HPLC指紋圖譜鑒定市售土茯苓真?zhèn)渭百|(zhì)量研究

張清峰， 陳繼光， 鄭國棟

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室，江西南昌 330045)

土茯苓是百合科菝葜屬植物光葉菝葜的干燥根莖，為《中華人民共和國藥典》收載的中藥材，也是民間常用的食材，是制作傳統(tǒng)食品龜苓膏的主要原料，也常用于煲湯?！吨腥A人民共和國藥典》記載土茯苓具有除濕、解毒、通利關(guān)節(jié)的功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，土茯苓提取物有抗氧化[2]、降血糖[3]、抑制肝癌細胞增殖和誘導(dǎo)其調(diào)亡的作用[4]，并有獨特的抗慢性炎癥和選擇性免疫抑制作用[5-6]?；瘜W(xué)成分研究表明，落新婦苷、黃杞苷等黃酮成分是土茯苓的主要功效物質(zhì)[7]。2010版《中華人民共和國藥典》以落新婦苷含量評價土茯苓質(zhì)量，要求含量不低于 0.45%[1]，另外土茯苓也含有白藜蘆醇、丁香酸、莽草酸、5-O-咖啡酰莽草酸等芪類及酚酸類物質(zhì)[8-9]。

百合科菝葜屬植物在我國廣泛分布，據(jù)報道有79種之多[10]。《中華人民共和國藥典》收錄菝葜和土茯苓2種中藥，但還有許多都作為地方藥材使用。各地使用土茯苓的歷史沿革不一致，導(dǎo)致市場上出現(xiàn)長期以其他菝葜屬和肖菝葜屬的植物作代用品的現(xiàn)象，如菝葜屬的菝葜、肖菝葜屬的華肖菝葜和短柱肖菝葜等。目前市場流通的土茯苓多為經(jīng)加工制得的飲片，難以從商品藥材性狀作真?zhèn)舞b別，因此各地區(qū)使用的土茯苓藥材質(zhì)量參差不齊，嚴重影響了土茯苓及其制劑的療效。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，不同品牌龜苓膏樣品中來源于土茯苓的黃酮成分落新婦苷含量差異巨大，有些甚至檢測不到[11]。其中一個原因可能是市場上流通的土茯苓質(zhì)量良莠不齊，且偽品眾多，龜苓膏生產(chǎn)廠家可能因缺乏相應(yīng)技術(shù)而誤用了土茯苓偽品或次品。因此，筆者建立了土茯苓的HPLC指紋圖譜，可以方便鑒別土茯苓及其混淆品[12]。本研究收集了市場上流通的54份土茯苓樣品，利用HPLC指紋圖譜方法對其進行真?zhèn)渭百|(zhì)量調(diào)查研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與原料

色譜純乙腈(沃凱)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。落新婦苷標品(≥98%)購自上海同田生物有限公司。54份土茯苓樣品，其中20份購自網(wǎng)絡(luò)(表1樣品序號1～20)，34份購自江西省南昌市及樟樹市實體藥店。其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

HPLC為安捷倫1260系統(tǒng)，配自動進樣器和二極管陣列檢測器。色譜柱為Waters Symmatry C18柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)。

1.3 色譜條件

流動相為乙腈(A)和0.1%醋酸-水(B)；流速為 1 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長291 nm；柱溫40 ℃；線性梯度洗脫程序為0～15 min，16.0%～21.0%(A)；15～40 min，21.0%～40.0%(A)。

1.4 土茯苓供試樣品溶液的制備

土茯苓樣品經(jīng)粉碎后過40目篩，精密稱取粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入25 mL 60%乙醇，密塞后稱質(zhì)量，超聲提取30 min，再稱質(zhì)量，用60%乙醇補足減失的質(zhì)量。上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，作為供試品溶液進行HPLC分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土茯苓指紋圖譜及鑒定標準

本研究前期建立了土茯苓的HPLC標準指紋圖譜，如圖1所示[12]。土茯苓HPLC指紋圖譜中主要有9個色譜峰，通過質(zhì)譜聯(lián)用峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9分別鑒定5-O咖啡酰莽草酸、新落新婦苷、落新婦苷、花旗松素、新異落新婦苷、異落新婦苷、黃杞苷、異黃杞苷、白黎蘆醇[12]，各化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2所示。峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰7為所有土茯苓樣品的共有色譜峰，而峰4、峰8、峰9在一些樣品中因含量過低，可能檢測不到[13]。因此，在土茯苓樣品真?zhèn)舞b定過程中，樣品色譜圖與土茯苓標準指紋圖譜一致或同時含有峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰7的判定為土茯苓，否則判定為偽品。通過DAD檢測器，可同時獲得各峰的紫外吸收圖譜用于與指紋圖譜對照，峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8的紫外吸收圖類似，都在290 nm有最大吸收，因為它們都是二氫黃酮類物質(zhì)；峰1的最大吸收波長為 327 nm，峰9的最大吸收波長為330 nm(圖3)。

2.2 土茯苓落新婦苷含量測定

《中華人民共和國藥典》2010版以落新婦苷含量評估土茯苓質(zhì)量，要求含量不低于0.45%。將不同濃度的落新婦苷標準溶液按“1.3”節(jié)色譜條件進行分析，以落新婦苷的峰面積(y)與相對應(yīng)的濃度(x)進行線性回歸分析，得定量回歸方程：y=18.6x-0.2；r2=0.993，用于土茯苓樣品中落新婦苷含量測定。

2.3 市售土茯苓真?zhèn)渭百|(zhì)量判定結(jié)果

將54批市售土茯苓制得的樣品溶液按“1.3”節(jié)的色譜條件進行HPLC分析，獲得的液相色譜圖按“2.1”節(jié)進行真?zhèn)闻卸?。?結(jié)果表明，54份樣品中有13個樣品經(jīng)指紋圖譜分析為偽品，占24.1%。其中網(wǎng)購樣品中有5個，占網(wǎng)購樣品的25%；實體藥店購買的有8個，占實體店所購樣品的23.5%。由此可知，市售土茯苓中約1/4為偽品，且網(wǎng)店與實體藥店所售土茯苓偽品比例相當。部分土茯苓偽品的液相色譜圖見圖4。將這些偽品粉碎后混入飼料給小鼠喂食，部分偽品會引起小鼠中毒死亡。

將色譜圖中峰3的峰面積按“2.2”節(jié)中落新婦苷的定量標準線換算，獲得土茯苓中落新婦苷含量。2010版《中華人民共和國藥典》規(guī)定土茯苓飲片中落新婦苷的含量不能低于0.45%[1]。對54批土茯苓樣品測定結(jié)果表明，落新婦苷含量參差不齊，差異巨大，含量范圍為0.042%～3.063%。只有24個土茯苓樣品符合《中華人民共和國藥典》落新婦苷含量規(guī)定，合格率僅為44.4%。其中通過網(wǎng)絡(luò)購買的有9個，占所有網(wǎng)購樣品的45%；實體藥店購買的有15個，占實體藥店樣品的44.1%，網(wǎng)店與實體藥店所售土茯苓質(zhì)量無差異。

根據(jù)土茯苓真?zhèn)渭百|(zhì)量判定結(jié)果，市售土茯苓樣品中，接近1/4為偽品，超過半數(shù)質(zhì)量不符合2010版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的標準。土茯苓是常用的中藥及食品原料，中藥講究配伍，質(zhì)量不符合要求的土茯苓會影響療效，而偽品甚至?xí)碇卸镜娘L(fēng)險。筆者前期對龜苓膏樣品的分析結(jié)果表明，一些標簽中注明使用了土茯苓原料的龜苓膏樣品中檢測不到落新婦苷，不同品牌龜苓膏樣品中落新婦苷含量差異巨大[12]。市售土茯苓偽品眾多、質(zhì)量良莠不齊可能是造成這一現(xiàn)象的原因。而筆者建立的土茯苓指紋圖譜可以很好地幫助廠家解決土茯苓原料質(zhì)量問題。

表1 54批土茯苓樣品真?zhèn)渭百|(zhì)量判定結(jié)果

3 結(jié)論

通過土茯苓HPLC標準指紋圖譜對54批市售土茯苓樣品進行真?zhèn)舞b定和質(zhì)量判定，結(jié)果表明土茯苓偽品比例為24.1%，符合《中華人民共和國藥典》質(zhì)量要求的土茯苓僅為樣品總數(shù)的44.4%。部分土茯苓偽品喂食小鼠后甚至有中毒死亡現(xiàn)象。土茯苓是常用的中藥及食品原料。市售土茯苓偽品眾多、質(zhì)量良莠不齊是一個亟待解決的問題。土茯苓指紋圖譜方法簡便、準確，可為土茯苓的真?zhèn)舞b別及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：17-18.

[2]Zhang Q F，Zhang Z R，Cheung H Y. Antioxidant activity ofRhizomaSmilacisGlabraeextracts and its key constituent-astilbin[J]. Food Chemistry，2009，115(1)：297-303.

[3]Fukunaga T，Miura T，F(xiàn)uruta K，et al. Hypoglycemic effect of the rhizomes ofSmilaxglabrain normal and diabetic mice[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin，1997，20(1)：44-46.

[4]Sa F，Gao J L，F(xiàn)ung K P，et al. Anti-proliferative and pro-apoptotic effect ofSmilaxglabraRoxb. extract on hepatoma cell lines[J]. Chemico-Biological Interactions，2008，171(1)：1-14.

[5]Jiang J，Wu F，Lu J，et al. Anti-inflammatory activity of the aqueous extract fromRhizomaSmilacisGlabrae[J]. Pharmacological Research，1997，36(4)：309-314.

[6]Jiang J Y，Xu Q. Immunomodulatory activity of the aqueous extract from rhizome ofSmilaxglabrain the later phase of adjuvant-induced arthritis in rats[J]. Journal of Ethnopharmacology，2003，85(1)：53-59.

[7]張清峰，張漢揚，上官新晨，等. 高效液相法同時測定土茯苓中五種多酚成分[J]. 現(xiàn)代食品科技，2013，29(9)：2275-2278.

[8]Zhang Q F，Li S C，Lai W P，et al.β- cyclodextrin facilitates simultaneous analysis of six bioactive components inRhizomaSmilacisGlabraeby capillary zone electrophoresis[J]. Food Chemistry，2009，113(2)：684-691.

[9]Chen L，Yin Y，Yi H，et al. Simultaneous quantification of five major bioactive flavonoids inRhizomaSmilacisGlabraeby high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2007，43(5)：1715-1720.

[10]Chen X，Tetsuo K. Flora of China[M]. Beijing：Science Press，St Louis：Missouri Botanical Garden Press，2000：96-115.

[11]Zhang Q F，Cheung H Y. The content of astilbin and taxifolin in concentrated extracts ofRhizomaSmilacisGlabraeand turtle jelly vary significantly[J]. Food Chemistry，2010，119(3)：907-912.

[12]Zhang Q F，Cheung H Y，Zeng L B. Development of HPLC fingerprint for species differentiation and quality assessment ofRhizomaSmilacisGlabrae[J]. Journal of Natural Medicines，2013，67(1)：207-211.