間交互作用影響胞外多糖產(chǎn)量的響應曲面及其等高線圖Fig.12 Response surface and respective contour plot of the mutual functions among the yield factors of A. camphorate exopolysaccharide注：a～f分別為KH2PO4與pH,MgSO4·7H2O與pH,MgSO4·7H2O與溫度,KH2PO4與MgSO4·7H2O,KH2PO4與溫度,pH與溫度。

3 結論

為提高樟芝胞外多糖的產(chǎn)量,同時利于胞外多糖的分離純化,本文對樟芝的液態(tài)發(fā)酵條件進行了深入探索。首先對碳氮源進行了初選,發(fā)現(xiàn)葡萄糖和酵母浸粉最好,并且酵母浸粉作為最為適合樟芝液態(tài)發(fā)酵胞產(chǎn)外多糖的氮源的同時,其本身不含多糖,避免了培養(yǎng)基所含多糖對發(fā)酵所產(chǎn)胞外多糖含量及進一步分離純化的影響。其次,在單因素實驗的基礎上,設計了Plackett-Burman實驗,結果表明初始pH、KH2PO4濃度、溫度、MgSO4·7H2O濃度對胞外多糖產(chǎn)量影響顯著(p<0.05)。結合上述結果進一步采用四因素三水平的Box-Behnken設計模型進行響應面實驗,得到最佳發(fā)酵條件為:葡萄糖60 g/L、酵母浸粉16 g/L、維生素B11 g/L、KH2PO40.75 g/L、MgSO4·7H2O 0.77 g/L、初始pH=5.0、裝液量120 mL/500 mL、接種量18%、27 ℃、10 d、100 r/min。該條件下培養(yǎng)胞外多糖產(chǎn)量為1.23 g/L,較優(yōu)化前有大幅提升,可為樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的工業(yè)化應用提供一定的參考。

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