龍眼肉不同提取物的神經(jīng)保護(hù)作用及其機制

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

龍眼肉為無患子科植物龍眼DimocarpuslonganLour. 的假種皮，屬藥食同源類中藥，具有補益心脾，養(yǎng)血安神之功效；臨床用于氣血不足，健忘失眠等癥[1]?，F(xiàn)代研究表明，龍眼肉具有改善記憶[2]、抗焦慮[3]、抗氧化[4-5]等多種作用，據(jù)報道，氧化應(yīng)激很可能是記憶減退、焦慮證等的一個共同誘因[6-7]。PC12 細(xì)胞來源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤，因其具有許多神經(jīng)元特性，被廣泛用于老年癡呆、焦慮證等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究[8]?；邶堁廴獾纳鲜鲎饔?，作者推測，龍眼肉很可能具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用；課題組前期研究也表明，龍眼肉提取物能夠促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖并抑制其凋亡[9]，但對不同提取物的神經(jīng)保護(hù)作用及其機制的比較研究前期未做報道。本研究通過比較龍眼肉不同提取物對細(xì)胞增殖、凋亡及氧化應(yīng)激的影響，探討龍眼肉不同提取物的神經(jīng)保護(hù)作用，為系統(tǒng)研究龍眼肉神經(jīng)保護(hù)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 龍眼肉，安徽益生源中藥飲片科技有限公司(批號160301)；高分化PC12細(xì)胞，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥理實驗室提供；DMEM高糖培養(yǎng)基(批號8116244)，Gibco；胰蛋白酶(批號GP3108)、青鏈霉素雙抗溶液(批號GA3502)、Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒(批號113688)，Genview；胎牛血清(批號：20160629)，四季青；MTT(批號M8180)，北京Solaibio；Aβ25-35(批號095M4774V)，Sigma；SOD(批號DZE30169)、MDA(批號DZE30157) Elisa試劑盒，南京建成；NU-4750型二氧化碳培養(yǎng)箱，Nuaire；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮；NIB-100F型倒置熒光顯微鏡，寧波永新；MR-96A型酶標(biāo)儀，深圳邁瑞；NoVocyte 451141112066流式細(xì)胞儀，艾森生物。

1.2 方法

1.2.1 龍眼肉不同提取物的制備 龍眼肉，用1∶12(m∶v)的去離子水微沸提取1 h，提取3次，合并濾液，按極性大小，依次采用乙酸乙酯和正丁醇萃取，收集合并各次濾液，分別得到龍眼肉的乙酸乙酯、正丁醇和水提取物，60 ℃減壓濃縮，4 ℃密封保存。

1.2.2 MTT實驗及SOD、MDA水平測定 對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞以105/mL密度，接種于96孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，隨機分為正常組、模型組和龍眼肉提取物高低劑量組及石杉堿甲組，于加入Aβ前2 h加入；模型組與給藥組同步加入Aβ25μM；正常組常規(guī)培養(yǎng)。加入Aβ24 h后，吸出各組細(xì)胞上清液，采用Elisa試劑盒檢測SOD活性及MDA含量；細(xì)胞中加入5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，加入100μL DMSO于酶標(biāo)儀490 nm處測定各孔吸光度(A)值，計算細(xì)胞存活率。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 PC12細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，隨機分為正常組，模型組和龍眼肉提取物組。除正常組常規(guī)培養(yǎng)外，其余各組采用200 μM H2O2處理細(xì)胞8 h，給藥組加入H2O2前先加受試藥物預(yù)處理2 h。經(jīng)H2O2處理12 h后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。每組3個復(fù)孔。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計。組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 龍眼肉不同提取物對細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測結(jié)果(圖1)表明，細(xì)胞存活率模型組較正常組降低(P<0.05)，龍眼肉水提取物0.5、1.0 mg/mL和正丁醇提取物1.0 mg/mL組較模型組提高(P<0.01)；正丁醇提取物0.5 mg/mL、乙酸乙酯提取物和陽性對照石杉堿甲(2 μM)，實驗濃度范圍內(nèi)未見神經(jīng)保護(hù)作用(P>0.05)。結(jié)果提示，實驗濃度范圍內(nèi)，龍眼肉水提取物促進(jìn)細(xì)胞增殖作用最明顯。

2.2 龍眼肉不同提取物對SOD、MDA水平的影響 圖2A結(jié)果表明，SOD活力，模型組較正常組SOD降低(P<0.05)；龍眼肉水和正丁醇提取物組較模型組提高(P<0.05，P<0.01)；乙酸乙酯提取物組與模型組比較無差異但有升高趨勢。圖2B結(jié)果表明，MDA含量模型組較正常組增加但無顯著差異；龍眼肉不同提取物對MDA含量亦無明顯影響。結(jié)果提示，實驗濃度下，龍眼肉水提取物抗氧化能力最強。

水、正、乙分別代表水、正丁醇和乙酸乙酯提取物；0.5、1.0代表給藥濃度0.5、1.0 mg/mL；石杉代表石杉堿甲 2 μM。

2.3 龍眼肉不同提取物對細(xì)胞凋亡的影響

由圖3可見，龍眼肉不同提取物均可使受損細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)提高(P<0.01，圖3B)、早期凋亡細(xì)胞減少(P<0.01，P<0.05，圖3C)；對晚期凋亡及細(xì)胞壞死，僅乙酸乙酯部位有明顯作用。

3 討論

高分化PC12細(xì)胞因具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究。Aβ和H2O2均具有細(xì)胞毒性，可誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。因Aβ沉積是阿爾茨海默病(AD)的主要病理特征之一，氧化應(yīng)激又是導(dǎo)致AD的一個重要誘因，故Aβ和H2O2常被用于構(gòu)建體外AD細(xì)胞模型。作者前期采用H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，用龍眼肉不同提取物進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明，龍眼肉水、正丁醇及乙酸乙酯提取物對細(xì)胞存活均有一定的保護(hù)作用，實驗濃度范圍內(nèi)，以乙酸乙酯提取物促進(jìn)細(xì)胞增殖作用最明顯，并且其對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有一定抑制作用[9]。但是，不同提取物對Aβ誘導(dǎo)的體外AD模型是否有保護(hù)作用以及不同提取物對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的比較研究前期均未報道。本研究采用Aβ和H2O2誘導(dǎo)建立PC12細(xì)胞損傷模型，并探討龍眼肉不同部位的神經(jīng)保護(hù)作用。綜合本實驗結(jié)果并聯(lián)合前期實驗結(jié)果，作者推測，龍眼肉不同極性部位均有神經(jīng)保護(hù)作用，但作用機制不完全相同：水和正丁醇提取物主要是提高細(xì)胞抗氧化能力，抑制早期細(xì)胞凋亡；乙酸乙酯提取物主要是抑制細(xì)胞各期凋亡及壞死。

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