龜鹿二仙膠逆轉(zhuǎn)化療誘導(dǎo)的造血干細(xì)胞衰老的機(jī)制研究

王玨 陳朝輝 邵科釘 張衛(wèi)平 應(yīng)吟吟 林勝友

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院 杭州 310005 2.象山縣第一人民醫(yī)院 3.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)V興醫(yī)院

惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，大多數(shù)腫瘤患者在診斷時(shí)已經(jīng)處于中晚期，化療是其主要的治療手段之一?；煰熜Т_切，但90%的化療藥物都會(huì)造成骨髓抑制[1]，從而影響了化療的順利進(jìn)行甚至影響療效。目前認(rèn)為化療導(dǎo)致骨髓抑制最關(guān)鍵的機(jī)制是誘導(dǎo)造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）衰老[2]。研究表明，p16Ink4a-Rb信號(hào)通路參與了細(xì)胞衰老的過(guò)程，p16Ink4a-Rb信號(hào)通路能影響正常細(xì)胞周期的進(jìn)程，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，使細(xì)胞自我更新能力下降而發(fā)生衰老[3]。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，龜鹿二仙膠巴布劑可以減輕Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者化療后的骨髓抑制，改善中醫(yī)癥狀積分，提高患者的生存質(zhì)量[4]。進(jìn)一步研究證實(shí)龜鹿二仙膠可以通過(guò)上調(diào)抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)改善DNA損傷，促進(jìn)骨髓HSC增殖及修復(fù)，從而抵抗化療小鼠的骨髓抑制[5]。但有關(guān)龜鹿二仙膠對(duì)HSC的影響及其作用機(jī)制尚不清楚，為此筆者進(jìn)行了進(jìn)一步研究，旨在闡明其分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡SPF級(jí)雄性昆明種小鼠31只，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0018；合格證號(hào)：02600481]。飼養(yǎng)于杭州赫貝科技有限公司動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0008]，溫度范圍 20～25℃，相對(duì)濕度范圍40%～70%。

1.2 藥物 龜鹿二仙膠由鹿角膠、龜板、生曬參、枸杞子組成，采購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院中藥藥劑科，按照2:3:3:5的比例，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)研究院煎至生藥含量為1g·mL-1的煎液，4℃冰箱保存；注射用環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）購(gòu)于Baxter Oncology GmbH公司（批號(hào)：5L089A），有效期至2017年11月。

1.3 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)于美國(guó) Gibco公司（批號(hào)：8117008、8117186）；衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（senescence associated beta-galactosidase,SA-β-gal）染色試劑盒、Western 及 IP 細(xì)胞裂解液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司（批號(hào)：C0602、P0018）；CCK-8試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)于聯(lián)科生物公司（批號(hào)：76774434、5223847）；LS 柱為 Miltenyi公司產(chǎn)品（批號(hào)：6165901）；小鼠骨髓淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于天津?yàn)笊锕荆ㄅ?hào)：20170107）；PVDF膜購(gòu)于Millipore公司（批號(hào)：K5JA5013L）；彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)為Fermentas公司產(chǎn)品（批號(hào)：00174777）；高純總RNA快速提取試劑盒購(gòu)于Generay公司（批號(hào)：1612G08）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript-Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR和qPCR試劑ChamQ SYBR Color qPCR MasterMix均為Vazyme公司產(chǎn)品（批號(hào)：7E092G6、7E092H6）；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6（cyclin-dependent kinases4/6,CDK4/6）、pRb、β-Actin 抗體購(gòu)于 Santa公司（批號(hào)：D2815、G0910、C8820）；p16 抗體為 Abcam 公司產(chǎn)品（批號(hào)：GR212660-23）。

1.4 主要儀器 3111型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；IX73型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；quadro MACS型分選器（德國(guó)Miltenyi公司）；Spectra－Max Plus 384型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；Mini-Proten Tetra System電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-RAD公司）；ChemiDoc XRS+System凝膠成像儀（美國(guó)Bio-RAD公司）；定量PCR儀（美國(guó)Bio-RAD公司）。

1.5 方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞株H22購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù)，采用含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)。

1.5.2 荷瘤小鼠模型制備 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)方法制備荷瘤小鼠模型[5]。取正常傳代的H22細(xì)胞，用無(wú)菌DHanks液稀釋成細(xì)胞濃度為1.0×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。選擇1只健康小鼠，將H22細(xì)胞懸液接種于小鼠腹腔內(nèi)，接種體積0.1mL。待腹水生成后抽取腹水，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×107個(gè)/mL，接種于其余30只小鼠右側(cè)腋部皮下，接種體積0.1mL。接種后第3天接種小鼠長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的腫瘤結(jié)節(jié)，證明荷瘤小鼠模型建模成功，成瘤率100%。

1.5.3 分組及給藥方式 將30只荷瘤小鼠隨機(jī)分成3組，即對(duì)照組、模型組、龜鹿二仙膠組，每組10只。對(duì)照組予0.9%氯化鈉溶液0.2mL腹腔注射，1次/d，連續(xù)3d（d1～3），同時(shí)予0.9%氯化鈉溶液0.3mL灌胃，1次/d，連續(xù)9d（d1～9）。模型組根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，予CTX 100mg/（kg·d）腹腔注射，1次/d，連續(xù)3d（d1～3），同時(shí)予0.9%氯化鈉溶液0.3mL灌胃，1次/d，連續(xù)9d（d1～9）。龜鹿二仙膠組予CTX 100mg/（kg·d）腹腔注射，1次/d，連續(xù) 3d（d1～3），同時(shí)予龜鹿二仙膠 9.5g/（kg·d）灌胃，1 次/d，連續(xù) 9d（d1～9）。龜鹿二仙膠劑量按照70kg成人每日用量（鹿角膠6g，龜板6g，生曬參9g，枸杞子15g），同時(shí)參考人和動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量比值表[6]換算得出。20g左右小鼠的灌胃劑量約為0.19g/d。前期實(shí)驗(yàn)以此劑量為中劑量組，加大一倍劑量為高劑量組，減少一半為低劑量組[5]。預(yù)實(shí)驗(yàn)連續(xù)用藥9d，證實(shí)中劑量療效最好，故最終確定為此劑量。

1.5.4 骨髓HSC分選

1.5.4.1 骨髓細(xì)胞分離 停藥24h后于d10處死小鼠，無(wú)菌分離雙側(cè)脛腓骨，PBS漂洗2遍，1mL注射器吹打，獲取全骨髓細(xì)胞懸液，1 000r/min離心10min，收集細(xì)胞沉淀。再用PBS重懸，將細(xì)胞混勻后小心滴加到4mL分離液液面上，1 500r/min離心20min后小心吸取第2層細(xì)胞，加入10倍體積的PBS漂洗，1 000r/min離心10min，收集細(xì)胞沉淀，以1mL MACS buffer重懸細(xì)胞。

1.5.4.2 免疫磁珠法分選骨髓HSC 以MACS buffer漂洗收集的骨髓細(xì)胞1次，1 000r/min離心10min，收集細(xì)胞沉淀，按細(xì)胞數(shù)量依次加入緩沖液（100μL/1×107個(gè)）和CD44-PE抗體（10μL/1×107個(gè)），混勻后4℃避光15min。再加入5mL緩沖液漂洗細(xì)胞2次，1 000r/min離心10min，收集細(xì)胞沉淀，按比例依次加入緩沖液（80μL/1×107個(gè)）和磁珠（20μL/1×107個(gè)），混勻后4℃避光15min。加入10倍體積的緩沖液漂洗細(xì)胞1次，1 000r/min離心10min，收集細(xì)胞沉淀，3mL緩沖液重懸，樣本待用。將LS分選柱安裝于分選器上，用3mL緩沖液潤(rùn)洗兩次，將樣本溶液滴入柱中，再以3mL緩沖液潤(rùn)洗兩次，留在柱內(nèi)的即為HSC。將分選柱與分選器分離，加入5mL緩沖液后，迅速推擠出柱內(nèi)細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞沉淀，計(jì)數(shù)并計(jì)算分選得率。

1.5.5 SA-β-gal染色檢測(cè)HSC衰老情況 收集細(xì)胞，加入SA-β-gal染色固定液1mL，于搖床室溫固定15min后離心，PBS清洗3次，每孔加0.5～1mL染色液，于37℃、無(wú)CO2孵箱中孵育過(guò)夜，次日用PBS漂洗終止反應(yīng)，倒置顯微鏡下觀察，藍(lán)染細(xì)胞即為陽(yáng)性細(xì)胞。400倍顯微鏡下觀察，每組觀察3張切片，每張切片觀察5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞百分率，取平均值。

1.5.6 流式檢測(cè)細(xì)胞周期 將分選好的HSC用250μL PBS重懸，加入750μL預(yù)冷的無(wú)水乙醇，-20℃固定過(guò)夜。PBS漂洗2遍，加入1mL碘化丙啶染液，室溫避光30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5.7 CCK-8檢測(cè)HSC活力 將分選好的細(xì)胞用等體積的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，每組吸取100uL的重懸液依次加入到96孔板中，再按10:1的比例加入CCK-8檢測(cè)液，并充分混勻，設(shè)置空白對(duì)照孔，37℃避光反應(yīng)2h，450nm處讀取各孔OD值。以O(shè)D值反映細(xì)胞活力，OD值越大，細(xì)胞活力越強(qiáng)。

1.5.8 Western blot檢測(cè)p16Ink4a-Rb信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)過(guò)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，洗膜，最后將PVDF膜置于保鮮膜上，取ECL試劑盒中A液和B液等體積混合，混勻后加在膜的表面，移入凝膠成像分析儀中，化學(xué)光敏模式曝光顯影。

1.5.9 qPCR檢測(cè)p16Ink4a-Rb信號(hào)通路相關(guān)mRNA表達(dá) 采用Trizol-離心柱法提取樣本總RNA，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成、純化。見(jiàn)表1。反應(yīng)參數(shù)：預(yù)加熱：95℃ 30s，1 個(gè)循環(huán)；變性：95℃ 10s，退火（復(fù)性）：60℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HSC SA-β-gal染色陽(yáng)性率比較 模型組和龜鹿二仙膠組的SA-β-gal染色陽(yáng)性率較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明這兩組的HSC的衰老程度明顯高于對(duì)照組；其中龜鹿二仙膠組SA-β-gal染色陽(yáng)性率低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表 2、圖 1。

表2 各組HSC SA-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率比較（%）Tab.2 SA-β-gal staining positive rate of HSC in each group(%)

圖1 各組HSC的SA-β-gal染色結(jié)果（400×）Fig.1 SA-β-gal staining of HSC in each group（400×）

2.2 各組HSC細(xì)胞周期檢測(cè) 各組G1期的細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組和龜鹿二仙膠組的S期細(xì)胞比例高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；其中龜鹿二仙膠干預(yù)后，S期細(xì)胞比例明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組HSC細(xì)胞周期比較（%）Tab.3 Cell cycle of HSC in each group(%)

2.3 各組HSC細(xì)胞活力比較 對(duì)照組細(xì)胞活力為0.57±0.04，模型組為 0.33±0.17，龜鹿二仙膠組為 0.62±0.14。模型組較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而龜鹿二仙膠組細(xì)胞活力較模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 各組HSC p16Ink4a-Rb信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 模型組和龜鹿二仙膠組p16蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組升高，而pRb、CDK4/6蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；其中龜鹿二仙膠組p16蛋白的表達(dá)水平低于模型組，而pRb、CDK4/6蛋白的表達(dá)水平高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表 4、圖 2。

2.5 各組HSC p16Ink4a-Rb信號(hào)通路相關(guān)mRNA表達(dá)水平比較 龜鹿二仙膠組與模型組比較以及模型組與對(duì)照組比較，p16、pRb、CDK4/6 mRNA 表達(dá)水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

3 討論

惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率一直居高不下，嚴(yán)重危害人類健康。國(guó)家癌癥中心公布的數(shù)據(jù)顯示2018年我國(guó)惡性腫瘤新發(fā)病例380.4萬(wàn)，占全球惡性腫瘤新發(fā)病例總數(shù)的26.9%，死亡例數(shù)為229.6萬(wàn)，占全球死亡病例總數(shù)的28%，可見(jiàn)我國(guó)是惡性腫瘤高發(fā)國(guó)家，仍需要大量的探索研究以攻克惡性腫瘤這個(gè)難題。迄今為止，化療仍然是惡性腫瘤主要的治療手段，但化療藥物存在較多的副作用，如骨髓抑制、消化道反應(yīng)、脫發(fā)等，嚴(yán)重時(shí)可能限制化療藥物的劑量，影響化療療效。骨髓抑制是大多數(shù)化療藥物的主要副作用，如培美曲塞、氟尿嘧啶[7]等。針對(duì)化療后的骨髓抑制，目前臨床上主要應(yīng)用集落刺激因子治療，如粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF）、促紅細(xì)胞生成因子（erythropoietin，EPO）、促血小板生成因子（thrombopoietin，TPO）、重組人白細(xì)胞介素-11（interleukin-11，IL-11）等，能夠一定程度上促使骨髓造血功能恢復(fù)，但對(duì)于多次化療后骨髓造血功能抑制明顯，或營(yíng)養(yǎng)狀況較差、骨髓造血原料不足的患者，集落刺激因子也難以改善患者骨髓抑制狀況。因此開(kāi)發(fā)價(jià)廉的中藥制劑，在化療前或化療同時(shí)作為輔助用藥，減輕化療對(duì)骨髓造血功能的抑制，確?；煹捻樌瓿刹p少化療藥物對(duì)骨髓造血功能的損害，對(duì)于提高化療療效和改善患者預(yù)后具有重大的意義。

表4 各組HSC p16Ink4a-Rb信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（±s）Tab.4 Expression of p16Ink4a-Rb pathway related proteins in each group(±s)

表4 各組HSC p16Ink4a-Rb信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（±s）Tab.4 Expression of p16Ink4a-Rb pathway related proteins in each group(±s)

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with control group,**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05，##P＜0.01.

圖2 各組HSC p16Ink4a-Rb信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of p16Ink4a-Rb pathway related proteins in each group

圖3 各組HSC p16Ink4a-Rb信號(hào)通路相關(guān)mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Expression pf p16Ink4a-Rb pathway related mRNAs in each group

化療導(dǎo)致骨髓抑制的機(jī)制可能有以下三種[8]：第一是誘導(dǎo)HSCs凋亡；第二是導(dǎo)致骨髓基質(zhì)破壞；第三是促使HSC衰老。其中HSC衰老被認(rèn)為是骨髓抑制最為關(guān)鍵的機(jī)制，而HSC發(fā)生衰老的機(jī)制尚不十分明確。干細(xì)胞具有不斷自我更新和分化的能力，抑制其自我更新就可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生衰老。目前認(rèn)為HSC衰老屬于非端粒酶依賴的細(xì)胞衰老，其影響因素包括慢性或急性的DNA損傷（主要由輻射引起）、癌基因的激活（如 RAS、HER-2、PTEN等）、氧化應(yīng)激、表觀遺傳等[9-11]。CTX是一種雙功能烷化劑，作為細(xì)胞周期非特異性的抗腫瘤藥物，CTX可以誘導(dǎo)DNA交聯(lián)，抑制DNA合成，從而對(duì)細(xì)胞周期特別是S期產(chǎn)生巨大影響，目前被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)和體外衰老的研究[12-13]。本研究中發(fā)現(xiàn)CTX處理后，HSC細(xì)胞活力明顯下降、SA-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率增高，細(xì)胞周期阻滯于S期，表明骨髓衰老模型成功建立。

龜鹿二仙膠是我國(guó)古代名方，明代王三才所著的《醫(yī)便》中就有詳細(xì)記載。方中龜板滋陰潛陽(yáng)、補(bǔ)血，鹿角膠補(bǔ)腎陽(yáng)、生精血，人參大補(bǔ)元?dú)舛?，枸杞子益精生血。四藥合用，生精、益氣、養(yǎng)血，陰陽(yáng)并補(bǔ)，且補(bǔ)陰而無(wú)凝滯之弊，補(bǔ)陽(yáng)而無(wú)燥熱之害，屬陰陽(yáng)雙補(bǔ)之劑，能養(yǎng)血益氣生精。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，龜鹿二仙膠能夠延緩衰老，治療慢性疲勞綜合征，減輕化療后骨髓抑制，治療再生障礙性貧血等[14]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠在一定程度上改善了大腸癌骨髓抑制患者的預(yù)后[4]，然而其具體的分子機(jī)制仍待明確。本研究用龜鹿二仙膠干預(yù)后，能夠改善小鼠HSC的細(xì)胞活力、對(duì)細(xì)胞衰老以及細(xì)胞周期阻滯也有逆轉(zhuǎn)作用。

有研究表明，衰老細(xì)胞中CDK抑制劑p16蛋白的表達(dá)明顯升高[15]，而p16蛋白的表達(dá)上調(diào)抑制了CDK4/6激活，從而降低Rb蛋白的磷酸化而減少細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子E2F基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G1期并且形成細(xì)胞衰老相關(guān)的異染色質(zhì)位點(diǎn)[3]，使衰老進(jìn)入不可逆階段。因此激活p16Ink4a-pRb通路會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G1期，使細(xì)胞自我更新能力下降從而發(fā)生細(xì)胞衰老。本研究中模型組p16蛋白的表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)伴隨著pRb、CDK4/6蛋白水平的降低，這正是細(xì)胞衰老的特征表現(xiàn)。龜鹿二仙膠干預(yù)后，p16蛋白的表達(dá)水平明顯降低，pRb、CDK4/6蛋白水平明顯升高，證實(shí)了龜鹿二仙膠可以減輕CTX誘導(dǎo)的HSC衰老。

進(jìn)一步對(duì)p16Ink4a-Rb信號(hào)通路上相關(guān)mRNA表達(dá)水平的分析發(fā)現(xiàn)，各組相關(guān)mRNA的表達(dá)水平差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。mRNA豐度不一定與其翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)的表達(dá)量成線性關(guān)系，蛋白表達(dá)和對(duì)應(yīng)mRNA的豐度可能完全無(wú)關(guān)[16]。從產(chǎn)生層面分析，相同量mRNA在不同翻譯效率下產(chǎn)生的蛋白量變化非常大[17]，這依賴于蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程，磷酸化、甲基化、乙?；刃揎椷^(guò)程都能影響蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)以及基因轉(zhuǎn)錄[18]。結(jié)合本研究結(jié)果，筆者推測(cè)p16Ink4a-Rb信號(hào)通路上相關(guān)基因可能存在翻譯水平上的調(diào)節(jié)，還可能存在其他相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯后修飾對(duì)p16Ink4a-Rb信號(hào)通路相關(guān)功能蛋白的影響，從而導(dǎo)致mRNA和蛋白表達(dá)不一致。從降解層面分析，RNA穩(wěn)定性差于蛋白質(zhì)，特別是富含腺嘌呤/尿嘧啶豐富元件（AU-rich element，ARE）的 mRNA[19]。目前大部分研究者認(rèn)為mRNA的表達(dá)并不足以證明蛋白的表達(dá)情況，對(duì)于分子水平研究更傾向于以蛋白表達(dá)為金標(biāo)準(zhǔn)，因此雖然本研究中mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平不一致，仍可證實(shí)龜鹿二仙膠對(duì)p16INK4a-Rb信號(hào)通路的調(diào)控作用。p16Ink4a-Rb信號(hào)通路相關(guān)mRNA是否富含AREs而導(dǎo)致mRNA快速降解還需要進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究證實(shí)龜鹿二仙膠能夠逆轉(zhuǎn)化療所致的HSC衰老，其可能的機(jī)制是抑制p16Ink4a-Rb信號(hào)通路中p16蛋白的表達(dá)、增加CDK4/6及pRb蛋白的表達(dá)，從而減少細(xì)胞周期的阻滯。

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