CD133聯(lián)合外周循環(huán)腫瘤細胞在結直腸癌預后評估中的應用研究

楊國華 鄭圣斌 林彩鋒 黃若磊

結直腸癌發(fā)病率為惡性腫瘤第三位，病死率位居惡性腫瘤第四位，常見死亡原因為腫瘤復發(fā)或轉移。近年來，國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)結直腸癌組織中存在一群細胞表面表達CD133的亞組癌細胞，含有該組癌細胞的腫瘤組織其復發(fā)率及轉移率明顯升高。外周循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)指外周循環(huán)血液中的腫瘤細胞，學者研究[1-2]發(fā)現(xiàn)CTC數(shù)量與病人預后呈負相關，數(shù)量越多其預后越差。結直腸癌預后判斷一直是結直腸癌臨床研究熱點，本文擬對CD133聯(lián)合CTC兩因素在結直腸癌預后評估應用的可行性作一研究。

資料與方法

一、一般資料

收集自2012年1月至2013年1月福建省立醫(yī)院胃腸外科及腫瘤外科132例結直腸癌手術標本，年齡為(52.7±13.9)歲，年齡范圍為35～86歲。132例均行術前腸鏡及術后標本病理證實，其中高分化29例，中分化72例，低分化31例；按美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(NCCN)指南2016年第2版TNM分期Ⅰ期26例，Ⅱ期32例，Ⅲ期51例，Ⅳ期23例。

二、隨訪方法及內(nèi)容

采取病人門診隨訪及電話隨訪，術后前2年每3個月復查，第3年每半年復查，復查內(nèi)容：血常規(guī)、生化、癌胚抗原(CEA)、CTC，胸片、腹部B超；每半年復查全腹及胸部CT，每年復查腸鏡。

三、標本組織中CD133測定

10%甲醛溶液固定新鮮組織標本，連續(xù)薄切厚4 μm病理切片共3張，常規(guī)病理HE染色，采用ABC法行免疫組織化學病理染色。步驟如下：切片常規(guī)脫蠟后用梯度乙醇水化，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后加入一抗鼠抗人CD133單克隆(1∶40)，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后加入蘇木精復染，樹脂封片。參考文獻[3]標準：CD133陽性表達為境界清晰、突出于背景的棕黃色，定位于細胞質、細胞膜同時呈棕黃色亦為陽性。計分標準參照Hilbe等[4]的方法，隨機選取4個高倍視野約200個細胞，計數(shù)腫瘤細胞CD133陽性數(shù)，取三張陽性切片平均值作為計數(shù)結果，細胞數(shù)>10%為陽性，≤10%為陰性。

四、CTC測定

術前采外周血10 ml，置于50 ml離心管中1 500 r/min離心，后加入CS1血小板裂解液45 ml后再次離心，去除血清等上清至12 ml，搖勻加入CS2紅細胞裂解液裂解紅細胞，離心去除上清，留下白細胞與特種細胞沉淀，加300 μl CS1搖勻沉淀細胞，加入磁微粒吸附離心，去除結合白細胞的磁微粒沉淀。再次離心去上清至100 μl，加CF1混勻細胞懸液涂片，置25℃～33℃無風烘箱烘干。染色鑒定：將細胞干片加CF2固定液固定8 min后，浸泡SSC試劑10 min后，加入雜交探針，放入雜交儀雜交1.5 h后，取出浸泡43℃預熱后的甲酰胺試劑15 min，再次浸泡SSC試劑10 min，用BSA清洗標本區(qū)后加入CD45孵育1 h后取出加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPA)染色，蓋上蓋玻片，放置4℃冰箱保存。最后使用熒光顯微鏡先在藍色通道下找到靶細胞層面，換到20倍物鏡，分別在三種通道(藍色、紅色、橙色或綠色)下觀看信號、細胞狀態(tài)、CD45著色等情況。CTC細胞表現(xiàn)為：單個細胞狀態(tài)，核質均勻，未發(fā)現(xiàn)分層，細胞表面無或僅一顆結合白細胞磁微粒；紅色通道下未見CD45紅色，CD45陰性。橙色或綠色信號3個或3個以上，且在細胞核上。我們參考文獻[5]標準：CTC>3個/7.5 ml為高水平量(H-CTC)，≤3個/7.5 ml為低水平量(L-CTC)。

五、觀察指標

觀察CD133、CTC與臨床病理各因素之間的關系，并進一步將實驗分為4個組，第1組為CD133陰性(CD133-)L-CTC，第2組為CD133-H-CTC，第3組為CD133陽性(CD133+)L-CTC，第4組為CD133+H-CTC，繪制各組的3年生存曲線。

六、統(tǒng)計學分析

結 果

一、隨訪情況

本組完整隨訪了124例，失訪8例；隨訪病例中CD133-L-CTC共59例，CD133-H-CTC共21例，CD133+L-CTC共35例，CD133+H-CTC共9例。

二、臨床各因素與CD133、CTC之間的關系

CD133陽性組與CD133陰性組病人在淋巴結轉移、遠處轉移、腹膜種植、組織分化、神經(jīng)脈管侵犯等因素方面比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；而在結腸癌位置(P=0.755)、病人性別(P=0.069)、年齡(P=0.697)、腫瘤浸潤深度(P=0.231)、CEA水平(P=0.054)方面兩組差異均無統(tǒng)計學意義。CTC高水平量組與CTC低水平量組病人在腫瘤位置、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、腹膜種植、組織分化、神經(jīng)脈管侵犯等因素方面比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。(表1)

三、各組生存曲線關系

CD133-L-CTC組生存時間與CD133+L-CTC組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.452)；但明顯高于CD133-H-CTC 組(P=0.037)及CD133+H-CTC

表1 臨床各因素與CD133、CTC之間的關系(例)

組(P<0.01)；CD133+L-CTC組生存時間明顯高于CD133-H-CTC組(P=0.042)及CD133+H-CTC組(P<0.01)；CD133-H-CTC組生存時間明顯高于CD133+H-CTC組，兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.035)。(表2、圖1)

表2 各組生存時間及95%可信區(qū)間(d)

注：與CD133-L-CTC組比較，aP<0.05；與CD133-H-CTC組比較，bP<0.05；與CD133+L-CTC組比較，cP<0.05

四、CTC鏡下特征

CTC在鏡下表現(xiàn)：細胞呈單個細胞狀態(tài)，核質均勻，紅色通道下未見CD45紅色，CD45陰性。橙色或綠色信號3個或3個以上，且在細胞核上。(圖2、3)

圖1 4組3年生存曲線圖

圖2 CTC在熒光顯微鏡(×40)鏡下表現(xiàn) A．CTC單個細胞狀態(tài)，細胞核上呈3個橙色及1個綠色信號，核質均勻，CD45陰性，未見紅色；B．CTC單個細胞狀態(tài)，細胞核上呈3個橙色及2個綠色信號，核質均勻，CD45陰性，未見紅色

圖3 CD133免疫組織化學染色切片(×20) CD133陽性表達為境界清晰、突出于背景的棕黃色(箭頭所示)，定位于細胞質、細胞膜

討 論

結直腸癌是全球腫瘤死亡的主要原因之一，其致死的主要原因為腫瘤復發(fā)或轉移，大約有15%～25%的病人就診時同時合并肝轉移，25%～50%在原發(fā)灶切除術后發(fā)生肝轉移[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)：結直腸癌組織中CD133陽性與腫瘤淋巴結轉移、遠處轉移、腹膜種植、組織分化、神經(jīng)脈管侵犯明顯相關。這可能與CD133表達上調在結直腸癌中增高肝轉移率，其預后更差;學者研究表明對于結直腸癌CD133陽性干細胞樣細胞，它們與結直腸腫瘤的侵襲和分化呈正相關[8-11]。本研究還發(fā)現(xiàn)，CD133陽性與陰性病人在術后3年內(nèi)二者生存曲線無明顯差異，但術后2年時CD133陽性病人其生存時間開始低于CD133陰性組，遠期生存時間有待進一步隨訪。

近年來國內(nèi)外學者從結直腸癌肝轉移病人外周血發(fā)現(xiàn)CTC，血液中CTC的分子表征提供了替代或補充的非侵入性方法組織活檢[12-13]；CTC可作為結直腸癌伴肝轉移病人的獨立預后因素，CTC陽性組的總生存期及無病生存期明顯低于陰性組[14]。本研究結果表明：CTC數(shù)量與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、腹膜種植、組織分化、神經(jīng)脈管侵犯呈明顯正相關，而上述幾個因素是結直腸癌術后預后不良主要因素[15]；本研究結果表明：CTC低水平量組其3年生存期明顯好于高水平量組，CD133-L-CTC組生存時間為(1 002.8±39.1) d，CD133+L-CTC-組為(980.5±38.8) d，明顯高于CD133-H-CTC組的(782.5±75.8) d及CD133+H-CTC組的(368.6±31.0) d，差異均具有統(tǒng)計學意義，說明CTC高水平的結直腸癌預后差，其原因與上述結直腸癌預后不良因素相關。本研究還發(fā)現(xiàn)，CTC還與腫瘤位置有關，左半結腸CTC水平明顯高于右半結腸，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義。這與臨床左半結腸癌預后明顯差于右半結腸相符，其具體分子機制目前尚不明，有待進一步分子機制研究。

通過本研究表明，CD133聯(lián)合CTC可用于結直腸癌術后3年生存時間評估，CD133陰性且CTC低水平量組預后好，而CD133陽性且CTC高水平量組預后差。CD133可能與病人3年生存期無明顯相關，可能與遠期生存時間有關；而CTC水平與病人近期生存時間明顯相關。其遠期預后評估有待一步隨訪。

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