桑樹潛在致敏原鑒定與生物信息學分析

劉 潮， 韓利紅， 宋培兵， 張亞萍， 唐利洲

(曲靖師范學院云南高原生物資源保護與利用研究中心/云南省高校云貴高原動植物多樣性及生態(tài)適應性進化重點實驗室，云南曲靖 655011)

過敏屬于世界性的健康問題，植物來源的過敏原能引起人類的Ⅰ型過敏反應，人們既可以從上呼吸道吸入，也可以通過存在于種類繁多的植物食品中的過敏原引起食物過敏反應。近年來，食物過敏的患病率有所上升，在西方國家中，多達8%的幼兒和2%的成人受到影響[1]。桑樹是一種常見的落葉樹種，其葉片多汁，是桑蠶的主要飼料，曾有報道指出，桑樹花粉能引起呼吸過敏反應和接觸性蕁麻疹[2]。桑樹的果實桑葚能直接食用或用作釀酒原料，也是常用的中草藥成分，過敏者食用桑葚能引發(fā)全身性蕁麻疹，導致呼吸困難、胸悶和腹絞痛等[3]。

致敏原屬于多個蛋白家族，結構復雜、功能多樣。編碼序列和致敏原的三維(three dimensional，簡稱3D)結構對引起致敏性至關重要。大多數(shù)過敏原都比較小、穩(wěn)定、結構良好，這些蛋白質家族多為種子貯藏蛋白、結構蛋白和防御相關的蛋白質——病程相關蛋白。序列或結構相似的蛋白容易引發(fā)免疫球蛋白E(IgE)交叉反應，可以通過電腦模擬的方法預測其致敏性。計算工具能相當精確和快速地預測變應原分子的表位位置，并將其用于確定分子結構，從而確定B細胞表位[4]。在本研究中，篩選了63個桑樹潛在致敏原，分為13個家族。這些潛在的抗原表位的IgE結合殘基的功能研究將為后續(xù)研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 致敏原蛋白序列的獲取

2016年10月，筆者通過食物過敏研究和資源計劃(FARRP)的致敏原蛋白質數(shù)據(jù)庫(www.allergenonline.org)和致敏原命名委員會官方網(wǎng)站(http：//www.allergen.org/index.php)，下載了截至2016年8月4日公布的705條植物和真菌致敏原蛋白序列數(shù)據(jù)。

1.2 桑樹潛在致敏原的篩選

以致敏蛋白全序列為探針，通過Blast桑樹(Morusnotabilis)蛋白數(shù)據(jù)庫，根據(jù)序列間的相似性篩選潛在的桑樹致敏蛋白。桑樹潛在致敏蛋白選擇閾值為序列一致性(identity)≥60%[5]和E值≤10-20(www.allergenonline.org)。

1.3 桑樹潛在致敏原的結構和功能分析

利用UniProt數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/)對篩選的潛在致敏原蛋白進行結構域和基因本體(gene ontology，簡稱GO)功能分類分析。利用WEGO在線軟件(Web Gene Ontology Annotation Plotting，http：//wego.genomics.org.cn/)對蛋白GO富集度進行計算。

1.4 桑樹潛在致敏原的三級結構預測

蛋白同源三級結構模型用Swiss-Model[6]構建完成。3D結構的可視化使用VMD 1.8.5 (http：//www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/vmd-1.8.5/)完成。

2 結果與分析

2.1 桑樹潛在致敏原的篩選

以從FARRP和Allergome數(shù)據(jù)庫上下載的致敏原蛋白為探針，BLAST桑樹蛋白數(shù)據(jù)庫，以序列一致性(identity)≥60%和E值≤10-20為篩選條件，共獲得143條桑樹潛在致敏原(其中4條注釋為Allergen的序列低于篩選條件)，詳見表1。

2.2 桑樹潛在致敏原的功能分類

GO注釋將基因產(chǎn)物分為細胞組分、分子功能和生物過程3類，可以對基因及其蛋白的功能進行分類以了解其功能。在143條桑樹潛在致敏原中，有113條具有GO功能注釋，分析發(fā)現(xiàn)71條不同的GO注釋子條目，7類GO子分類基因作為細胞結構組分起作用，其中參與細胞和細胞部分組成的均占46.4%，參與細胞器結構成分的占32.1%。在分子功能分類中，具有結合功能的蛋白占67.9%，具有催化活性的蛋白占25.0%，具有結構分子活性的蛋白占14.3%。13類GO子分類基因參與了生物學過程，其中參與細胞過程的占39.3%，參與代謝過程的占28.6%，參與應激反應的占23.2%(圖1)。

2.3 桑樹潛在致敏原的家族分布

在143條桑樹潛在致敏原中共查詢到172個pfam保守功能域，分屬于49個pfam家族(圖2)，根據(jù)其所屬pfam家族共分為22類(表1)。其中熱休克蛋白家族含有HSP70(PF00012)、HSP20(PF00011)和HSP90(PF00183)3類結構域，共有25條序列，該類蛋白是蛋白質折疊復合體的重要成分，可保護植物免受脅迫的損傷[7]，關于該家族成員致敏原活性的報道較少。含有Profilin(PF00235)功能域的有3條序列，且與已知致敏原序列一致性較高，該類蛋白在調節(jié)肌動蛋白聚合中起作用，在多種植物的花粉、果實或種子中具有致敏原活性。肽基脯氨酰順反異構酶(Pro_isomerase，編號PF00160)，也稱為親環(huán)素(cyclophilin)，在哺乳動物中是免疫抑制劑環(huán)孢素A(CsA)的主要靶細胞組分，也具有分子伴侶和細胞信號轉導的功能，桑樹潛在致敏原中有12個成員含有Pro_isomerase功能域。類甜蛋白(thaumatin-like protein，簡稱TLP)是一類能響應脅迫的蛋白家族，多種植物水果或花粉的TLPs具有致敏原活性[8]，桑樹有4個潛在的TLP致敏原成員。捕光色素A-B結合蛋白在植物光合作用中發(fā)揮重要作用，在芹菜中的Api g 3具有致敏原活性[9]，桑樹潛在致敏原中有5個成員具有Chloroa_b-bind(PF00504)功能域。

有部分序列同時含有多個功能域，如L484_024225同時含有HSP90(PF00183)和HATPase_c(PF02518)2個功能域，L484_020224同時含有Glyco_hydro_18(PF00704)和Thaumatin(PF00314)2個功能域，L484_006986則同時含有Glyco_hydro_17(PF00332)、Pkinase(PF00069)和Profilin(PF00235)3個功能域。

2.4 桑樹潛在致敏原的結構和功能分析

蛋白初級結構是高級結構的基礎，具有序列相似性的蛋白，其三維結構可能有明顯不同，蛋白序列或結構，尤其是高級結構在其發(fā)揮功能過程中起決定作用，蛋白三維結構表層的氨基酸殘基具有參與致敏活性的可能。Ⅰ型致敏原具有多樣的生理生化特征、多樣的初級結構和三維結構。蛋白質只有正確折疊，才具有生物學活性，為充分了解桑樹潛在致敏原的致敏潛力，筆者以部分蛋白質為例，構建了蛋白質三維模型，以便更準確地了解蛋白質的致敏性。

表1 桑樹潛在致敏原蛋白信息

續(xù)表1

基因編號E值相似度(%)致敏原物種蛋白注釋L484_0060231.00×10-6470Cas s 9歐洲栗胞質Ⅰ型小熱激蛋白L484_0060263.00×10-6773Cas s 9歐洲栗胞質Ⅰ型小熱激蛋白L484_0060316.00×10-6369Cas s 9歐洲栗胞質Ⅰ型小熱激蛋白L484_0060324.00×10-5868Cas s 9歐洲栗胞質Ⅰ型小熱激蛋白L484_0060332.00×10-6162Cas s 9歐洲栗胞質Ⅰ型小熱激蛋白L484_0060345.00×10-7368Cas s 9歐洲栗胞質Ⅰ型小熱激蛋白L484_0252137.00×10-7382Cas s 9歐洲栗胞質Ⅰ型小熱激蛋白L484_0252147.00×10-8180Cas s 9歐洲栗胞質Ⅰ型小熱激蛋白L484_0252151.00×10-7376Cas s 9歐洲栗胞質Ⅰ型小熱激蛋白乙二醛酶 (PF00903):乙二醛酶,博來霉素抗性蛋白,雙加氧酶超家族L484_0180491.00×10-16377Ory s GLO I水稻乙二醛酶L484_0072412.00×10-15271Ory s GLO I水稻乙二醛酶L484_0036614.00×10-16176Ory s GLO I水稻乙二醛酶L484_0003611.00×10-4573Ory s GLO I水稻乙二醛酶Chloroa_b-bind (PF00504):葉綠素a/b結合蛋白L484_0187397.00×10-11867Api g 3白芹葉綠素a/b結合蛋白L484_0200162.00×10-15077Api g 3白芹葉綠素a/b結合蛋白L484_0138664.00×10-16284Api g 3白芹葉綠素a/b結合蛋白L484_0028557.00×10-17488Api g 3白芹葉綠素a/b結合蛋白L484_0028568.00×10-17387Api g 3白芹葉綠素a/b結合蛋白HATPase_c (PF02518)/HSP90 (PF00183):組氨酸激酶,DNA螺旋酶B和類熱激蛋白P90 ATP酶L484_020213065Asp f 12煙曲霉熱激蛋白 P90L484_024225067Asp f 12煙曲霉熱激蛋白 P90L484_024226067Asp f 12煙曲霉熱激蛋白 P90EF-hand_7 (PF13499):EF手型結構域(EF-hand domain pair)L484_0272301.00×10-4277Ole e 3油橄欖鈣結合花粉致敏原(Polcalcin)L484_0062373.00×10-3070Phl p 7梯牧草PolcalcinL484_0272322.00×10-2063Phl p 7梯牧草PolcalcinRibosomal_L12(IPR027534)/Ribosomal_L3 (PF00297):核糖體蛋白L12和L3L484_0032568.00×10-2760Alt a 12鏈格孢60S酸性核糖體蛋白L484_0137778.00×10-3375Pru du 5扁桃60S酸性核糖體蛋白L484_0090002.00×10-4077Pru du 5扁桃60S酸性核糖體蛋白L484_001372068Asp f 23煙曲霉60S核糖體蛋白L3L484_004471067Asp f 23煙曲霉60S核糖體蛋白L3Glyco_hydro_17 (PF00332):糖基水解酶家族17/ 內切-1,3-β-葡萄糖苷酶L484_0006001.00×10-3363Ole e 10油橄欖葡聚糖內酯-1,3-β-葡萄糖苷酶L484_0252355.00×10-3460Ole e 10油橄欖葡聚糖內酯-1,3-β-葡萄糖苷酶L484_0118592.00×10-3260Ole e 10油橄欖葡聚糖內酯-1,3-β-葡萄糖苷酶L484_003338066Ole e 9油橄欖葡聚糖內酯-1,3-β-葡萄糖苷酶L484_027431065Ole e 9油橄欖葡聚糖內酯-1,3-β-葡萄糖苷酶L484_0165656.00×10-13563Hev b 2橡膠樹葡聚糖內酯-1,3-β-葡萄糖苷酶L484_0165742.00×10-15160Hev b 2橡膠樹葡聚糖內酯-1,3-β-葡萄糖苷酶L484_004210069Hev b 2橡膠樹葡聚糖內酯-1,3-β-葡萄糖苷酶Glyco_hydro_18(PF00704):糖苷水解酶家族18L484_0224812.00×10-8266Hev b 14橡膠樹酸性內切幾丁質酶L484_0224821.00×10-8770Hev b 14橡膠樹酸性內切幾丁質酶L484_0202241.00×10-8463Hev b 14橡膠樹酸性內切幾丁質酶L484_0114862.00×10-10280Hev b 14橡膠樹酸性內切幾丁質酶Pro_isomerase (PF00160):親環(huán)素型肽基脯氨酰順反異構酶/ CLDL484_0160611.00×10-6974Sola l 5番茄親環(huán)素L484_0249571.00×10-11188Cat r 1長春花親環(huán)素L484_0160632.00×10-10681Cat r 1長春花親環(huán)素L484_0160643.00×10-6081Cat r 1長春花親環(huán)素

續(xù)表1

基因編號E值相似度(%)致敏原物種蛋白注釋L484_0138973.00×10-3662Asp f 27煙曲霉親環(huán)素L484_0245325.00×10-9776Sola l 5番茄親環(huán)素L484_0087156.00×10-2768Cat r 1長春花親環(huán)素L484_0220051.00×10-8571Sola l 5番茄親環(huán)素L484_0023812.00×10-2461Asp f 27煙曲霉親環(huán)素L484_0174751.00×10-7266Asp f 27煙曲霉親環(huán)素L484_0239734.00×10-6660Sola l 5番茄親環(huán)素L484_0275742.00×10-7162Cat r 1長春花親環(huán)素Pkinase(PF00069)/ Usp(PF00582)/ Pkinase_Tyr (PF07714):蛋白激酶結構域,絡氨酸激酶L484_0082132.00×10-15064Sal k 2豬毛菜蛋白激酶L484_0198637.00×10-14561Sal k 2豬毛菜蛋白激酶L484_0138435.00×10-13960Sal k 2豬毛菜蛋白激酶L484_0134664.00×10-15765Sal k 2豬毛菜蛋白激酶L484_0030017.00×10-15664Sal k 2豬毛菜蛋白激酶TIM(PF00121):磷酸丙糖異構酶L484_0249516.00×10-11161Tri a 31普通小麥磷酸丙糖異構酶L484_0252393.00×10-12474Tri a 31普通小麥磷酸丙糖異構酶L484_0107433.00×10-14978Tri a 31普通小麥磷酸丙糖異構酶Pectinesterase(PF01095)/ PMEI(PF04043):植物轉化酶/ 果膠甲基酯酶抑制劑L484_0255947.00×10-13666Act d 7美味獼猴桃果膠酯酶L484_0104671.00×10-14960Sal k 1豬毛菜果膠酯酶L484_0007993.00×10-14265Act d 7美味獼猴桃果膠酯酶L484_0111205.00×10-13175Act d 7美味獼猴桃果膠酯酶L484_0111155.00×10-13762Act d 7美味獼猴桃果膠酯酶L484_0111182.00×10-13160Act d 7美味獼猴桃果膠酯酶L484_0111191.00×10-13563Act d 7美味獼猴桃果膠酯酶其他Pfam家族L484_0090416.00×10-6151Alt a 7鏈格孢YCP4 蛋白L484_0251346.00×10-12274Tri a 32普通小麥1-Cys過氧化還原酶L484_0139581.00×10-10667Cand a 3白念珠菌1-Cys過氧化還原酶L484_0000528.00×10-5095Sal k 3豬毛菜不依賴于維生素B12的甲硫氨酸合成酶L484_0000341.00×10-3691Sal k 3豬毛菜不依賴于維生素B12的甲硫氨酸合成酶L484_009365089Sal k 3豬毛菜不依賴于維生素B12的甲硫氨酸合成酶L484_003436076Sal k 3豬毛菜不依賴于維生素B12的甲硫氨酸合成酶L484_019026065Sola l 2番茄酸性β-呋喃果糖苷酶L484_0138872.00×10-10960Mus a 2小果野蕉Ⅰ類幾丁質酶L484_0042735.00×10-3661Act d 4美味獼猴桃?guī)€基蛋白酶抑制劑L484_023933073Tri a 34普通小麥甘油醛-3-磷酸脫氫酶L484_006727087Tri a 34普通小麥甘油醛-3-磷酸脫氫酶L484_006912087Tri a 34普通小麥甘油醛-3-磷酸脫氫酶L484_0176563.00×10-15767Tri a 34普通小麥甘油醛-3-磷酸脫氫酶L484_0095762.00×10-2363Tri a 41普通小麥NFKB 1線粒體泛素連接酶活化子L484_0170681.00×10-7680Cor a 13歐洲榛油質蛋白L484_0205536.00×10-6563Cor a 12歐洲榛油質蛋白L484_0039562.00×10-14461Hev b 7橡膠樹馬鈴薯塊莖特異蛋白L484_0039582.00×10-15461Hev b 7橡膠樹馬鈴薯塊莖特異蛋白L484_0132392.00×10-15261Hev b 7橡膠樹馬鈴薯塊莖特異蛋白L484_0255024.00×10-4460Cur l 3新月彎孢菌細胞色素CL484_0106767.00×10-12578Pis v 4阿月渾子超氧化物歧化酶L484_0112252.00×10-13186Hev b 10橡膠樹超氧化物歧化酶L484_003380064Sola l 2番茄β-呋喃果糖苷酶L484_0081962.00×10-15570Pyr c 5西洋梨異黃酮還原酶相關蛋白L484_009016086Bet v 6疣皮樺苯基香豆素芐基醚還原酶

續(xù)表1

基因編號E值相似度(%)致敏原物種蛋白注釋L484_0102551.00×10-3281Pru p 7巴旦木赤霉素調節(jié)蛋白L484_0114262.00×10-5283Tri a 45普通小麥延伸因子ⅠL484_0115004.00×10-2873Pru p 7巴旦木赤霉素調節(jié)蛋白L484_0131725.00×10-5673Hum j 1葎草未知蛋白L484_0185642.00×10-18080Pyr c 5西洋梨異黃酮還原酶相關蛋白L484_0185654.00×10-18079Pyr c 5西洋梨異黃酮還原酶相關蛋白

Bet v 1成員屬于PR10家族，在植物的花粉、種子和果實中高表達，在多種植物的花粉和果實中具有過敏原活性[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，桑葚中的1個17 ku蛋白疑似PR10家族的Bet v 1，是主要的過敏原[3]。Bet v 1的二級結構元件構成1個大的疏水口袋，具有儲存或載體蛋白的功能[11]，能夠結合黃酮類化合物[12]。在本研究中，4個已被初步鑒定為致敏原的成員屬于該家族，具有引起患者致敏反應的潛力。L484_001696的3-D結構模型具有典型的Bet v 1三級結構，進一步說明該家族桑樹潛致敏原具有致敏潛力，值得深入研究。

TLP屬于植物病程相關蛋白第5家族，能被多種脅迫誘導表達，在多種水果和作物中具有過敏原活性[8，13-14]。TLP蛋白3D結構中的功能域Ⅱ表現(xiàn)出非常保守的構象，預測這些氨基酸序列為主要的IgE結合表位[15]。L484_022590蛋白具有保守結構域THN，其三級結構由3個功能域組成：Domain Ⅰ為N端核心功能域，由2個反向平行的β片層組成；Domain Ⅱ由半胱氨酸二硫鍵形成的3個較短的α螺旋構成；Domain Ⅲ由2個β折疊和1個大環(huán)構成[15]。桑樹中有4個蛋白與致敏蛋白Pru p 2具有60%以上的序列一致性。預測的L484_022590三維結構(圖3)與典型TLP非常相似，其具體致敏活性值得研究。

RlpA-like_DPBB家族包含保守的DPBB(double-psi beta-barrel)折疊，DPBB功能域的N端常常連接花粉致敏原[16]。Kiwellin是獼猴桃中重要的富含半胱氨酸的RlpA-like_DPBB家族致敏原蛋白，來自綠色獼猴桃的Act d 5蛋白大約為22 ku，由N端kissper功能域和C端KiTH功能域組成，其中后者又由具有2個擴展環(huán)的6個β片層構成的筒體構成[17]。本研究中搜索到5個桑樹潛在致敏原與獼猴桃Act d 5具有高度一致性。L484_007509的三維結構具有典型的kissper和KiTH功能域，具有致敏潛力。

幾丁質結合蛋白家族屬于碳水化合物結合結構域家族18(carbohydrate-binding module family 18，簡稱CBM18)，具有幾丁質識別或結合活性，存在于多種植物與真菌中，能結合N-乙酰葡萄糖胺[18]。該家族成熟蛋白N端的Chitin bind 1(PF00187)功能域能識別或結合幾丁質亞基。本研究中發(fā)現(xiàn)4個該家族桑樹潛在致敏原蛋白，與小果野蕉Mus a 2或巴西橡膠Hev b 6序列一致性均達70%以上，并構建了L484_024568的三維結構(圖3)。

EF-hand家族屬于鈣結合蛋白，EF-hand基序包含螺旋-環(huán)-螺旋拓撲結構，能在環(huán)上結合鈣離子。源自藜、狗牙根、油橄欖和貓尾草等植物花粉中的EF-hand家族成員具有致敏原活性。本研究發(fā)現(xiàn)，2個桑樹潛在過敏原屬于該家族，構建了L484_027230蛋白三維結構(圖3)，這些成員具有典型EF-hand家族蛋白的類似結構，很可能在桑樹的花粉中具有致敏原活性。

3 討論與結論

過敏性疾病是臨床上的常見病癥，因此，過敏反應性疾病的診斷和治療的關鍵是分離和鑒定出引發(fā)過敏反應的致敏原。傳統(tǒng)鑒定和獲得致敏蛋白的方法需要經(jīng)過表達、純化、結晶、磁共振或X射線衍射等復雜的試驗步驟，在實際操作中會遇到諸多問題。目前，隨著基因組和蛋白質組數(shù)據(jù)的增加，以及生物信息學的發(fā)展，出現(xiàn)了多種比對和結構建模的軟件，這些預測結果大大縮減了科研工作量，使研究工作更有針對性。

植物花粉和果實過敏的發(fā)病率都很高，目前在很多植物中已經(jīng)鑒定出多種植物源致敏原。桑樹花粉和果實均能引起人的過敏反應[2-3]，而對桑樹致敏原的研究較少。全面了解桑樹內源性致敏原，包括致敏原的種類和數(shù)量、致敏原的時空表達特征等，對于桑樹過敏癥和交叉反應的診斷具有重要的參考價值。本研究以已知致敏原序列為探針，搜索桑樹蛋白質數(shù)據(jù)庫，共獲得143條潛在致敏原序列。GO注釋顯示，它們屬于細胞部分，參與細胞過程，說明它們主要為細胞建成成分，參與了重要的細胞生物學功能，具有結合活性，參與代謝過程和應激反應，說明這些蛋白能與其他組分結合，可能具有抗原抗體結合活性，是這些蛋白具有致敏性的重要前提。

桑樹致敏原蛋白結構多樣，本研究共查詢到77個pfam保守結構域，主要包括HSP70、Profilin、Tubulin、Tubulin_C、Bet_v_1、Chloroa_b-bind和RlpA-like_DPBB結構域等。其中Bet v 1家族、Profilin家族、Thaumatin家族、kiwellin家族是較常見的致敏原類型，在多種植物的花粉和果實中具有過敏原活性[10，13-14，17]，有些蛋白具有抗真菌活性。本研究中發(fā)現(xiàn)了多個桑樹潛在致敏原成員屬于這些家族，其蛋白與已鑒定的致敏原蛋白具有較高的序列一致性，其三級結構與已鑒定的致敏原蛋白結構類似，其致敏潛力值得深入研究。本研究也發(fā)現(xiàn)，部分桑樹潛在致敏原蛋白屬于糖基水解酶、糖苷水解酶和果膠酯酶家族，這些酶類參與了重要的細胞進程，關于其致敏原活性的報道較少，主要在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

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