分子編寫育種——動物育種的發(fā)展方向

劉志國，王冰源，牟玉蓮，魏泓，陳俊海，李奎

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分子編寫育種——動物育種的發(fā)展方向

劉志國1，王冰源1，牟玉蓮1，魏泓2，陳俊海3，李奎1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193，2陸軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物教研室，重慶 400038，3深圳市金新農(nóng)科技股份有限公司，廣東深圳 518106)

隨著基因組學(xué)、基因組編輯技術(shù)的迅速發(fā)展以及顯微注射技術(shù)、體細胞克隆技術(shù)的廣泛應(yīng)用，一套新型的育種策略和方法已經(jīng)逐漸形成。這一套新型育種策略和方法可以稱為分子編寫育種（breeding by molecular writing, BMW）。該方法可以高效創(chuàng)制新的遺傳標記并對其進行快速驗證，也可以對基因組進行精確到分子水平的編寫并定向培養(yǎng)新品種，不僅能打破生殖隔離，跨物種的引入新的性狀，更可以對物種內(nèi)個體間基因組進行精確到單個堿基的插入、刪除和替換。如外源基因的精確整合，內(nèi)源基因的精確刪除、替換，SNP位點的復(fù)制、刪除或替換等。該技術(shù)的優(yōu)點是：可以在極大的降低非預(yù)期效應(yīng)的同時，快速高效的將多種有益性狀聚合到同一品種內(nèi)。分子編寫可進行以下四方面工作：（1）新型育種標記的創(chuàng)制及驗證；（2）跨物種分子編寫；（3）基因組中堿基序列的刪除；（4）物種內(nèi)分子編寫。該育種技術(shù)可以不通過有性雜交，只引入一個或幾個目標基因或SNP，快速獲得目標性狀突出的遺傳穩(wěn)定新種質(zhì)，然后結(jié)合常規(guī)育種方法育成新品種。該方法將實現(xiàn)真正的個體和群體水平的基因（或分子）雜交育種，獲得分子雜種優(yōu)勢，能夠高效的解決長久以來困擾育種工作的諸多難題，大大提高育種效率，尤其在畜禽育種中具有重要應(yīng)用前景，將會是未來育種的發(fā)展方向。文章詳細論述了分子編寫育種技術(shù)的基本概念、研究手段、研究內(nèi)容、研究現(xiàn)狀并展望了該技術(shù)的應(yīng)用前景，為動物育種、畜禽繁殖等領(lǐng)域的研究及從業(yè)人員提供了參考。

育種；分子編寫；基因編輯；體細胞核移植；基因敲除

隨著基因組編輯技術(shù)，尤其是規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列/規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列關(guān)聯(lián)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas）[1-2]技術(shù)的出現(xiàn)和廣泛應(yīng)用，利用基因編輯技術(shù)對基因組進行精確修飾，并通過顯微注射技術(shù)、體細胞克隆技術(shù)、胚胎移植技術(shù)獲得基因編輯動物個體或群體已經(jīng)越來越普遍[3]。這一方法不僅在基因功能研究、疾病模型動物制備等方面有著重要的應(yīng)用意義，更在畜禽動物新品種培育方面具有重要的經(jīng)濟價值，市場前景十分廣闊。利用基因組編輯技術(shù)進行育種，需要一系列與傳統(tǒng)育種以及轉(zhuǎn)基因育種既有聯(lián)系又有區(qū)別的新理念、新策略和新方法，筆者將這一套策略和方法稱之為分子編寫育種（breeding by molecular writing, BMW），這一育種方法具有重要的經(jīng)濟價值和市場前景，利用好這一套新的育種方法不僅有助于快速培育畜禽動物新品種，而且會改變現(xiàn)有的育種方式，并將對世界范圍內(nèi)的畜禽養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生重要的影響。

本文將詳細論述常規(guī)動物育種技術(shù)的現(xiàn)狀和難點以及分子編寫育種方法的基本概念、研究手段、研究內(nèi)容、研究現(xiàn)狀并展望其發(fā)展前景和對育種工作的影響，為動物育種、畜禽養(yǎng)殖以及相關(guān)政策制定提供參考。

1 動物育種的現(xiàn)狀與難點

培育動物新品種的主要方式是雜交育種和選擇育種。以豬的育種為例，所有的現(xiàn)代種豬幾乎都是通過不同品種的豬雜交并長期選育而成的[4]?！队蟀倏迫珪酚涊d“現(xiàn)在歐洲的豬種，是當?shù)刎i種與中國豬雜交而成”。比如著名的約克夏豬（Yorkshire）和巴克夏豬（Berkshire）都是將廣東豬種和英國當?shù)刎i種雜交，并經(jīng)過長期選育而形成的。美國的切斯特白豬（Chester White）、波中豬（Poland China）則是在1817年引進華南豬雜交改良并長期選育而成。

雜交育種為動物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展做出了巨大的貢獻。中國從20世紀50年代開始，開展了廣泛的“土洋”豬雜交育種。通過地方品種與引進品種的雜交，把引進品種的瘦肉率高、日增重快、飼料轉(zhuǎn)化率好的特點與我國地方品種的繁殖力高、肉質(zhì)好、適應(yīng)性強的特點結(jié)合在后代中，再通過連續(xù)不斷的選擇，培育出大量優(yōu)質(zhì)、高效的生豬新品系和配套系。而且到目前為止，雜交技術(shù)也是一項在常規(guī)的商品豬生產(chǎn)中廣泛使用的技術(shù)，用于生產(chǎn)各種經(jīng)濟性狀均較為理想的雜種商品豬，如杜長大三元雜交豬等。

但是雜交育種存在明顯的不足。一是不同品種豬雜交后，后代在引入優(yōu)質(zhì)基因的同時，也引入了大量劣性基因，為了選育出優(yōu)良的雜交后代，必須配備大量的人力并長期進行觀察和測定。這種選育過程要不斷持續(xù)幾十年之久。如今風(fēng)靡世界的長白豬、大白豬等著名品種，都是經(jīng)過將近百年的選育才培育成功。漫長的選育過程導(dǎo)致動物新品種培育的人力成本、時間成本和經(jīng)濟成本居高不下。

二是常規(guī)的選育方法無法對那些難以觀察和測定的復(fù)雜性狀進行選育。比如抗病性狀在不發(fā)病時無法觀察，而在持續(xù)攻毒的條件下進行測定和選育又會對養(yǎng)殖場造成巨大的感染風(fēng)險。另外測定成本較高的飼料轉(zhuǎn)化率性狀、肉質(zhì)性狀以及低遺傳力的繁殖力等性狀，用常規(guī)育種方法進行選育不僅成本高、可操作性差，而且選育進展也比較緩慢。隨著環(huán)保要求以及消費水平的不斷提升，規(guī)?；B(yǎng)殖和優(yōu)良肉質(zhì)品種將是未來動物養(yǎng)殖業(yè)的普遍需求，這就要求動物新品種的培育要向高抗病能力、優(yōu)良肉質(zhì)等方向發(fā)展，而這兩方面恰恰是常規(guī)選育方法無法發(fā)揮其長處的地方。

三是雜交育種本身的規(guī)律就決定了，即便經(jīng)過漫長的選育，劣性基因也不一定能完全從雜交后代中排除。根據(jù)基因的連鎖和交換定律，染色體上相距很近的兩個基因常常是連鎖在一起的，作為一個單元進行遺傳。所以不管如何延長選育時間，那些與優(yōu)質(zhì)基因連鎖的劣性基因依然會存在。

2 分子編寫育種的內(nèi)容及研究現(xiàn)狀

分子編寫育種是指利用鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases, ZFN）[5-6]、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases, TALEN）[7-8]]或者CRISPR/Cas等基因組編輯工具對生物基因組進行精確到分子水平的編寫并定向培養(yǎng)新品種的技術(shù)。該技術(shù)最大的特點在于以“高精度”和“高效性”實現(xiàn)“高安全性”?？梢詫θ魏挝锓N基因組的任何位置進行精確到單個堿基的編寫，實現(xiàn)遺傳序列的精確插入、替換、復(fù)制、刪除等操作，大大降低非預(yù)期效應(yīng)。

分子編寫育種的目的在于：通過基因組編輯技術(shù)、顯微注射技術(shù)以及體細胞克隆技術(shù)，高效創(chuàng)制新的遺傳標記并快速驗證，對基因組進行精確的堿基序列插入、刪除或者替換等操作，實現(xiàn)物種內(nèi)或者跨物種的遺傳信息的高效、快速整合，進而快速獲得目標性狀突出的生物個體或種群，高效培育具有目的性狀的新品種，解決傳統(tǒng)育種中耗時長、成本高、效率低的問題，實現(xiàn)真正意義上的“分子雜交”和“分子育種”。

分子編寫的研究內(nèi)容主要包括：新型育種標記的創(chuàng)制及驗證、跨物種分子編寫、基因組中堿基序列的刪除以及物種內(nèi)分子編寫等四項（圖1）。

圖1 分子編寫的研究內(nèi)容及育種流程

2.1 新型育種標記的創(chuàng)制及驗證

遺傳標記在育種中發(fā)揮著重要作用，但是目前已發(fā)現(xiàn)的有效的遺傳標記如主效基因、因果SNP位點等數(shù)量有限，非常不利于育種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

分子編寫技術(shù)可以有效的解決這一問題。首先，分子編寫技術(shù)可以高通量、大規(guī)模的創(chuàng)制新型的遺傳標記。比如創(chuàng)制豬的新型遺傳標記可以先構(gòu)建靶向豬全基因組中啟動子、內(nèi)含子以及microRNA簇、lncRNA、DNA甲基化區(qū)域等重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的gRNA文庫，并利用CRISPR蛋白對這些區(qū)域進行隨機或者連續(xù)編輯，規(guī)?；漠a(chǎn)生單堿基或大片段突變，然后進行初步的表型篩選，就能獲得大量與目標性狀相關(guān)的候選遺傳突變和遺傳標記。

另一方面，也可以綜合已有的不同品種豬的基因組數(shù)據(jù)、SNP數(shù)據(jù)、全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果等生物信息學(xué)數(shù)據(jù)和文獻，篩選與豬抗病、生長速度、瘦肉率、產(chǎn)仔數(shù)、肉質(zhì)等重要經(jīng)濟性狀因果相關(guān)或緊密相關(guān)的各種遺傳標記（如SNP位點、酶切位點、結(jié)構(gòu)變異、拷貝數(shù)變異等）、表觀遺傳標記（如microRNA、lncRNA、DNA甲基化修飾等）。

以上兩種方式獲得的遺傳標記，可以進一步通過體細胞克隆的方法進行精準驗證。例如驗證SNP位點與目的性狀的相關(guān)性（圖2），就可以先利用分子改編技術(shù)的高精準性從同一個細胞系構(gòu)建出多個SNP差異細胞系，然后再利用體細胞克隆動物細胞核遺傳一致性，構(gòu)建SNP差異群體。這個群體理論上具有完全一致的遺傳背景，只在目標SNP位點存在單堿基差異。進一步分析SNP差異群體的表型，就能驗證SNP位點與目標性狀的相關(guān)性，及其對目標性狀的貢獻度。這種方法避免了全基因組選育中依賴算法造成的統(tǒng)計學(xué)誤差，能更準確地驗證SNP位點對目標性狀的貢獻度，從而獲得因果SNP位點。

構(gòu)建的SNP差異群體除了可以精準驗證SNP對目標性狀的貢獻外，還可深入研究SNP影響目標性狀分子機制，以及挖掘與目標性狀相關(guān)的其他遺傳標記的好材料。比如在同一品種、同一來源的細胞中實現(xiàn)單核苷酸的“轉(zhuǎn)換”或“顛換”培育的SNP差異群體，它們在遺傳背景上基本完全一致，這時不僅可以直接驗證SNP對目標性狀的貢獻度，還可以通過高通量測序、功能基因組學(xué)及表觀遺傳學(xué)深入分析其分子機制。

而在不同品種間的細胞中分別實現(xiàn)單核苷酸的“轉(zhuǎn)換”或“顛換”培育的SNP差異群體，其SNP變異相同，但遺傳背景不同，這時就可以深入挖掘、篩查與目標性狀相關(guān)的其他遺傳標記（圖2）。

綜上所述，利用分子編寫技術(shù)不僅能規(guī)?；木珳蕜?chuàng)制遺傳突變，便于發(fā)現(xiàn)新型遺傳標記，更可以精準驗證SNP位點對目標性狀的貢獻度，改變目前全基因組選育中完全依賴算法造成的統(tǒng)計學(xué)誤差，從而獲得一批具有高度育種價值的因果SNP位點，形成自主知識產(chǎn)權(quán)及核心技術(shù)。另外在進行SNP驗證時，還可以進一步解析SNP位點影響目標性狀的分子機制，挖掘和篩查與目標性狀相關(guān)的其他遺傳標記。

圖2 通過分子編寫技術(shù)進行SNP位點的規(guī)?；炞C

2.2 跨物種分子編寫育種

跨物種分子編寫育種，即通過ZFN、TALEN或者CRISPR/Cas系統(tǒng)以及顯微注射技術(shù)、體細胞核移植技術(shù)將一個物種中的基因精確插入或替換到另外一個物種基因組的特定位置中，或者在一個物種的基因組特定位置上，模仿另一個物種基因組中特定位置的堿基序列信息。常見的是將外源基因插入或替換到某一物種基因組上的特定位點中，如友好基因座中。該方法不僅能打破物種間的生殖隔離，引入外物種的優(yōu)良基因，而且能在大大降低非預(yù)期效應(yīng)的同時，充分發(fā)揮外源基因的育種價值。現(xiàn)有的跨物種分子編寫育種研究可以分為以下三類：外物種基因的精確插入，外物種基因的精確替換以及外物種突變序列的模仿。

2.2.1 外物種基因的精確插入 外物種基因的精確插入目前已有報道。其主要方法是將具有特殊功能的外源基因的完整表達框，精確的定點整合到受體動物基因組中的特定位置中。使其整合位置以及表達模式完全可控，避免傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的非預(yù)期效應(yīng)的產(chǎn)生。目前常選擇動物基因組中的“友好基因座（safe harbor）”進行定點整合。友好基因座是指動物基因組中轉(zhuǎn)錄活躍且不影響動物生長、發(fā)育和生殖的基因位點，這些位點非常適合外源基因的表達，對外源基因是友好的，因此稱為友好基因座。在開發(fā)和利用友好基因座進行外物種基因的精確插入方面，我國的科研工作者走在了世界前列。中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院鑒定出豬的Rosa26友好基因座，并在該位點實現(xiàn)外源基因的定點插入和替換[9]。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所鑒定出豬的一個新型友好基因座H11位點，并利用CRISPR/Cas技術(shù)高效、準確的在該位點定點插入長達9.4 kb的外源基因片段[10]。同時，該團隊還進一步制備了兩種在該友好位點分別插入三個基因的II型糖尿病模型豬：轉(zhuǎn)GIPRdn-hIAPP-11β-HSD1巴馬豬和轉(zhuǎn)GIPRdn-hIAPP-PNPLA3 I148M巴馬豬，該項研究首次在國際上創(chuàng)制胰島β細胞和肝臟特異性表達多基因小型豬2型糖尿病模型，并率先在國際上利用基因組編輯技術(shù)創(chuàng)制定點敲入大片段基因工程豬(數(shù)據(jù)暫未發(fā)表)。

西北農(nóng)林科技大學(xué)利用CRISPR/Cas9n切口酶系統(tǒng)將結(jié)核抗性基因NRAMP1定點整合到奶?；蚪M的友好基因座F-A位點中，不僅建立了一套高效、低脫靶率的將外物種基因精確插入奶?；蚪M的技術(shù)體系[11]，而且有望利用此成果培育出抗牛結(jié)核病的新型奶牛品種，市場潛力巨大。

2.2.2 外物種基因的精確替換 在外物種基因的精確替換方面，美國密蘇里大學(xué)通過CRISPR/Cas技術(shù)將豬CD163基因的第7外顯子精確替換為人的同源序列[12]。豬CD163蛋白是巨噬細胞表面的一種蛋白，在豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染過程中能介導(dǎo)PRRSV病毒進入巨噬細胞，而人的同源蛋白卻不介導(dǎo)PRRSV的感染，從而使得PRRSV病毒無法感染人類。該研究精確替換了CD163基因的第7外顯子，不僅能深入探索PRRSV病毒感染機制，更有望在保留豬CD163蛋白基本功能的前提下，刪除CD163對PRRSV病毒的介導(dǎo)作用，從而培育出既能抵抗PRRSV病毒，又不會因CD163敲除而可能攜帶某些缺陷的新型抗病豬。

2.2.3 外物種突變序列的模仿 除了外物種基因的精確插入和替換外，還可以通過精細的模仿外物種堿基突變培育動物新品種。這一方面我國的研究也處于世界前列。肌肉生成抑制素（myostatin, MSTN），也稱為生長分化因子8（growth and differentiation factor 8, GDF8）是一種肌肉生長的負性調(diào)控因子。世界著名的比利時藍牛，正是由于MSTN基因第三外顯子上11個堿基的缺失，形成了提前終止密碼子，造成了其“雙肌臀”表型[13]。比利時藍牛肌肉量特別豐富，屠宰率最高達71%，比其他品種牛多提供肌肉18%—20%。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所使用ZFN技術(shù)和TALEN技術(shù)在大白豬體內(nèi)模擬比利時藍牛MSTN基因的自然突變，獲得“仿比利時藍牛MSTN基因突變”的大白豬。這種“仿比利時藍牛MSTN基因突變豬”經(jīng)過精確的基因編輯，所攜帶的MSTN基因突變類型與比利時藍牛的自然突變完全一致，從而在提高肌肉量、降低脂肪沉積、提高生長速度的同時進一步降低了MSTN基因突變可能引起的不良效應(yīng)，具有重要的應(yīng)用價值和良好的商業(yè)前景。目前，該基因編輯新品種豬已經(jīng)順利完成中間試驗（數(shù)據(jù)暫未發(fā)表）。

在抗病育種方面，英國羅斯林研究所研究團隊發(fā)現(xiàn)：非洲疣豬通常會攜帶非洲豬瘟病毒，卻不發(fā)病，而家豬在感染非洲豬瘟病毒后，在很短的時間內(nèi)就會發(fā)病倒下?；蚪M測序分析發(fā)現(xiàn)，與感染非洲豬瘟病毒相關(guān)的一個關(guān)鍵基因RELA在家豬和非洲疣豬中存在3個不同的SNP位點，這可能是家豬易感豬瘟病毒的一個重要遺傳差異。非洲疣豬與家豬同屬豬科，但是屬于不同的亞科。家豬屬于豬亞科，非洲疣豬屬于疣豬亞科。該團隊利用ZFN技術(shù)，成功地將家豬RELA基因的3個SNP更改為非洲疣豬的SNP，有希望獲得天然抵抗非洲豬瘟病毒的基因編輯豬[14]。

2.3 基因組中堿基序列的刪除

分子編寫育種的第二方面是：基因組中堿基序列的刪除。除了打破生殖隔離，跨物種的引入基因或堿基突變外，分子編寫育種還包括在同一物種內(nèi)對基因組進行精細操作，精確刪除基因組上的某些無用甚至有害的堿基序列。比如在進化中整合到基因組上的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒、導(dǎo)致應(yīng)激綜合征的基因、疾病易感基因以及某些病毒或細菌的受體基因等。將這些基因或序列精確的剔除掉，就能定向培育出更為優(yōu)質(zhì)，更符合人類養(yǎng)殖、食用、醫(yī)藥研發(fā)等多種不同需求的生物新品種。

2.3.1 內(nèi)源性冗余序列的刪除 豬的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒是在長期進化過程中整合到豬基因組中的，對豬本身已經(jīng)沒有毒性，但是在進行異種器官移植時卻有可能對人體安全造成威脅。通過分子編寫，美國哈佛大學(xué)的楊璐菡團隊成功刪除了豬基因組中幾乎全部的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列，并通過體細胞克隆技術(shù)獲得了世界上首批適合進行異種器官移植的無內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的小型豬[15-16]，該研究對培育異種器官移植用小型豬新品種具有重大意義。同樣，通過分子編寫技術(shù)，刪除其他物種基因組中的內(nèi)源性病毒序列，也能夠培育出更安全，適用于醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用的生物新品種。

2.3.2 負作用基因和因子的刪除 除刪除內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒外，通過分子編寫技術(shù)刪除基因組中某些負調(diào)控基因和因子，同樣可實現(xiàn)相應(yīng)性狀的快速改良。如豬、牛、羊基因組中的MSTN基因?qū)∪馍L具有抑制作用，刪除該基因可提高動物的產(chǎn)肉量。早在2012年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所就通過ZFN技術(shù)獲得了MSTN基因敲除梅山豬，其瘦肉率顯著提高。至今已繁育到第五代，并且已獲準開展轉(zhuǎn)基因生物安全評價環(huán)境釋放試驗。2014年，該單位又利用TALEN技術(shù)精確模擬比利時藍牛的MSTN基因突變，獲得了“仿比利時藍牛MSTN基因突變”的大白豬初代群。 2015年，中國科學(xué)家與韓國科學(xué)家合作利用TALEN技術(shù)獲得具有顯著“雙肌臀”表型的MSTN基因編輯豬[17]。之后，吉林大學(xué)[18]和湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所[19]又分別利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功制備了MSTN基因編輯豬。除MSTN基因敲除新品種豬外，利用CRISPR/Cas9技術(shù)還可獲得MSTN基因敲除綿羊、山羊、兔等高產(chǎn)肉率新品種動物。

牛奶和羊奶中的β-乳球蛋白是人乳中不含有的蛋白，是奶制品中的過敏原之一。通過分子編寫技術(shù)將牛或羊基因組中的β-乳球蛋白基因敲除[20]，從而可降低牛羊乳中過敏原的含量，培育出不含β-乳球蛋白的牛羊新品種，緩解部分人群牛乳過敏癥狀。2011年，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)利用ZFN技術(shù)成功敲除?；蚪M中的β-乳球蛋白基因，獲得β-乳球蛋白敲除的奶牛，為培育低過敏原奶牛打下了良好的基礎(chǔ)。

2.3.3 與疾病易感相關(guān)基因和因子的刪除 抗病能力是動物育種中具有重要經(jīng)濟價值的一種表型。但是傳統(tǒng)育種手段在選育抗病品種時缺乏合適的指示性狀，而攻毒后再測定則成本高昂，并會對生產(chǎn)有不利影響。分子標記輔助育種存在分子標記較少，各個抗病分子標記間的關(guān)系復(fù)雜，抗病性狀與部分生產(chǎn)性狀存在拮抗等多種問題。因此抗病動物品種的培育工作一直進展緩慢。而分子編寫育種則可以通過直接刪除疾病易感基因或者病毒受體基因，快速培育具有抗病性狀的動物新品種，將大大加快抗病動物新品種的培育速度。

動物傳染性海綿狀腦?。╰ransmissible spongiform encephalopathy, TSE）是一種可以感染人類和牛、羊等動物的致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。這種疾病不僅對牛、羊等動物養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，還直接威脅著人類健康。通過動物分子編寫技術(shù)，敲除動物中引起TSE疾病的PRNP基因，就能獲得抗TSE的動物。如敲除PRNP基因的抗瘋牛病牛[21]，和抗羊瘙癢病綿羊[22]、山羊[23-24]等動物新品種。這類抗TSE動物新品種的進一步推廣和應(yīng)用，將會大大提升畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類健康的安全保障。

豬繁殖與呼吸綜合征又稱為豬藍耳病，是嚴重威脅豬養(yǎng)殖業(yè)的頭號烈性傳染病。該病由一種小RNA病毒引起，變異速度快，防控難度大。從2014年開始，美國密蘇里大學(xué)研究團隊利用基因組編輯技術(shù)先后敲除了與PRRSV病毒感染相關(guān)的CD169和CD163基因，獲得了CD169和CD163基因敲除豬。攻毒實驗發(fā)現(xiàn)CD163雙等位基因敲除豬對PRRSV具有完全抗性[25-28]，就是說CD163基因敲除豬能夠完全抵抗豬藍耳病。國際著名豬育種公司Genus plc（www.genusplc.com）已經(jīng)與密蘇里大學(xué)合作，開展抗藍耳病新品種豬的培育工作，該公司在2015年宣布計劃用5年時間將抗藍耳病新品種豬提供給豬肉生產(chǎn)商。截止到2017年12月，該公司已相繼拿到CD163基因、分子剪刀等知識產(chǎn)權(quán)許可，并培育出祖代抗藍耳病豬群體，整體培育工作進展順利（圖3）。

圖3 Genus pIc公司抗藍耳病豬開發(fā)時間表（數(shù)據(jù)源自Genus pIc公司網(wǎng)站）

2.4 物種內(nèi)分子編寫育種

分子編寫育種的第三方面是：物種內(nèi)分子編寫育種。常規(guī)的雜交育種手段無法精確的將“好基因”和“壞基因”分開，因此往往在導(dǎo)入優(yōu)質(zhì)基因的同時也導(dǎo)入了大量的劣性基因。尤其是那些互相連鎖的基因，常規(guī)的雜交育種手段是無法分開的。物種內(nèi)分子編寫育種就能解決這一問題。分子編寫育種可以在同一物種內(nèi)對動物基因組進行精細操作，模仿同一物種中其他品種上的堿基突變或SNP位點，將多個品種的優(yōu)質(zhì)遺傳突變信息，如基因突變以及啟動子、增強子、內(nèi)含子等多種非編碼區(qū)域上的SNP位點、突變序列等模仿和替換到一個品種上，實現(xiàn)真正意義上的“分子雜交”。

比如在豬的育種中，分子編寫育種可以精確的將地方豬的肉質(zhì)優(yōu)良、抗逆性強的基因替換到商用品種中，或者將商用品種生長速度快、飼料利用率高、瘦肉率高的基因替換到地方品種中。甚至可以精確的實現(xiàn)品種間、個體間堿基突變或SNP位點的模仿，直接獲得分子雜種優(yōu)勢，替代有性雜交，實現(xiàn)真正的豬個體和群體水平的“分子雜交”育種。

通過對“瘦肉型”和“肥肉型”豬的QTL分析發(fā)現(xiàn)，“瘦肉型”豬（如大白豬、皮特藍豬）與“肥肉型”豬（如野豬、梅山豬）相比，其類胰島素生長因子2（Insulin-like growth factor 2, IGF2）的第三內(nèi)含子的第3072位堿基存在G到A的SNP位點，該SNP位點對豬的生長速度、瘦肉率、背膘厚、背最長肌面積以及心臟重量等性狀有著非常顯著的影響，可以使豬的肌肉量增加15%—30%，背膘厚減少10%—20%[29]。該SNP位點應(yīng)該是在“瘦肉型”豬的培育過程中自然突變后經(jīng)過漫長的人工選育固定下來的。如果通過物種內(nèi)分子編寫育種，將該SNP位點直接精確的引入到我國地方品種豬中，就能快速的提高我國地方品種豬的產(chǎn)肉性能，對我國地方品種豬的改良意義重大。

在歐洲和美國的奶牛養(yǎng)殖業(yè)中，常常出于生產(chǎn)安全以及對工作人員的保護將奶牛的角去掉。但是去角的過程不僅增加了養(yǎng)殖成本，對奶牛來說也非常痛苦，與動物福利和動物保護的宗旨不符[30]。目前已選育出某些肉用品種的牛有無角性狀，如安格斯肉牛（Angus cattle）[31]，其無角性狀主要由1號染色體上的POLLED基因決定[32]。如果通過雜交育種的方法培育無角奶牛，不僅需要非常長的選育時間，而且雜交后代的產(chǎn)奶性能一定會受到肉牛某些基因的影響，產(chǎn)奶性能會降低。Tan等利用TALEN技術(shù)成功將肉牛的無角基因定點整合到有角奶牛的基因組中，由此可培育出既保持高生產(chǎn)性能，又無角的奶牛新品種，免除了奶牛切角的痛苦[33]。

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）極大的威脅著禽類養(yǎng)殖業(yè)和人類健康。培育能抵抗禽流感的禽類動物，一直以來都是養(yǎng)殖和育種從業(yè)人員的夢想。2011年，英國羅斯林研究所通過轉(zhuǎn)入干擾RNA來抑制禽流感病毒的增殖[34]，獲得了較好的抗病效果。未來則可以借助分子編寫技術(shù)，將其他品種中對禽流感病毒有抵抗力的基因[35]直接模仿和替換到生產(chǎn)性能較高的品種上，進而快速獲得對禽流感病毒具有一定抵抗力的新品種動物。

2015年，一種能快速生長的轉(zhuǎn)基因三文魚——水優(yōu)三文魚（aquAdvantage salmon）通過美國食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration, FDA）的審批，獲準上市銷售[36-37]。2017年，首批水優(yōu)三文魚已經(jīng)正式上市銷售[38]。這種三文魚本身為大西洋三文魚（atlantic salmon），轉(zhuǎn)入了另外一種三文魚——大鱗三文魚（chinook salmon）的一個生長激素調(diào)節(jié)基因，以及一個來自美洲大綿鳚（ocean pout）的啟動子，用來調(diào)節(jié)生長激素的合成，從而使得它們能夠全年生長，因此生長速度比普通三文魚快一倍，節(jié)省約75%的飼料。該品種采用的是傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，因此經(jīng)歷了較為漫長的審批過程。如果采用品種內(nèi)分子編寫技術(shù)，將其他品種三文魚的優(yōu)質(zhì)基因或啟動子序列替換到大西洋三文魚中，相信將更加容易獲得消費者的認可。

3 分子編寫育種流程

分子編寫育種的目的是改良品種并將優(yōu)良的遺傳基因傳遞至商品代。因此除了上述的對動物基因組的分子操作外，分子編寫育種還需要緊密結(jié)合目前廣泛使用的常規(guī)育種方法，持續(xù)對分子編寫群體進行選配、測定、評估，根據(jù)評估結(jié)果選擇優(yōu)良個體建立核心群（圖1）。然后依次建立純種擴繁群商品生產(chǎn)群，將優(yōu)良基因傳遞給商品群。在核心群的建立和維持過程中，測定和評估是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。不僅要進行性能測定、體型評估等常規(guī)測定，還需要進行基因測定，獲取其遺傳標記信息，以便通過全基因組選擇和測序分型進行更準確的選種。也就是說，通過分子編寫技術(shù)獲得的、遺傳性狀得到“質(zhì)變”的群體，還需要結(jié)合全基因組選擇、標記輔助選擇等多種育種方法進一步不斷選育、不斷迭代、不斷積累“量變”，才能保持遺傳性狀的優(yōu)良。

4 分子編寫育種的前景

綜上所述，分子編寫育種一方面可以在物種間實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)基因或序列甚至是SNP的流動、替換，打破物種間的生殖隔離，充分發(fā)揮優(yōu)質(zhì)基因的育種價值。另一方面可以在物種內(nèi)真正實現(xiàn)個體和群體水平的分子雜交育種，快速獲得具有分子雜種優(yōu)勢的生物新品種?？缥锓N分子編寫育種與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，精確性大大提高，因此可以大大降低外源基因隨機整合以及表達量不可控導(dǎo)致的非預(yù)期效應(yīng)，更加精準，更加高效，更加安全。而物種內(nèi)的動物分子編寫育種，在真正實現(xiàn)分子雜交的同時，完全不含其他物種的DNA序列，在本質(zhì)上與傳統(tǒng)育種方法獲得的個體完全沒有差異，可以說等同于傳統(tǒng)育種方法獲得的遺傳變異個體。

盡管分子編寫育種具有諸多優(yōu)勢，但目前尚有兩方面的問題需要進一步解決。一是基因編輯技術(shù)的準確性及特異性。分子編寫技術(shù)所依賴的基因組操作工具——ZFN、TALEN和CRISPR/Cas等技術(shù)發(fā)展迅速，其精確性和特異性都在不斷提高。如通過Scr7抑制小鼠細胞中的非同源末端連接修復(fù)（non-homologous end joining, NHEJ）可將精確修復(fù)的效率提高數(shù)倍甚至數(shù)十倍[39-40]，除抑制NHEJ修復(fù)外，還可以通過直接增強同源重組修復(fù)（homology directed repair, HDR）以提高精確修復(fù)的比率，主要方法有調(diào)控細胞周期[39, 41]、引入外源性DNA[42]、對sgRNA進行化學(xué)修飾[43]或利用小分子化合物激活HDR[44]等。除了以上幾種增強精確修復(fù)的方法，還可以利用胞嘧啶核苷脫氨酶[45]或堿基修飾酶[46]與Cas9蛋白直接融合，進而實現(xiàn)對單個胞嘧啶到胸腺嘧啶的直接轉(zhuǎn)換。

除不斷提高CRISPR/Cas技術(shù)的精確修復(fù)能力外，CRISPR/Cas技術(shù)的特異性也已經(jīng)得到極大的改善。主要優(yōu)化方法可分為對Cas9蛋白的改造和針對sgRNA的改進。在Cas9蛋白的改造方面，其主要策略包括將Cas9蛋白的核酸內(nèi)切酶失活，只保留DNA識別能力，同時與其他核酸內(nèi)切酶融合形成復(fù)合體，如FokⅠ-dCas9復(fù)合體[47-48]，進而提高對靶序列切割的特異性。其次是對Cas9蛋白進行點突變，篩選與DNA結(jié)合特異性更高的突變體，如增強型eSpCas9[49]、高保真型Cas9-HF1[50]等。針對sgRNA的改造是改變sgRNA的長度，研究表明在sgRNA的5'端的減少2—3個堿基[51]或在識別序列前加2個鳥嘌呤[52]，能夠在不影響切割活性的情況下，降低脫靶率大約5 000倍。

第二方面是政府監(jiān)管措施及公眾接受度。由于基因編輯技術(shù)發(fā)展的速度太快，遠遠超過了人們對其了解和熟悉的速度，不僅科學(xué)界對基因編輯作物是否屬于轉(zhuǎn)基因生物（genetically modified organism, GMO）尚未有明確的定論，而且全球多數(shù)國家的監(jiān)管標準也尚未明確。2016年《Nature genetics》發(fā)表評述文章[53]，提出了5項基因編輯作物的管理框架，該框架對基因編輯作物的管理提出了系統(tǒng)性的建議，在最大限度減少基因編輯作物傳播風(fēng)險的同時，建議“以和常規(guī)育種作物相同的制度來管理基因組編輯作物”從而簡化基因編輯作物的管理，以加快基因編輯作物的商業(yè)化應(yīng)用。目前，美國農(nóng)業(yè)部對于通過基因編輯工具生產(chǎn)的、不含有外源基因的食品免于監(jiān)管。如2016年美國農(nóng)業(yè)部就宣布免除對CRISPR/Cas9技術(shù)編輯的抗褐變蘑菇的監(jiān)管[5]。而轉(zhuǎn)基因動物在美國是作為藥物受FDA監(jiān)管，且FDA聲明基因組編輯動物依然要受其監(jiān)管。而澳大利亞、新西蘭和阿根廷等國家對不含有外源基因的產(chǎn)品免于監(jiān)管，對于有少數(shù)DNA堿基插入的產(chǎn)品實行個案分析原則，對于有大片段插入的食品則進行嚴格監(jiān)管。

2018年中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究員發(fā)表評述文章[55]，認為政府監(jiān)管措施和公眾接受度是影響基因編輯技術(shù)農(nóng)業(yè)應(yīng)用的最大因素，全球監(jiān)管環(huán)境的不確定性限制了將該技術(shù)進行應(yīng)用的信心。同時她認為目前基因編輯技術(shù)所取得的成就只是冰山一角，這種新型育種技術(shù)將為農(nóng)業(yè)帶來可持續(xù)發(fā)展的未來。因此，我們有理由相信，隨著基因編輯工具的不斷更新，分子編寫育種也將不斷的發(fā)展與成熟，其安全性和優(yōu)越性將進一步被消費者認識和熟知。未來的分子編寫品種和產(chǎn)品將會越來越多，動物育種將迎來全新的發(fā)展機遇，為人類提供更加優(yōu)質(zhì)、健康的產(chǎn)品。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Breeding by Molecular Writing (BMW): the Future Development of Animal Breeding

LIU ZhiGuo1, WANG BingYuan1, MU Yulian1, WEI Hong2, CHEN JunHai3, LI Kui1

(1Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193,2Army Medical University, Department of Laboratory Animal Science, College of Basic Medical Sciences, Chongqing 400038,3Shenzhen Jinxinnong Technology Co., LTD, Shenzhen 518106, Guangdong)

With the rapid development of genomics and genome editing techniques, and the extensive application of techniques such as microinjection and somatic cell nuclear transfer, a new set of breeding strategies and methods has gradually formed, which we named breeding by molecular writing (BMW). Using BMW, directional breeding of new varieties can be achieved by molecular-level genome editing, which can not only break down reproductive barriers separating different taxa, allowing the cross-species introduction of new traits, but also enable single-nucleotide insertion, deletion, and substitution in individual genomes. This can include the precise integration of exogenous genes; precise deletion and substitution of endogenous genes; and replication, deletion, and substitution of SNP loci. The main advantage of BMW is the rapid and efficient gathering of several beneficial traits into one species, while significantly reducing unintended effects. Molecular writing can be used for the following tasks: (1) identification and verification of new breeding markers; (2) cross-species molecular writing; (3) base sequence deletion in genomes; and (4) molecular writing within species. The BMW technique allows the introduction of only one or several target genes or SNPs and the rapid acquisition of new stable genetic varieties with pronounced target characters without sexual hybridization, and can then create new varieties in combination with conventional breeding methods. BMW can achieve genetic (or molecular) hybridization breeding at the individual and group levels, acquiring molecular heterosis, efficiently resolving several long-standing difficulties in breeding, and significantly improving breeding efficiency. It has strong potential for application in livestock and poultry breeding, and is a key part of the future of breeding. This paper discusses the basic concepts, research methods, research contents, and current research status of breeding by molecular writing in detail, and presents the prospects of applying BMW, providing references for researchers and practitioners in fields such as animal breeding and livestock and poultry reproduction.

breeding; breeding by molecular writing; gene editing; somatic cell nuclear transfer; gene knockout

2017-10-18；

2018-04-16

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2016ZX08006-001)、北京市自然科學(xué)基金(6173034)、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費院級統(tǒng)籌項目（Y2016JC07）

劉志國，Tel：18600463681；E-mail：liuzhiguo@caas.cn。

李奎，E-mail：likui@caas.cn