水稻花藥開裂前茉莉酸水平及信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

何永明，劉遂飛，雷抒情

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江西省作物生理生態(tài)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

水稻穎花開放(或稱開花)是其生殖生長(zhǎng)的重要環(huán)節(jié)，直接影響授粉、受精和結(jié)實(shí)。成熟稻穗的穎花開放時(shí)間容易受到品種特性和環(huán)境條件的影響，通常發(fā)生在09:00—12:00[1]。水稻開花期遇35 ℃以上高溫引起的穎花不育現(xiàn)象與開花后花藥不開裂密切相關(guān)[2]。除常見的花粉敗育外，花藥開裂異常也是水稻雄性不育系的性狀之一[3]。研究水稻花藥開裂機(jī)制不僅有助于揭示水稻雄性生殖發(fā)育過程，同時(shí)對(duì)花期高溫不育危害的解決及新型雄性不育系的創(chuàng)制也具有實(shí)踐意義。

植物激素茉莉酸類(jasmonates，JAs)屬于氧化的脂肪酸衍生物，是由脂類經(jīng)十八烷酸途徑產(chǎn)生的末端化合物。大量研究表明，JAs在植物根系生長(zhǎng)、花器官發(fā)育、花青素合成、卷須環(huán)繞、塊莖形成、葉片衰老以及抗病蟲反應(yīng)等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用[4]。近年研究還發(fā)現(xiàn)，JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及SCFCOI1復(fù)合體依賴的JAZ抑制蛋白的降解[5]。許多研究發(fā)現(xiàn)，JA在水稻穎花開放中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。穎花開放是由漿片膨大推開外稃所引起的，并同步發(fā)生花絲伸長(zhǎng)和花藥開裂的復(fù)雜事件。外源MeJA或JA對(duì)水稻、小麥、黑麥、高粱等禾本科植物穎花開放有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)作用[6-7]。水稻穎花和漿片內(nèi)源JA水平在穎花張開時(shí)會(huì)大幅上升，相應(yīng)地JA途徑相關(guān)基因表達(dá)的也會(huì)上調(diào)[8-9]；并且漿片內(nèi)源JA缺乏是導(dǎo)致雄性不育系珍汕97A花時(shí)零散的主要原因[10]。JA途徑突變體dad1、aos、opr3和coi1花藥均異常開裂[4]。近期發(fā)現(xiàn)水稻JA不敏感突變體osjar1[11]花藥開裂異常并導(dǎo)致雄性不育，但是花藥開裂前內(nèi)源JA信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化和調(diào)控位點(diǎn)目前并不清楚。為此，本文以粳稻中花11為試驗(yàn)材料，測(cè)定和分析其花藥開裂前內(nèi)源JA水平以及JA合成和信號(hào)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)的變化，以期進(jìn)一步闡明JA調(diào)控水稻花藥開裂的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻品種為粳稻中花11，2015年4月10日播種，種植于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技園試驗(yàn)田，常規(guī)管理，抽穗期為7月上旬。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 穎花開放動(dòng)態(tài) 調(diào)查08:00隨機(jī)選取6株上部已少量開花的大分蘗穗，調(diào)查08:00—16:00的穎花開放數(shù)，每30 min調(diào)查1次。

1.2.2 花藥樣品的采集 根據(jù)調(diào)查，穎花開放的高峰時(shí)間為11:30，高峰期開花數(shù)占日總開花數(shù)的80%左右。掛牌標(biāo)記前1～2 d已開過少量穎花的大分蘗，分別剝?nèi)》f花開放前24，4，2，0 h(剛開放)的花藥，花藥成熟度的判斷依據(jù)穎花著生位置和花藥長(zhǎng)度。所剝?nèi)〉幕ㄋ幜⒓从靡旱賰?，保存?80 ℃冰箱中備用。

1.2.3 JA和JA-Ile的提取和測(cè)定 激素提取方法參照黃俊寶等[9]。液氮研磨樣品，準(zhǔn)確稱取約0.1 g粉末，裝入1.5 mL離心管中，加500 μL預(yù)冷的提取液(甲醇/水/乙酸=90/9/1)，置于平板搖床(200 r/min)上，4 ℃避光浸提24 h，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，吸取上清液；共提3次，合并3次提取液。提取液在室溫下用N2吹干，加200 μL甲醇溶解過夜，甲醇容液經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過濾后保存于-20 ℃冰箱中待測(cè)。采用UFLC-ESI-MS系統(tǒng)，按Liu等[12]的方法測(cè)定JA和JA-Ile含量。每份樣品4次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 Real-time PCR分析方法 參考何永明和曾曉春[13]?；ㄋ幙俁NA的提取采用Trizol試劑(北京全式金公司)。取1 μg RNA，先用DNaseⅠ(Invitrogen)去除少量的基因組DNA，再用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Real-time PCR采用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒(大連TaKaRa公司)，樣品cDNA(10 ng/μL)2 μL，F(xiàn)/R引物(10 μmol/L)各0.2 μL，反應(yīng)體積10 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在ABI PRISM 7500 real-time PCR系統(tǒng)上進(jìn)行，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)。以O(shè)sGAPDH作內(nèi)參，目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的信息和引物序列參見黃俊寶等[9]，此外脂氧合酶OsLOX6的登錄號(hào)是LOC_Os03g08220，檢測(cè)引物F：5′-CTTCTTCCTGAACGCGATG-3′，R：5′-TCAGATGGAGATGCTGTTGG-3′。每份樣品3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以Microsoft Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)和作圖，差異顯著性分析采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)條件下中花11的穎花開放動(dòng)態(tài)和結(jié)實(shí)率

圖1 試驗(yàn)條件下粳稻中花11的穎花開放動(dòng)態(tài)Fig.1 The floret opening time of Japonica rice cultivar Zhonghua 11 in experiment condition

由于水稻穎花開放容易受到品種基因型和環(huán)境條件的影響，本研究取樣前先考查了試驗(yàn)條件下中花11的穎花開放動(dòng)態(tài)。由圖1可知，試驗(yàn)材料的盛花時(shí)間為11:30，約占日開花總數(shù)的80%，因此以11:30作為穎花開放時(shí)間。正常情況下，水稻花藥開裂與穎花開放是同步進(jìn)行的，否則影響結(jié)實(shí)率。試驗(yàn)材料的結(jié)實(shí)率為(84.6±2.8)%，說明花粉活力和花藥開裂正常。

2.2 花藥開裂時(shí)JA和JA-Ile水平急劇增加

植物細(xì)胞新合成的JA不能直接激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，需進(jìn)一步與異亮氨酸(isoleucine，Ile)結(jié)合形成茉莉脂異亮氨酸(JA-Ile)后，才能誘導(dǎo)下游響應(yīng)基因的表達(dá)[5]。JA-Ile是細(xì)胞內(nèi)JA眾多代謝物之一。為此，本試驗(yàn)同時(shí)測(cè)定花藥JA和JA-Ile的水平。從表1可知，花藥JA水平從開裂前24 h至2 h增加4.1倍，開裂時(shí)花藥JA水平較開裂前2 h增加8.3倍；從開裂前24 h至2 h，花藥JA-Ile水平無顯著變化，但開裂時(shí)花藥JA-Ile水平急劇上升，較開裂前2 h增加55倍。這說明，花藥JA和JA-Ile水平從花藥開裂前2 h起會(huì)急劇上升。開裂時(shí)花藥JA-Ile與JA含量的摩爾比為4.2，表明新形成的JA迅速與異亮氨酸結(jié)合，轉(zhuǎn)變?yōu)镴A-Ile。

表1 水稻花藥開裂前不同時(shí)間點(diǎn)JA和JA-Ile的水平Tab.1 The levels of JA and JA-Ile in rice anthers at different points before splitting

-24 h、-4 h、-2 h及0 h表示花藥開裂24、4、2、0 h；不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著
-24 h,-4 h,-2 h and 0 h mean 24,4,2,0 h before anther dehiscence.Different small letters indicate significant difference at 0.05 level

2.3 花藥開裂前JA代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)變化

圖2 水稻花藥開裂前不同時(shí)間點(diǎn)JA代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)水平 Fig.2 The expression levels of genes related to JA metabolism pathway in rice anthers at different points before splitting

細(xì)胞內(nèi)JA生物合成起始于亞麻酸(a-linolenic acid)，亞麻酸經(jīng)13-LOX、AOS、AOC和OPR3的依次催化和3步β-氧化反應(yīng)(β-oxidation)后，最終生成(3R,7S)-JA[4]。擬南芥lox3lox4雙突變體出現(xiàn)開花時(shí)花藥不開裂的表型[14]，水稻基因組含有6個(gè)13-LOX家族基因，其中與AtLOX3和AtLOX4同源性最高的是OsLOX6，達(dá)到62.8%和64.4%[15]。水稻編碼AOS同工酶的基因?yàn)镺sAOS1和OsAOS2；OsAOS2在成熟花藥中的表達(dá)量非常低[9]，本文也得到相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未給出)，OsAOS2在花藥晚期發(fā)育中應(yīng)該不起主要作用。催化水稻JA生物合成的AOC和OPR3分別由單個(gè)同源基因OsAOC和OsOPR7編碼[8]。從圖2可知，隨著穎花開放的臨近，花藥JA生物合成關(guān)鍵基因OsLOX6、OsAOS1、OsAOC和OsOPR7的表達(dá)量均有一定程度的上升，分別較開裂前24 h增加12、2.4、4.5和2.8倍，其中OsLOX6表達(dá)上調(diào)幅度最大。

在茉莉酸-氨基酸合成酶(JAR1)的催化下，新合成JA與異亮氨酸(Ile)結(jié)合，轉(zhuǎn)變?yōu)镴A信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性形式JA-Ile。擬南芥中該酶由單基因AtJAR1編碼，水稻基因組中與AtJAR1同源的基因?yàn)镺sJAR1和OsJAR2[16]。從開裂前24 h至0 h，花藥OsJAR1的表達(dá)水平略有增加，而OsJAR2的表達(dá)水平急速下降(圖2)。

2.4 花藥開裂前JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)變化

圖3 水稻花藥開裂前不同時(shí)間點(diǎn)COI1同源基因的表達(dá)水平Fig.3 The expression levels of COI1 homologous genes in rice anthers at different points before splitting

JA信號(hào)感知的受體蛋白是COI1，其屬于SCF E3連接酶復(fù)合體的F-box蛋白組分，能特異識(shí)別活性分子JA-Ile，水稻基因組中存在3個(gè)編碼COI1蛋白的家族基因OsCOI1b、OsCOI1a和OsCOI2[17]，花藥開裂時(shí)這3個(gè)基因的表達(dá)水平都略有下降，較開裂前24 h分別降低50%左右(圖3)。

圖4 水稻花藥開裂前不同時(shí)間點(diǎn)OsJAZ家族基因的表達(dá)水平Fig.4 The expression levels of OsJAZs in rice anthers at different points before splitting

JAZ蛋白家族是JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)向調(diào)控因子，在休止?fàn)顟B(tài)(JA-Ile低)，JAZ蛋白與轉(zhuǎn)錄因子(MYC2)結(jié)合，阻礙JA響應(yīng)基因的表達(dá)；在活化狀態(tài)(JA-Ile高)，SCFCOI1召喚JAZ蛋白并將其泛素化，導(dǎo)致JAZ蛋白被26S 蛋白酶體降解，從而啟動(dòng)JA 響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[5]。水稻OsJAZ基因家族共有15個(gè)成員(OsJAZ1-15)，發(fā)揮精細(xì)調(diào)控JA響應(yīng)的作用[18]。從圖4可知，花藥開裂時(shí)OsJAZ1、OsJAZ2、OsJAZ5和OsJAZ15表達(dá)水平下降，其余11個(gè)OsJAZs的表達(dá)水平上升。其中，OsJAZ15下降幅度最大，較開裂前24 h降低7.3倍；OsJAZ10和OsJAZ11上升幅度最大，比開裂前24 h分別升高65和86倍。

3 討 論

花藥開裂為花藥發(fā)育過程中需經(jīng)歷的最后一個(gè)階段，花藥能否適時(shí)開裂直接影響植物的傳粉和受精。JA是調(diào)控雙子葉擬南芥花藥開裂的重要信號(hào)分子。例如，擬南芥JA缺失突變體lox3lox4、opr3、aos以及JA不敏感突變體coi1均表現(xiàn)出開花時(shí)花藥不同步開裂的異?，F(xiàn)象[4,15]。同時(shí)，擬南芥花苞JA水平在接近花藥開裂時(shí)(11-12期)會(huì)顯著上升，較發(fā)育早中期(1-10期)增加6.7倍[19]。早期鑒定的JA缺失突變體hebiba是雄性不育，但它是雄性器官早期發(fā)育缺陷所導(dǎo)致的[20]。近期研究[11]發(fā)現(xiàn)，水稻JA不敏感突變體osjar1也表現(xiàn)出開穎時(shí)花藥不正常開裂的現(xiàn)象。osjar1的穎花JA水平比野生型高3.5倍，但JA-Ile水平比野生型低100倍，即JA-Ile是調(diào)控花藥開裂的的JA信號(hào)分子。本研究表明，水稻花藥開裂時(shí)JA和JA-Ile水平較開裂前2 h分別升高8.3和55倍，這表明花藥臨近開裂前會(huì)產(chǎn)生大量的JA，并迅速轉(zhuǎn)變?yōu)镴A-Ile，佐證了Xiao等[11]的結(jié)果。

雄性不育系珍汕97A花時(shí)零散的現(xiàn)象與漿片OsAOC表達(dá)水平較低引起的JA含量不足有關(guān)[10]，同樣花藥開裂時(shí)OsAOC的表達(dá)水平較開裂前2 h升高2.8，以滿足JA大量合成的需要。新合成的JA轉(zhuǎn)變?yōu)镴A-Ile需要JAR1的催化，OsJAR1和OsJAR2均有此功能，但OsAJAR1的表達(dá)與花器官發(fā)育更密切[11,17]。水稻漿片膨大時(shí)JA含量快速上升，OsJAR1的表達(dá)也相應(yīng)顯著上調(diào)[9]。本研究通過檢測(cè)JA合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)花藥開裂前OsLOX6、OsAOS1、OsAOC和OsOPR7的表達(dá)量均上升，這與花藥JA水平的上升相對(duì)應(yīng)。OsLOX6表達(dá)水平的增加幅度較其他3個(gè)基因大的多，表明上游催化酶的表達(dá)對(duì)JA生物合成的影響更大，這與非誘導(dǎo)植株JA生物合成嚴(yán)格受到底物供給的限制相一致[21]。雖然花藥開裂時(shí)JA-Ile的水平急速上升，但OsJAR1的表達(dá)水平不明顯上調(diào)，OsJAR2表達(dá)水平顯著下調(diào)。這可能與花藥開裂早期OsJAR1的表達(dá)水平就已非常高，OsJAR1的酶活性不是限制JA-Ile形成的主要因素有關(guān)。相關(guān)研究[22]也指出，JAR1雖必需但不是主要調(diào)控位點(diǎn)，前體物JA或OPDA的供應(yīng)對(duì)JA-Ile迸發(fā)有直接影響。

COI1是感知JA-Ile的受體蛋白，多數(shù)情況下JA水平的升高會(huì)促進(jìn)COI1基因的表達(dá)，但在擬南芥花青素積累thf1突變體中JA含量的上升并不相應(yīng)伴隨COI1的上調(diào)表達(dá)[23]。水稻中3個(gè)COI1同源基因OsCOI1a、OsCOI1b和OsCOI2的表達(dá)水平在花藥開裂時(shí)略有下降，并不隨JA-Ile的迸發(fā)而上調(diào)。這表明，JA依賴的花藥開裂主要?dú)w功于JA和JA-Ile水平的大幅上升。JA-Ile信號(hào)引起JAZ抑制蛋白的泛素化途徑降解，從而誘導(dǎo)JA響應(yīng)基因的表達(dá)。JAZ家族蛋白間存在同型或異型的相互作用，形成精細(xì)的JAZs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，響應(yīng)JA特異生理功能。目前發(fā)現(xiàn)OsJAZ1、OsJAZ8、OsJAZ9和OsJAZ10分別參與花器官發(fā)育、抗病性、抗鹽性、莖稈發(fā)育[24]。水稻花藥開裂時(shí)15個(gè)OsJAZs家族成員的表達(dá)差異很大，OsJAZ1、OsJAZ2、OsJAZ5和OsJAZ15表達(dá)水平下降，其余11個(gè)OsJAZs的表達(dá)水平均會(huì)上升?；ㄋ嶰sJAZ10和OsJAZ11的上升幅度最大，比開裂前24 h分別增加了65和86倍。許多研究[5,25]已證實(shí)，JA誘導(dǎo)的JAZ抑制蛋白降解能反饋促進(jìn)JAZ基因的表達(dá)，以補(bǔ)充JAZ庫(kù)。結(jié)果表明，JA信號(hào)誘導(dǎo)的OsJAZ10和OsJAZ11蛋白的快速降解在花藥開裂中發(fā)揮重要調(diào)控作用，后續(xù)將利用分子生物學(xué)手段深入研究。

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