載STEAP-1抗體前列腺癌靶向超聲微泡的制備及體外尋靶實(shí)驗(yàn)研究

劉瑩，江峰，袁韻

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院 超聲醫(yī)學(xué)科，安徽 蕪湖 241001)

近年來(lái)，隨著我國(guó)人口的老齡化和人們生活、飲食習(xí)慣的變化，前列腺癌的發(fā)病率逐漸上升[1]。隨著超聲分子成像技術(shù)的發(fā)展，超聲靶向造影已成為超聲研究的新領(lǐng)域[2]，因普通的聲諾維造影劑無(wú)定向選擇作用，不能顯著提高前列腺癌超聲診斷的敏感性和特異性[3]。靶向微泡造影劑則是在微泡表面上連接特異性抗體或配體，憑借抗原特異性結(jié)合抗體或配體特異性結(jié)合受體，經(jīng)血液循環(huán)后濃聚到特異的靶器官或靶組織，實(shí)現(xiàn)特異性增強(qiáng)顯影[4-5]。靶向超聲微泡造影為前列腺癌診療研究提出了新方向[6]。

本研究擬通過(guò)采用生物素-親和素連接法將載前列腺跨膜上皮抗原-1(STEAP-1)抗體與普通微泡結(jié)合制備載STEAP-1抗體的靶向微泡，通過(guò)免疫熒光法判定靶向微泡是否成功制備，流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估靶向微泡的結(jié)合率和穩(wěn)定性；體外培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞，評(píng)價(jià)其與靶向微泡體外結(jié)合能力，將普通微泡設(shè)為對(duì)照組，檢測(cè)其結(jié)合率、穩(wěn)定性及體外尋靶能力。

1 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.1.1 細(xì)胞復(fù)蘇 從-80 ℃冰箱中取出凍存的前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC3，快速投入至水浴鍋中，不斷搖動(dòng)令凍存管中液體盡快融化，避免由于融化過(guò)慢對(duì)細(xì)胞造成損害。將其內(nèi)細(xì)胞混合液移送至離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，倒去上清液。向離心管內(nèi)滴入4 ml培養(yǎng)基，細(xì)胞懸液吹勻后接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37 ℃恒溫CO2溫箱中，培養(yǎng)至次日更換培養(yǎng)基。

1.1.2 細(xì)胞傳代 當(dāng)生長(zhǎng)期細(xì)胞密度較高(達(dá)80%～90%)時(shí)及時(shí)傳代。倒去舊培養(yǎng)基，加入1 ml胰酶細(xì)胞消化液，置恒溫CO2培養(yǎng)箱中消化1～2 min，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待大部分細(xì)胞變圓，再振拍瓶壁使貼壁細(xì)胞脫壁浮起，加1 ml培養(yǎng)基使消化終止。一次性吸管吹勻移至離心管中離心，去上清后滴入新培養(yǎng)基，吸管吹勻，將細(xì)胞懸液(LNCaP細(xì)胞按1∶2、PC3細(xì)胞按1 ∶3)分入新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2 檢測(cè)STEAP-1蛋白在LNCaP及PC3細(xì)胞中的表達(dá)

1.2.1 免疫熒光法定性檢測(cè) 細(xì)胞爬片先用PBS緩沖液漂洗3遍，4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS緩沖液漂洗3遍，加入5%牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min，吸去多余BSA后加入STEAP-1抗體(1∶1 000)，置4 ℃冰箱6 h；滴加異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的IgG(1∶200)，孵育反應(yīng)1～2 h后，PBS緩沖液漂洗3遍，置于熒光顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.2 BCA法測(cè)定蛋白含量 從BCA試劑盒中取出A液4 ml、B液80 μl，取10 μl標(biāo)準(zhǔn)品加PBS緩沖液稀釋，使終濃度至0.5 mg·ml-1。另取孔加入4 μl的待測(cè)樣品LNCaP、PC3蛋白，PBS緩沖液補(bǔ)足至20 μl，分別加入200 μl BCA工作液，37 ℃水浴30 min，冷卻后置于酶標(biāo)儀中測(cè)定A562 nm，計(jì)算出兩種蛋白的濃度。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 配置好10%分離膠后灌膠，待觀察到分離膠凝固后灌入5%濃縮膠，加電泳液后使用微量移液器緩慢上樣。濃縮膠以恒定電壓80 V電泳約30 min，分離膠以恒定電壓150 V電泳約1 h，待溴酚蘭剛跑出時(shí)終止電泳。

1.3 載STEAP-1抗體靶向微泡的制備

1.3.1 制備聲諾維微泡 向聲諾維凍干粉中注入5 ml的生理鹽水，劇烈振蕩20 s至瓶中內(nèi)容物呈乳白色氣液混合狀。

1.3.2 生物素-親和素標(biāo)記微泡 取上述配制的微泡混合液，加入500 μg生物素化脂質(zhì)(DSPE-PEG-Biotin)，充分混合后置于37 ℃恒溫?fù)u床中輕搖1 h。在4 ℃下離心4 min，抽棄下層液體，漂浮法重復(fù)洗滌2遍。 于生物素化微泡中加入50 μg鏈霉親和素，置于4 ℃冰箱中避光孵育反應(yīng)30 min后洗滌。

1.3.3 結(jié)合生物素化STEAP-1抗體 利用生物素-親和素系統(tǒng)親和力與靶向微泡結(jié)合。于上述微泡混合液中加入25 μg生物素化STEAP-1抗體，繼續(xù)避光反應(yīng)30 min后洗滌、離心、定容。

1.4 載STEAP-1抗體靶向微泡的免疫熒光檢測(cè)

取上述制備好的聲諾維微泡和靶向微泡各100 μl，分別加入FITC標(biāo)記的IgG(1∶200，避光)，充分混勻，室溫下反應(yīng)30 min，洗滌2次。分別取10 μl普通微泡和靶向微泡涂片，于熒光顯微鏡下觀察兩者的染色情況。

1.5 靶向微泡的體外結(jié)合率與穩(wěn)定性

利用流式細(xì)胞儀評(píng)估STEAP-1抗體與微泡的結(jié)合率；將獲得的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以判斷其穩(wěn)定性。

1.6 體外靶向結(jié)合實(shí)驗(yàn)

1.6.1 結(jié)合實(shí)驗(yàn) (1) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNCaP、PC3細(xì)胞各制備細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定、5%BSA封閉。上述爬片分成兩組，每組10張，分別與靶向微泡和普通聲諾維微泡即靶向組A和對(duì)照組B反應(yīng)，兩組再分別均分成Al、Ap和Bl、Bp，Al、Bl與LNCaP細(xì)胞反應(yīng)，Ap、Bp與PC3細(xì)胞反應(yīng)。(2) 取適量上述制備的靶向微泡和普通微泡。鏡下觀察微泡的分布情況，PBS緩沖液洗滌后置于載玻片上，鏡下比較觀察兩種微泡分別與細(xì)胞的結(jié)合情況，PBS緩沖液再次沖洗后繼續(xù)觀察。

1.6.2 結(jié)合率判定方法[7]在每張爬片上隨機(jī)取10個(gè)視野，將微泡結(jié)合數(shù)目達(dá)5個(gè)以上(包括5個(gè))的單個(gè)細(xì)胞視為陽(yáng)性細(xì)胞，對(duì)每個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 前列腺癌細(xì)胞中STEAP-1蛋白的表達(dá)

熒光顯微鏡下LNCaP細(xì)胞、PC3細(xì)胞分別與STEAP-1抗體、FITC標(biāo)記的IgG(1∶200)染色結(jié)果(圖1、2)顯示，細(xì)胞爬片的視野內(nèi)均可見(jiàn)細(xì)胞表面發(fā)出綠色熒光。由此定性檢測(cè)可知，LNCaP細(xì)胞、PC3細(xì)胞中STEAP-1蛋白的表達(dá)均呈陽(yáng)性。

圖1LNCaP細(xì)胞熒光顯微鏡照片×200

圖2PC3細(xì)胞熒光顯微鏡照片×200

2.2 超聲微泡的性狀

2.2.1 普通聲諾維微泡 制備的普通聲諾維微泡外觀呈乳白色，光鏡下呈圓形，分布均勻(圖3A)；加FITC標(biāo)記的IgG(1∶200)熒光顯微鏡下觀察，視野丟失、未見(jiàn)熒光(圖3B)。

圖3光鏡下(A)和熒光鏡下(B)的聲諾維微泡×100

2.2.2 載STEAP-1抗體的靶向微泡 載STEAP-1抗體的靶向微泡肉眼觀亦呈乳白色，大小均一、分布均勻(圖4A)；靶向微泡與FITC標(biāo)記的IgG(1∶200)熒光顯微鏡下，微泡表面呈現(xiàn)環(huán)狀綠色熒光(圖4B)。由此表明，連接有STEAP-1抗體的靶向微泡能特異性結(jié)合IgG。

圖4光鏡下(A)和熒光顯微鏡下(B)的靶向微泡×100

2.3 靶向微泡的結(jié)合率及穩(wěn)定性檢測(cè)

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果(圖5)顯示，靶向微泡結(jié)合率高達(dá)(89.11±3.27)%，對(duì)照組僅為(0.65±0.03)%；手搖振蕩后檢測(cè)靶向微泡結(jié)合率為(88.52±3.70)%，對(duì)照組為(0.65±0.03)%。振蕩前、后微泡結(jié)合率均明顯高于對(duì)照組(P<0.05，圖6)。對(duì)振蕩前后微泡結(jié)合率進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖7)。由此表明，STEAP-1抗體能與微泡牢固結(jié)合。

2.4 靶向微泡的體外尋靶檢測(cè)

靶向微泡與前列腺癌細(xì)胞充分孵育反應(yīng)后，未用PBS緩沖液沖洗前鏡下觀察可見(jiàn)微泡分布不均勻，向細(xì)胞區(qū)域聚集(圖8A、B)；用PBS緩沖液沖洗后鏡下觀察僅見(jiàn)細(xì)胞周邊黏附大量微泡(圖9A、B)，Al組LNCaP細(xì)胞黏附率為(86.82±1.88)%，Ap組PC3細(xì)胞黏附率相對(duì)較低，為(79.08±3.64)%，對(duì)兩組細(xì)胞黏附率行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；再次用PBS緩沖液沖洗(圖10A、B)，Al組LNCaP細(xì)胞、Ap組PC3細(xì)胞的黏附率分別為(86.53±1.96)%、(78.82±3.58)%，對(duì)黏附率進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)均顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)照B組的普通Sono Vue微泡在PBS緩沖液沖洗后幾乎完全消失。證明載STEAP-1抗體靶向微泡可特異性地結(jié)合前列腺癌細(xì)胞。

圖5流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

圖6振蕩前靶向組與普通對(duì)照組微泡結(jié)合率的比較

圖7靶向組振蕩前后微泡結(jié)合率的比較

3 討 論

目前國(guó)內(nèi)外前列腺癌的發(fā)病率和死亡率都較高[8]。本研究制備出新型的靶向超聲造影劑，選擇雄激素依賴型前列腺癌細(xì)胞株LNCaP作為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞、雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3則作為對(duì)照組細(xì)胞。免疫熒光定性檢測(cè)結(jié)果顯示，與STEAP-1抗體充分孵育反應(yīng)后，LNCaP細(xì)胞和PC3細(xì)胞表面均能呈現(xiàn)出綠色熒光，即STEAP-1在兩種細(xì)胞中均呈陽(yáng)性表達(dá)。LNCaP細(xì)胞中檢測(cè)到的STEAP的表達(dá)水平是最高的，且與PC3細(xì)胞株相比，STEAP-1蛋白在LNCaP細(xì)胞株中呈相對(duì)高水平表達(dá)，這也說(shuō)明了LNCaP細(xì)胞是前列腺癌體內(nèi)外尋靶實(shí)驗(yàn)研究的最佳細(xì)胞株。

本研究選擇結(jié)合穩(wěn)固的生物素-親和素連接法，借助生物素-親和素系統(tǒng)高度親和力，實(shí)現(xiàn)靶向微泡與STEAP-1抗體牢固結(jié)合。STEAP-1分子作為組織靶向標(biāo)記物，制備出載STEAP-1抗體的靶向超聲微泡，為前列腺癌靶向研究指出了新的角度。STEAP還可能具備誘導(dǎo)細(xì)胞快速增長(zhǎng)的功能[9]。這表明STEAP-1是與前列腺癌患者預(yù)后緊密相關(guān)的生物標(biāo)志分子。

圖8Al組LNCaP細(xì)胞(A)和Ap組PC3細(xì)胞(B)爬片PBS緩沖液沖洗之前×100

圖9Al組LNCaP細(xì)胞(A)和Ap組PC3細(xì)胞(B)爬片PBS緩沖液沖洗之后×200

圖10Al組LNCaP細(xì)胞(A)和Ap組PC3細(xì)胞(B)爬片PBS緩沖液再次沖洗后×200

連接STEAP-1抗體的靶向微泡可特異性結(jié)合FITC標(biāo)記的二抗，即載STEAP-1抗體靶向微泡[10]。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)STEAP-1抗體和普通聲諾維微泡的結(jié)合率及結(jié)合的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示結(jié)合率較高，可見(jiàn)STEAP-1抗體能與普通聲諾維微泡結(jié)合，且與對(duì)照組結(jié)合率之間有明顯差異；對(duì)微泡施加適當(dāng)外力振蕩后重新檢測(cè)各組的結(jié)合率，對(duì)振蕩前后對(duì)比分析顯示，兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明施加振蕩外力對(duì)STEAP-1抗體與微泡外殼的結(jié)合未產(chǎn)生明顯的影響，即兩者結(jié)合較為牢固，證明所制備的載STEAP-1抗體靶向微泡穩(wěn)定性良好。

將載STEAP-1抗體靶向微泡與前列腺癌細(xì)胞充分接觸后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，靶向微泡分布不均勻，出現(xiàn)明顯的聚集現(xiàn)象，向細(xì)胞區(qū)域集中，而對(duì)照組微泡卻并無(wú)此聚集現(xiàn)象，仍均勻分布。緩沖液沖洗后，實(shí)驗(yàn)組能觀察到前列腺癌細(xì)胞表面環(huán)繞大量微泡，余下視野內(nèi)微泡被沖洗干凈，對(duì)照組鏡下僅能觀察到極少數(shù)微泡黏附甚至無(wú)微泡黏附的前列腺癌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的黏附率有差異，前者黏附率明顯高于后者。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明STEAP-1抗體已成功連接到靶向微泡上，且具備前列腺癌特異性尋靶能力。靶向微泡與LNCaP細(xì)胞、PC3細(xì)胞的黏附有差異，LNCaP細(xì)胞的黏附率高于PC3細(xì)胞，可能與STEAP-1在前者中的表達(dá)水平較高有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] NA R,LIU F,ZHANG P,et al.Evaluation of reportedprostate cancer risk-associated SNPs from genome-wide association studies of various racial populations in Chinese men[J].Prostate,2013,73(15):1623-1635.

[2] COBBOLD J F,PATEL D,FITZPATRICK J A,et al.Accuracy and reliability of microbubble ultrasound measurements for the non-invasive assessment of hepatic fibrosis in chronic hepatitis C[J].Hepatol Res,2012,42(5):515-522.

[3] FERDINAND F,ANDREA K,ETHAN J,et al.Detection of prostate cancer with a microbubble ultrasound contrast agent[J].Lancet,2001,357(9271):1849-1850.

[4] YANG S L,TANG K Q,BAI W K,et al.Combined low-frequency ultrasound and microbubble contrast agent for the treatment of benign prostatic hyperplasia[J].J Endourol,2013,27(8):1020-1026.

[5] TAKALKAR A M,KLIBANOV A L,RYCHAK J J,et al.Binding and detachment dynamics of microbubbles targeted to P-selectin under controlled shear flow[J].J Control Release,2004,96(3):473-482.

[6] SHARIFI N.Steroid receptors aplenty in prostate cancer[J].NEngl J Med,2014,70(10):970-971.

[7] 劉凡.原發(fā)性肝癌靶向超聲造影劑的制備及體外實(shí)驗(yàn)研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2008.

[8] 齊金蕾,王黎君,周脈耕,等.1990-2013年中國(guó)男性前列腺癌疾病負(fù)擔(dān)分析[J].中華流行病學(xué)雜志，2016，37(6):778-782.

[9] 潘玉琢，郭麗榮，梁爽，等.前列腺組織STEAP表達(dá)與H2O2水平的關(guān)系[J].中國(guó)病理生理雜志，2008，24(2)：354-356.

[10] ABOU-ELKACEM L,BACHAWAL S V,WILLMANN J K.Ultrasound molecular imaging:Moving toward clinical translation[J].Eur J Radiol，2015，84(9):1685-1693.