用超敏DNA提取試劑盒提取牙齒DNA

劉 峰，尹 路，陳愛(ài)萍，黃泳森

（廣東省深圳市公安局龍崗分局刑警大隊(duì)，廣東 深圳 518172）

牙齒DNA的STR檢驗(yàn)是當(dāng)前鑒定無(wú)名尸骸的一種有效手段，其在基層法醫(yī)物證實(shí)驗(yàn)室已較普及。但若實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有專業(yè)牙齒粉碎設(shè)備和牙齒裂解液，或會(huì)因牙齒的粉碎不夠徹底而致裂解液不能發(fā)揮最大效能或者牙齒組織難以分解，因而導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果不理想。筆者使用自制的牙齒粉碎設(shè)備，再以超敏DNA提取試劑盒增加裂解效能，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，提高DNA濃度，獲得了有效的STR分型。

1 材料與方法

1.1 樣本及主要試劑

3顆來(lái)自不同個(gè)體保存完整的切牙（2011和2013年實(shí)際案件檢材，已做過(guò)檢驗(yàn)，獲得了完整分型并和失蹤人員的家屬經(jīng)親緣關(guān)系鑒定確定了其來(lái)源），分別編為1、2和3號(hào)。

超敏DNA提取試劑盒（上海惠文生物科技有限公司）；Identif i ler-Plus擴(kuò)增試劑盒（Thermo Fisher公司，美國(guó)）；5% (質(zhì)量濃度)次氯酸鈉溶液；無(wú)水乙醇；0.5mol/L EDTA脫鈣液（pH 8.0）；DTT溶液(1 mol/L)以及蛋白酶K溶液(20 mg/mL)等。

1.2 牙齒處理

三顆牙齒分別用清水洗凈表面，再以手術(shù)刀片刮去牙齒表層及污垢物，用蒸餾水沖去浮垢，放入干凈小燒杯中，加5% 次氯酸鈉溶液浸泡15 min[1]后棄去溶液，蒸餾水泡洗3～5次，清除次氯酸鈉，無(wú)水乙醇泡洗1次除去殘余水份，用濾紙拭干，以紫外光照射各牙齒30 min。使用自制的牙齒粉碎器將三顆經(jīng)預(yù)處理的牙齒分別研成粉末。

圖1為牙齒粉碎器，由三部分組成。為減少磨損度以增加使用期限，其各部分表面均鍍有金屬鉻。左側(cè)為底座，半球形設(shè)計(jì)用以放置牙齒和收集牙粉，右側(cè)為套管，套在底座和中間的圓柱上，用以防止牙齒四處濺落，并固定用力的方向。使用時(shí)，左側(cè)底座凹槽用于放置已清潔的牙齒；右側(cè)套管套在左側(cè)底座之上；中間的圓柱形鐵塊上端球形面用于與底座凹槽相嵌合，下端平面則用于接受鐵錘等擊打物敲擊。

圖1 自制牙齒粉碎器Fig.1 Self-made device for tooth grinding

1.3 DNA提取

將每顆牙研粉均取兩份，每份0.1 g，置于兩個(gè)超敏DNA提取試劑盒配套的離心套管內(nèi)（編號(hào)為A和B），分別加入260 μL預(yù)先混勻的試劑（包含有試劑盒中100 μL裂解液A、20 μL裂解液B以及20 μL DTT溶液、20 μL蛋白酶K溶液和100 μL EDTA脫鈣液），56 ℃裂解6 h，99 ℃裂解10 min。而后，13 000 g離心10 s，再加入吸附液200 μL，1 3000 g離心2 min，加入吸附液950 μL及混勻的吸附珠懸液16 μL，室溫靜置15 min。8000 g離心30 min，充分移去上清液，先在A管沉淀物中加入-20 ℃漂洗液750 μL，充分混勻后將A管中的液體移至B管，并將B管沉淀物充分混勻。 8000 g離心30 min，充分去除漂洗液，管蓋打開(kāi)狀態(tài)下56 ℃烘干吸附珠1 min。加入洗脫液30 μL，充分混勻后56 ℃保溫15 min。8000 g離心30 s，取上清液備用。

1.4 PCR擴(kuò)增

采用Identif i ler Plus擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增，反應(yīng)總體積25 μL，其中包含前面提取的牙齒DNA上清液10 μL。熱循環(huán)條件按試劑盒推薦參數(shù)設(shè)定。

1.5 電泳檢測(cè)

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3130 xL遺傳分析儀檢測(cè)，電泳按說(shuō)明書(shū)規(guī)定進(jìn)行，以GeneMapperID-X軟件作STR分型。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

三顆牙齒的STR分型結(jié)果都與檔案室保存的STR分型結(jié)果一致，均可滿足尸源認(rèn)定要求（如圖2）。

圖2 1號(hào)牙齒STR分型Fig.2 STR genotype of the tooth 1

2.2 討論

牙齒是白骨化尸體檢驗(yàn)中的常見(jiàn)檢材，從牙齒中提取DNA做STR分型是對(duì)白骨化尸體進(jìn)行尸源鑒定的重要手段。但由于牙齒中的細(xì)胞含量相對(duì)較少，加之受時(shí)間、環(huán)境等因素的影響，故牙齒的DNA提取成為法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的一大難點(diǎn)[2]。牙齒DNA提取可利用EDTA的脫鈣作用軟化骨組織，再結(jié)合蛋白酶K和表面活性劑對(duì)細(xì)胞裂解，可釋放出深層骨組織中的DNA。骨骼脫鈣后DNA檢測(cè)結(jié)果證實(shí)明顯優(yōu)于未脫鈣處理，表明脫鈣有助于細(xì)胞的分散，會(huì)使骨粉變得粘稠細(xì)膩，易被裂解液充分消化[3]。但由于DNA是水溶性大分子，單獨(dú)的脫鈣步驟會(huì)因棄去脫鈣液導(dǎo)致DNA損失，有研究[4]表明遺棄的脫鈣液中含有大量DNA，損失率高達(dá)50%以上。

本方法使用超敏DNA提取試劑盒，經(jīng)硅珠吸附提取DNA，脫鈣液直接和裂解液、DTT、蛋白酶K以及牙齒粉末混合使用，省去了單獨(dú)的脫鈣步驟從而減少了因棄脫鈣液導(dǎo)致的DNA損失。另外，使用硅珠試劑盒提取DNA的操作過(guò)程與步驟也相對(duì)簡(jiǎn)單，尤其無(wú)需移管，從而既有效減少了DNA損失又縮短了檢驗(yàn)時(shí)間。

目前，國(guó)內(nèi)DNA實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行牙齒DNA檢測(cè)時(shí)，通常需要一顆磨牙的1/3。這些牙粉放置在1.5 mL離心管中裂解時(shí)，由于重力作用會(huì)產(chǎn)生積壓，使骨粉不能和脫鈣液、裂解液、DTT、蛋白酶K混合液等充分接觸，因之降低了脫鈣液和裂解液的效能。為解決這個(gè)問(wèn)題，本方法使用兩個(gè)超敏DNA提取試劑盒離心套管，既增大了反應(yīng)體系的體積也充分增加了裂解液與牙粉的接觸面積，從而提高了脫鈣和裂解效能。然后在漂洗步驟時(shí)再將兩個(gè)離心管的溶液合并接受漂洗與洗脫處理，就使最終的DNA濃度大大增加，STR的分型結(jié)果更好。

本方法在相關(guān)骨骼DNA提取研究[5]中也有類似應(yīng)用，其實(shí)質(zhì)都是簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作步驟、增加脫鈣裂解效能、濃縮純化DNA的含量。目前，本實(shí)驗(yàn)室使用該方法提取牙齒DNA已有18宗案例，全部獲得了完整的STR分型，其中有8宗案例和失蹤人員的家屬經(jīng)親緣關(guān)系鑒定確定了尸源。

綜上，利用超敏DNA提取試劑盒提取牙齒DNA，能夠獲得良好的STR分型。本方法尤其適用于一些檢材量少或者時(shí)間緊急的案件。至于時(shí)間更長(zhǎng)（5年以上）的牙齒是否適用，暫未研究，待再積累檢材后作探討。

［1］ KEMP B M, SMITH D G. Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth［J］. Forensic Science International, 2005, 154: 53-61.

［2］ 涂政，劉志芳，陳松，等. 牙齒的DNA提取及STR分型研究［J］. 刑事技術(shù)，2007(5): 9-11.

［3］ RUCINSKI C, MALAVER A L, YUNIS E J, et al. Comparison of two methods in isolating DNA from human skeleton for STR analysis［J］. Journal of Forensic Science, 2012, 57(3): 706-712.

［4］ 李花，涂政，石屹，等. 骨骼脫鈣后DNA含量損失問(wèn)題初探［J］. 中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2014, 29(2): 141-144.

［5］ 涂政，石屹, 張廣峰, 等. 一種焚燒骨骼的DNA提取方法.刑事技術(shù), 2016, 41(1): 77-79.