三個小麥-大麥2H二體異代換系的細胞學及補償能力研究

劉宏魁，李世鵬，吳 穎，蘇勝忠，單曉輝，李 賀，韓俊友，陳 孝，原亞萍

(1.吉林大學植物科學學院，吉林長春 130062； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081)

小麥和大麥是兩種重要的栽培作物，近百年來許多中外育種工作者一直致力于小麥-大麥雜交的研究工作并取得了較大的進展。1973年，Kruse[1]首次獲得了可證實的小麥-大麥雜種植株；1978年，Islam[2-4]創(chuàng)造出了6個小麥-大麥二體異附加系和12個端體異附加系；1992年，Islam和Shepherd[5]選育出小麥-大麥3、4、6、7二體異代換系。近年來，研究者獲得了4BS·7HL小麥-大麥易位系[6]、4HL·5DL小麥-大麥易位系[7]及5HS-7DS·7DL小麥-大麥易位系[8]等材料，這些材料的獲得為向小麥轉(zhuǎn)移大麥有益基因奠定了堅實的基礎(chǔ)。但有關(guān)小麥-大麥2H二體異代換系的獲得及其遺傳穩(wěn)定性研究在國內(nèi)外還未見報道。本實驗室用中國春ph1b突變體(CSph1b)與小麥-大麥2H二體異附加系(CS+Betzes 2H)雜交，并對其幼胚進行組培，獲得SC2代材料數(shù)份，經(jīng)基因組原位雜交和與中國春重雙端體DDT2A、DDT2B及DDT2D測交及RFLP分析，最終鑒定并獲得了三個小麥-大麥2H二體異代換系2H(A)、2H(B)和2H(D)。

本研究采用基因組原位雜交(genomic in situ hybridization,GISH)技術(shù)，對這三個小麥-大麥2H二體異代換系在細胞學水平上的遺傳穩(wěn)定性加以分析驗證，同時評價獲得材料的農(nóng)藝性狀，以期為所獲種質(zhì)資源的進一步利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

大麥品種Betzes，小麥品種中國春(CS)，小麥-大麥2H二體異附加系CS+Betzes 2H(CS+2H)，小麥-大麥2H二體異代換系2H(A)、2H(B)和2H(D)。

1.2 方 法

1.2.1 細胞學觀察

小麥挑旗后，選取時期適宜的幼穗，經(jīng)初步鏡檢，將合適的花藥在卡諾固定液中固定半小時以上，分別用70%的酒精和蒸餾水各處理5 min，60 ℃ 0.5 mol·L-1HCl水解10 min，醋酸洋紅染色。

1.2.2 基因組原位雜交

以大麥品種Betzes的DNA為探針，采用隨機引物法用生物素Biotin-16-dUTP進行標記，以小麥品種中國春DNA作封阻。染色體制片、原位雜交反應(yīng)、洗滌、熒光信號的檢測和放大等程序均參照Fukui等[9]和原亞萍等[10]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥-大麥2H二體異代換系的染色體構(gòu)型

細胞學分析表明，小麥-大麥2H二體異代換系2H(A)、2H(B)、2H(D)的花粉母細胞減數(shù)分裂中期I染色體構(gòu)型分別為 20.47Ⅱ + 0.30 I、20.43Ⅱ + 1.04 I和20.84Ⅱ + 0.27 I，三個代換系21Ⅱ的頻率分別為 92.56%、94.12% 和 95.41%，基本構(gòu)型為21Ⅱ(表1)，說明它們在細胞學上是穩(wěn)定的。但由于外源染色體的存在，在三個代換系花粉母細胞減數(shù)分裂后末期也觀察到了落后染色體、染色體橋及不同步分裂的現(xiàn)象，其出現(xiàn)的頻率為2H(A)大于2H(B)和2H(D)(表2)。

2.2 小麥-大麥2H二體異代換系細胞分裂的穩(wěn)定性

三個小麥-大麥2H二體異代換系2H(A)、2H(B)和2H(D)花粉母細胞減數(shù)分裂中期I的GISH結(jié)果表明，三個代換系分裂正常，含有一對大麥Betzes 2H染色體(黃綠色染色體信號)和20對小麥染色體(圖1)，減數(shù)分裂后期正常向兩極分開(圖2)，原位雜交圖直觀顯示出了各代換系細胞分裂的穩(wěn)定性。

表1 供試材料花粉母細胞減數(shù)分裂中期Ⅰ的染色體構(gòu)型及數(shù)目Table 1 Chromosome configuration and its numbers of materials at PMCs MⅠ

括號中的數(shù)字為鏡檢染色體中單價染色體、棒型二價體或鈴型二價體的數(shù)目范圍。

The numbers in brackets represent the number of monovalent chromosomes,rod or ringbiverlent.

表2 供試材料花粉母細胞減數(shù)分裂后末期的染色體構(gòu)型及數(shù)目Table 2 Chromosome configuration and its numbers of materials in PMCs at meiotic anaphase

2.3 小麥-大麥2H二體異代換系的農(nóng)藝性狀及2H對2A、2B及2D的補償能力

農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果表明，與CS和CS+2H相比，三個代換系苗期長勢繁茂，分蘗多。同時各材料的花期也不盡相同，CS開花最早，CS+2H、2H(D)比CS晚2 d，2H(A)和2H(B)比CS晚4 d。三個代換系2H(A)、2H(B)及2H(D)的穗型與親本差異較大，代換系小穗較疏松，2H(A)、2H(D)無芒，2H(B)頂部具小鉤芒(表3)。三個代換系籽粒較大、偏長，粒型似附加系。從外觀品質(zhì)上看CS為半粉質(zhì)，而CS+2H及2H(A)、2H

黃綠色示大麥2H染色體。

Yellow-green indicates barley chromosome 2H.

圖1代換系花粉母細胞減數(shù)分裂中期I(PMCsMI)GISH圖

Fig.1GISHpatternsofsubstitutionlineinPMCsMI

(B)和2H(D)為半角質(zhì)。三個代換系的株高與對照CS相近，穗長及每株穗數(shù)大于親本CS，單株粒重、單株粒數(shù)及每穗的小穗數(shù)代換系2H(B)、2H(D)高于親本CS，而2H(A)卻低于親本(表4)。每穗不育小穗數(shù)及不育率三個代換系都高于對照，其中2H(A)的不育率較高，為40.44%，說明2H代換2A后在小麥背景下依然具有某種程度的不協(xié)調(diào)。從各代換系的生活力和不育率看，大麥2H染色體對小麥2B、2D染色體的補償能力好于對2A染色體的補償能力(表3、表4、圖3)。

黃綠色示大麥2H染色體。

Yellow-green indicates barley chromosome 2H.

圖2 代換系花粉母細胞減數(shù)分裂后期I的GISH圖

表4 大麥 2H染色體對小麥2A、2B及2D的補償能力Table 4 Compensation ability of barley 2H to wheat 2A,2B and 2D

圖3 小麥-大麥2H二體異代換系的穗部和籽粒性狀Fig.3 Spike and grain characters of wheat- barley 2H disomic substitution lines

3 討 論

將近緣物種的基因?qū)胄←準且环N重要的遺傳改良方法，目前已經(jīng)將大麥[11]、濱麥[12]、長穗偃麥草[13]和華山新麥草[14]等的遺傳物質(zhì)導(dǎo)入小麥，獲得了大量的異附加系、異代換系及易位系。一個優(yōu)良的異代換系要滿足以下幾點要求：細胞有絲分裂和減數(shù)分裂穩(wěn)定性強；外源染色體對被代換的普通小麥染色體有較好的補償作用；外源染色體(片段)最好攜帶有受體材料所需要的優(yōu)良基因，不帶入或很少帶入不良性狀的外源基因。

本試驗對小麥-大麥2H二體異代換系材料進行研究，細胞學觀察結(jié)果表明三個代換系在減數(shù)分裂中期的二價體數(shù)基本相似，但在減數(shù)分裂后末期2H(A)中出現(xiàn)染色體橋和斷片的比例較高，后末期高頻率的橋和斷片的出現(xiàn)可能是導(dǎo)致不育的主要原因。劉 洋等[12]以硬粒小麥D4286為受體導(dǎo)入八倍體濱麥基因獲得F7代材料，細胞學分析表明得到了小麥2D染色體缺失且遺傳穩(wěn)定的異代換系材料。王小華等[13]以小麥栽培種7182為受體導(dǎo)入十倍體長穗偃麥草基因，獲得了小麥6A染色體被替換的異代換系材料。說明小麥能夠接受多種外源基因并使其表達。

對三個代換系的農(nóng)藝性狀進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其穗長、每株穗數(shù)、粒數(shù)及粒重都高于小麥中國春，代換系2H(B)及2H(D)的生活力和育性好于2H(A)，表明大麥2H染色體對小麥2B和2D染色體的缺失有較好的補償能力。王小華等[13]的研究表明小麥-長穗偃麥草的異代換系獲得了白粉病抗性，是一個良好的種質(zhì)資源。劉 洋等[12]的研究也表明，獲得的小麥-濱麥異代換系材料出現(xiàn)矮化性狀，具有較高的利用價值。Henry[15]與肖世和和陳 孝[16]的研究表明，位于大麥2H染色體上的-淀粉酶抑制蛋白基因，在導(dǎo)入小麥背景以后，可以在小麥背景中進行表達，并且可用于控制小麥穗發(fā)芽。張 艷等[11]和Zou等[17]的研究表明，攜帶大麥2H染色體代換系的籽粒硬度、蛋白質(zhì)組成和淀粉特性等比中國春都有不同程度的改善。本研究表明2H代換系的農(nóng)藝性狀得到不同程度地改善，大麥2H染色體的導(dǎo)入及其衍生系將為小麥品種改良開辟一條新途徑。

參考文獻：

[1] KRUSE A.Hordeum × Triticum hybrids [J].Hereditas,1973,73(1):157.

[2] ISLAM A K M R.Production and charaterization of wheat-barley addition lines [C].Proceedingsof the 5th International Wheat Genetics Symposium,1978,365.

[3] ISLAM A K M R,SHEPHERD K W,SPARROW D H B.Isolation and characterization of euplasmic wheat-barley chromosome addition lines [J].Heredity,1981,46:161.

[4] ISLAM A K M R.Ditelosomic additions of barley chromosomes to wheat [C].In:S.Sakamoto(Ed),Proceedings of the 6thInternational Wheat Genetics Symposium,1983:233.Maruzen Co.Ltd.,Kyoto.

[5] ISLAM A K M R,SHEPHERD K W.Substitutingability of individual barley chromosomes for wheat chromosomes 1.substitutionsinvolving barley chromosomes 1,3 and 6 [J].PlantBreeding,1992,109(2):141.

[6] CSEH A,KRUPPA K,MOLNAR I,etal.Characterization of a new 4BS.7HL wheat-barley translocation line using GISH,FISH,and SSR markers and its effect on the β-glucan content of wheat [J].Genome,2011,54(10):795.

[7] KRUPPA K.Development and identification of a 4HL·5DL wheat/barley centric fusion using GISH,FISH and SSR Markers [J].CerealResearchCommunications,2013,41(2):221.

[8] KRUPPA K,SEPSI A,SZAKACS E,etal.Characterization of a 5 HS-7DS.7DL wheat- barley translocation line and physical mapping of the 7D chromosome using SSR markers [J].JournalofAppliedGenetics,2013,54(3):251.

[9] FUKUI K,OHMIDO N,KHUSH G S.Variability in rDNA loci in the genus Oryza detected through fluorescence in situ hybridization [J].TheoreticalandAppliedGenetics,1994,87(8):893.

[10] 原亞萍,陳 孝,肖世和,等.應(yīng)用基因組原位雜交及RFLP標記鑒定小麥中的大麥染色體 [J].遺傳學報,2000,27(12):1080.

YUAN Y P,CHEN X,XIAO S H,etal.Idengtification of barlychromosomein wheat by GISH and RFLP [J].ActaGeneticaSinica,2000,27(12):1080.

[11] 張 艷,原亞萍,陳 孝,等.大麥2H染色體對小麥農(nóng)藝和品質(zhì)特性的影響 [J].麥類作物學報,2007,27(3):402.

ZHANG Y,YUAN Y P,CHEN X,etal.Effect of barley 2H chromosome on agronomic traits and quality characteristics of common wheat [J].JournalofTriticeaeCrops,2007,27(3):402.

[12] 劉 洋,趙繼新,談宏斌,等.小麥-濱麥2D/2Ns異代換系DM2411的分子細胞遺傳學鑒定 [J].麥類作物學報,2017,(5):571.

LIU Y,ZHAO J X,TAN H B,etal.Molecular cytogenetic and morphological identification of a wheat-Leymusmollis2Ns(2D) substitution line DM2411 [J].JournalofTriticeaeCrops,2017,(5):571.

[13] 王小華,陳春環(huán),王長有,等.普通小麥-長穗偃麥草抗白粉病異代換系的分子細胞學研究 [J].麥類作物學報,2015,35(5):596.

WANG X H,CHEN C H,WANG C Y,etal.Molecular cytogenetic identification of aTriticumasetivumThinopyrumponticumsubstitutionline with powdery mildew resistance [J].JournalofTriticeaeCrops,2015,35(5):596.

[14] 王秀娟,趙繼新,龐玉輝,等.小麥-華山新麥草7Ns異附加系的分子細胞遺傳學研究 [J].麥類作物學報,2014,34(4):454.

WANG X J,ZHAO J X,PANG Y H,etal.Molecular and cytogenetic characterization of aTriticum-Psathyrostachys7Ns addition line [J].JournalofTriticeaeCrops,2014,34(4):454.

[15] HENRY R J,BATTERSHELL V G,BRENNAN P S,etal.Control of wheat α-amylase using inhibitors from cereals [J].JournaloftheScienceofFood&Agriculture,1992,58(2):281.

[16] 肖世和,陳 孝.大麥α-淀粉酶抑制基因?qū)π←湨?淀粉酶的抑制作用研究 [J].作物學報,1998,24(6):763.

XIAO S H,CHEN X.Studies on effect of α-amylase inhibitor gene from barley on the α-amylase activity in wheat [J].ActaAgronomicaSinica,1998,24(6):763.

[17] ZOU H D,WU Y,LIU H K,etal.Development and identification of wheat-barley 2H chromosome translocation line scarrying the Isagene [J].PlantBreeding,2012,131(1):69.