基于H2O2鈣黃綠素催化效應(yīng)的生物傳感器測(cè)定鼠李糖①

(1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院, 福建 漳州 363000； 2.農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應(yīng)用技術(shù)工程中心,福建 漳州 363000)

0 引 言

鼠李糖(Rha)，又稱(chēng)6-脫氧-L-甘露糖，分子式為C6H12O5，是一種廣泛存在于植物的多糖、糖苷、植物膠和細(xì)菌多糖中的物質(zhì)[ 1]。研究表明，Rha具有增強(qiáng)免疫力、抗疲勞、保護(hù)肝臟、抑制破骨細(xì)胞等功能[2-3]，這說(shuō)明Rha與人類(lèi)的健康有著密切聯(lián)系；因此，Rha的快速和靈敏測(cè)定方法在生理功能領(lǐng)域研究和臨床疾病診斷中具有重要價(jià)值。目前，測(cè)定鼠李糖有氣相色譜法(GC)[4-5]、高效液相色譜法(HPLC)[6-7]、高效液相色譜間接紫外檢測(cè)法(HPLC-UV)[8]、反相高效液相色譜法(RP-HPLC)[9]、自動(dòng)酶熒光測(cè)定[10]、高效陰離子交換色譜安培檢測(cè)法(HPAEC-PAD)[11]、毛細(xì)管電泳法(CE)[12]等方法，但這些方法均存在一定的缺陷，如氣相色譜法靈敏度低；高效液相色譜法必須在恒溫恒流速下進(jìn)行，檢測(cè)靈敏度也不夠高；毛細(xì)管電泳法需要對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行衍生化處理等等。因此，研究一種簡(jiǎn)便、快速、低成本、靈敏測(cè)定痕量Rha的方法具有重要的意義。

鈣黃綠素(R)可發(fā)射強(qiáng)而穩(wěn)定的熒光，在H2O2的氧化下，R被氧化為無(wú)熒光化合物(R’)使R的熒光信號(hào)猝滅。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鈣黃綠素(R)與鼠李糖(Rha)發(fā)生縮合反應(yīng)生成R-Rha縮合物，在H2O2的氧化下，反應(yīng)生成R’和Rha，此時(shí)，體系的熒光信號(hào)劇烈猝滅，表明鼠李糖(Rha)的催化反應(yīng)對(duì)熒光信號(hào)有顯著的放大效應(yīng)。據(jù)此，建立了高靈敏催化生物傳感器測(cè)定痕量Rha的新方法。該生物傳感器的靈敏度比HPLC[5]的靈敏度高6.6×108倍，并具有選擇性好、靈敏、簡(jiǎn)便、快速、低成本等優(yōu)勢(shì)，已成功用于實(shí)際樣品中Rha的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與材料

LS-55型熒光分光光度計(jì)(珀金埃爾默)，儀器參數(shù)為延遲時(shí)間 0.1ms，門(mén)限時(shí)間 2.0 ms，Cycle周期時(shí)間 20 ms，flash count閃亮次數(shù) 1，Ex Slit激發(fā)單元狹縫10 nm，Em Slit發(fā)射單元狹縫 10 nm，Speed掃描速度 1500 nm/min；AE240型電子分析天平(梅特勒-托利多)；pHS-3B酸度計(jì)(雷磁)；高壓恒流泵(依利特)；示差折光檢測(cè)器(Waters)；色譜柱(依利特)。

Rha工作溶液(先配制0.10 μg/mL儲(chǔ)備液，臨用時(shí)用水逐級(jí)稀釋為1.00、10.00、100.0(fg mL-1)；1.0×10-4mol L-1R；3.0% (W/V) H2O2)；所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)所用水為二次亞沸水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

往25 mL比色管中加入適量Rha，0.50 mLR，1.00 mLH2O2，水定容，混勻，70 ℃水浴加熱10 min，水流冷卻5 min，同時(shí)做試劑空白。記錄488.3/513.4 nm處測(cè)定試液的F和試劑空白的F0，計(jì)算熒光增量ΔF(F0-F)值。

1.3 R-Rha的HPLC、MS和NMR分析

取50.00mL R，1.00 mL 0.80 pg mL-1，70℃水浴加熱10 min，冷卻，結(jié)晶,可得晶體R-Rha。取0.10 mg R-Rha水溶，以乙腈:乙酸乙酯:水(60:25:15)混合液作為流動(dòng)相，高效糖分析柱(WAT044355, 250 mm ×4.6 mm i.d.，4 μm)分離，超聲脫氣，經(jīng)過(guò)0.45 μm 濾膜過(guò)濾。流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣體積為10 μL，經(jīng)HPLC分離，MS(快原子轟擊法)及核磁共振(1H NMR 和13C NMR)檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)Rha機(jī)理

1.1’ :0.50 mL R 2.2’ :1.1’+1.00 mL H2O23.3’ :1.1’+ 300.0 fg Rha 4.4’ :2.2’+ 300.0 fg Rha

圖1 R-H2O2-Rha體系的熒光光譜 (曲線1、2、3和4為激發(fā)光譜；曲線1'、2'、3'和4'為發(fā)射光譜。)

= 488.3/513.4 nm，F(xiàn)=95.9，ΔF= 96.4，曲線4.4’)，可能是R酚羥基鄰位上的氫與Rha發(fā)生縮合反應(yīng)生成R-Rha縮合物，其反應(yīng)示意如反應(yīng) 2所示。

反應(yīng)1 H2O2氧化R的反應(yīng)

反應(yīng)2 R與Rha的縮合反應(yīng)

為探討Rha與R作用生成R-Rha的可行性，本文用HPLC，F(xiàn)ABMS和NMR檢測(cè)R-Rha的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在FABMS 上質(zhì)荷比為620、180和800處出現(xiàn)了R、Rha和R-Rha的分子離子峰，HPLC上Rha與標(biāo)準(zhǔn)Rha的出峰時(shí)間相同(6.186 min)，這證明R-Rha縮合物中有Rha與R存在。由1H NMR(D2O)，δ1.27 (CH3-)，δ3.2 - 4.1 (2’H，3’H，4’H，5’H)，δ4.81 (β型，1’H)，δ5.1 (α型1’H)，13C NMR(D2O) δ17.6 (CN3- )，δ69 (α型5’C)，δ72.7 (β型，5’C)，δ70.8 (α型，3’C)，δ71.6 (α型，2’C)，δ72.2 (β型，2’C)，δ73 (α型，4’C)，δ73.5 (β型，1’C)，δ94.3 (β型，1’C)，δ94.8 (α型，1’C)，δ68.7 (β型，4’C)的光譜數(shù)據(jù)，表明產(chǎn)物中含有Rha。HPLC、MS、1H NMR與13C NMR證明了Rha與R作用生成R-Rha的可能性。

生成的R-Rha被H2O2氧化為R’和Rha，導(dǎo)致R的熒光

信號(hào)發(fā)生劇烈猝滅，由此表明Rha對(duì)H2O2氧化R的反應(yīng)有顯著的催化效應(yīng)。R-Rha與H2O2的氧化反應(yīng)如反應(yīng)3所示。

取0.10 mg R-Rha，加0.50 mLH2O2，70℃加熱10 min，冷卻，經(jīng)HPLC分離及MS分析。結(jié)果表明，在21.307和6.186 min處出現(xiàn)色譜峰，可推測(cè)為R’和Rha。FABMS出現(xiàn)620 [M]+，180[M]+分子離子峰，進(jìn)一步證實(shí)了R’和Rha的存在。體系的ΔF與Rha含量成正比，選擇513 nm作為工作波長(zhǎng)用催化生物傳感器測(cè)定痕量Rha。

2.2 最佳測(cè)量條件

對(duì)于4.0fg mL-1Rha，分別考察不同試劑的濃度與用量、發(fā)光物質(zhì)、氧化劑、反應(yīng)時(shí)間和溫度、反應(yīng)酸度和靜置時(shí)間對(duì)體系ΔF的影響(表1，圖2-7)。雖然FITC, Rhod.6G，R作為發(fā)光物質(zhì)時(shí)體系ΔF值較高，但R的ΔF最大。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：隨著R的濃度或用量的增加，體系ΔF值逐漸增強(qiáng)；當(dāng)R為0.50 mL 1.0×10-4mol L-1時(shí)，體系的ΔF最高。

相對(duì)于H2O2、KIO4, K2S2O8、 KClO3和KBrO3而言，H2O2對(duì)體系ΔF的影響最大，這可能是H2O2的氧化能力最強(qiáng)的緣故。隨著H2O2的濃度或用量的增加，體系ΔF值逐漸增強(qiáng)。當(dāng)H2O2為1.00 mL或3.0%時(shí)，體系的ΔF最高。

隨著反應(yīng)溫度與時(shí)間的增加，體系ΔF值逐漸增大，這可能是Rha的催化反應(yīng)能力逐漸增大。當(dāng)反應(yīng)溫度與時(shí)間為70℃、10 min時(shí)體系ΔF值最大，顯然，此時(shí)Rha 的催化反應(yīng)能力最強(qiáng)。此后，隨著反應(yīng)溫度與時(shí)間繼續(xù)增加，

體系ΔF值逐漸減小，可能是在反應(yīng)溫度與時(shí)間增加的過(guò)程中的催化反應(yīng)能力逐漸減弱。

當(dāng)pH在5.00-6.65范圍內(nèi)，隨著pH的增加體系的ΔF值線性增大；當(dāng)pH在6.65～7.50范圍內(nèi)，體系ΔF最大且穩(wěn)定，這可能是在此pH值范圍內(nèi)Rha的催化反應(yīng)速率最大。放置時(shí)間在15～45 min內(nèi)體系ΔF值幾乎不變，重現(xiàn)性好。當(dāng)放置時(shí)間超過(guò)45 min，體系的ΔF值逐漸減少，可能與放置過(guò)程R-Rha被分解有關(guān)。

表1 最佳測(cè)量條件

反應(yīng)3 R-Rha與H2O2的氧化反應(yīng)

綜合上述討論，最佳測(cè)量條件為：當(dāng)試劑的濃度與用量為0.50 mL 1.00×10-4mol L-1R、1.00 mL 3.0% H2O2、反應(yīng)溶液的pH為7.10、反應(yīng)溫度與時(shí)間為70 (C與10 min時(shí)，體系的ΔF值最大且保持穩(wěn)定。在上述最佳條件下流水泠卻5 min，體系的ΔF值在15-45 min內(nèi)幾乎不變，并且重現(xiàn)性好。

2.3 工作曲線、線性范圍、檢出限

在最佳條件下，體系的ΔF與Rha含量成線性關(guān)系，如圖8所示。將本法的工作曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、線性范圍、RSD%(分別對(duì)0.050 和12.0 fg mL-1的Rha進(jìn)行6次平行測(cè)定,計(jì)算其RSD%)、LOD(對(duì)試劑空白進(jìn)行11次的平行測(cè)定，以3Sb/k計(jì)算，Sb=0.050)等與文獻(xiàn)[5，7，8]方法比較，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 發(fā)光物質(zhì)對(duì)體系ΔF的影響

(其中A，B，C分別為FITC，Rhod6G,R)

由表2可見(jiàn)，本方法的檢出限為1.9×10-17g mL-1、線性范圍為5.0×10-17-1.2.×10-14g mL-1，顯示了本法比文獻(xiàn)[5]、[7]、[8]方法的線性范圍寬和靈敏度高。本法具有較高的靈敏度的原因，可能是一方面R酚羥基鄰位上的氫與Rha發(fā)生縮合反應(yīng)生成無(wú)熒光R-Rha縮合物，從而活化H2O2氧化R的反應(yīng)；另一方面Rha催化了該氧化反應(yīng)的進(jìn)行，較大程度提高了ΔF值，顯示了催化反應(yīng)的信號(hào)放大效應(yīng)。

表2 不同方法測(cè)定Rha的對(duì)比

表3 實(shí)際樣品中Rha的分析結(jié)果(n = 6)

圖3 氧化劑對(duì)體系ΔF的影響

其中A, B, C, D,E,C分別為H2O2，

KIO4，K2S2O8，KClO3，KBrO3

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)體系的ΔF值的影響

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系的ΔF值的影響

圖6 反應(yīng)酸度對(duì)體系的ΔF值的影響

2.4 干擾實(shí)驗(yàn)

對(duì)4.00 fg mL-1Rha，在最佳條件下通過(guò)測(cè)試生物傳感器對(duì)煙草和大棗中其它的響應(yīng)考察本法的選擇性。當(dāng)測(cè)定相對(duì)誤差大于±5時(shí)，各種離子視為干擾。結(jié)果表明，450 pg mL-1的天門(mén)冬氨酸、430 pg mL-1谷氨酸、420 pg mL-1賴(lài)氨酸和色氨酸、410 pg mL-1抗壞血酸、30 pg mL-1甘露糖和木糖、25 pg mL-1葡萄糖和果糖、和24 pg mL-1半乳糖可以共存，顯示了本法有好的的選擇性。本生物傳感器共存物的允許濃度大，具有較高選擇性?？赡苁瞧咸烟恰⒏事短?、木糖、果糖、半乳糖等含有的-CHO和-CH2OH被H2O2氧化為四羥基二酸，影響了其與R酚羥基鄰位上的氫縮合反應(yīng)的緣故。

圖7 靜置時(shí)間對(duì)體系的ΔF值的影響

2.5 樣品分析

參照文獻(xiàn)[7]，稱(chēng)取0.30-0.45 mm粒徑的煙草樣品1.0 g(± 0.01 mg),加入25 mL水,于40℃、超聲波震蕩浸提 40 min，過(guò)濾，洗滌，取濾液定容至100 mL。取5.00 mL溶液，以1.0 mL/min的流速通過(guò)預(yù)活化好的反相 C-18固相萃取柱，棄去最初的2 mL,收集后面的3 mL，再用0.45 μm的水系濾膜過(guò)濾，取1.00 mL濾液定容至250 mL。然后，取1.00 mL試液稀釋至1000 mL,備用。使用經(jīng)甲醇和水活化處理后的反相C-18固相萃取柱可去除樣品溶液中的醛、酮、內(nèi)酯、有機(jī)酸等雜質(zhì)[13]，能有效保護(hù)C-18固相萃取柱并延長(zhǎng)其使用壽命。參照文獻(xiàn)[14]，取適量大棗，先去核，經(jīng)過(guò)5 0 ℃真空烘干，置于干燥器里干燥、冷卻。然后，粉碎、混勻，制成棗粉。稱(chēng)取0.30-0.45 mm粒徑的1.0 g(± 0.01 mg)棗粉，加100mL95%的乙醇(用95%的乙醇可以提取出大棗中全部的單糖[14])，于50 ℃、超聲波震蕩浸提120 min，用離心機(jī)離心，過(guò)濾，重復(fù)3次。收集濾液，減壓濃縮，水定容至250 mL。取5.00 mL溶液，以下按煙草樣品的方法處理，取1.00 mL濾液定容至250 mL。再取1.00 mL試液水稀釋至2000 mL,備用。取1.0 mL試液，按實(shí)驗(yàn)方法及HPLC測(cè)定煙草與大棗中Rha的含量，同時(shí)做加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 結(jié) 論

基于Rha對(duì)H2O2氧化鈣黃綠素的催化效應(yīng)導(dǎo)致體系的ΔF與Rha的快速響應(yīng)，開(kāi)發(fā)了一種具有信號(hào)放大效應(yīng)的Rha催化生物傳感器。本傳感器的線性范圍寬、靈敏度高，適用于檢測(cè)Rha含量低的樣品，結(jié)果與HPLC相吻合；共存物的允許濃度大，具有較高選擇性；無(wú)需恒溫恒流速和對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行衍生化處理，操作簡(jiǎn)便、快速、分析成本低。這種靈敏、高選擇性的生物傳感器不僅潛在著分析Rha的前景，而且展現(xiàn)了生物傳感器與信號(hào)放大效應(yīng)相結(jié)合具有高靈敏的顯著優(yōu)勢(shì)，同時(shí)有力地推動(dòng)R、熒光法、生物傳感器、催化動(dòng)力學(xué)分析的研究進(jìn)展。

參考文獻(xiàn)：

[1] Jordan DS, Daubenspeck JM, Dybvig K.Rhamnose Biosynthesis in Mycoplasmas Requires Precursor Glycans Larger Than Monosaccharide [J].Mol.Microbial.2013, 89: 918-928.

[2] Lichtenthaler FW.2-Oxoglycosyl (“Ulosyl”) and 2-Oximinoglycosyl Bromides: Versatile Donors for the Expedient Assembly of Oligosaccharides With β-d-Mannose, β-l-Rhamnose, N-Acetyl-β-d-mannosamine, and N-Acetyl-β-d-mannosaminuronic acid units [J].Chem.Rev.2011, 111: 5569-5609.

[3] Klein G, Lindner B, Brade H, et al.Molecular Basis of Lipopolysaccharide Heterogeneity in Escherichia Coli Envelope Stress-responsive Regulators Control the Incorporation of Glycoforms With a third 3-deoxy-α-d-manno-oct-2-ulosonic Acid and Rhamnose [J].J.Biol.Chem.2011, 286: 42787-42807.

[4] 鄧旭坤，吳非等.氣相色譜法分析大麻藥多糖成分中單糖組成[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào).2015,34:48-51.

[5] Liu Y, Qian T, Li K, et al.GC Analysis of Monosaccharides Composition of Polysaccharide in Sipunculus Nudus Linnaeu [J].Chin.J.Pharm.Anal.2012, 32: 1362-1364.

[6] 伍善廣,馮學(xué)珍.高效液相色譜法測(cè)定金錢(qián)菇多糖的單糖組成[J].廣西植物.2014,34:179-182.

[7] Lin K, Su Q, Huang D, et al.Determination of Monosaccharide Composition in Polysaccharide of ant Nest of Macrotermes Annadalei by HPLC [J].Chin.J Pharm.Anal.2013, 33: 898-993.

[8] Lv Y, Yang X, Zhao Y, et al.Separation and Quantification of Component Monosaccharides of the Tea Polysaccharies from Gynostemma Pentaphyllum by HPLC with Indirect UV Detection [J].Food Chem.2009, 2: 742-746.

[9] Kwon H, Kim J.Determination of Monosaccharides in Glycoproteins by Reverse-phase high-performance liquid Chromatography.[J].Anal.Biochem.1993, 215: 243-252.

[10] Yeo SF, Zhang Y, Schafer D, et al.A rapid, Automated Enzymatic Fluorometric Assay for Determination of D-arabinitol in Serum [J].J.Clin.Microbiol.2000, 38: 1439-1443.

[11] Talaga P, Bellamy L, Moreau M.Quantitative Determination of Cpolysaccharide in Streptococcus Pneumoniae Capsular Polysaccharides by Use of High-performance Anion-exchange Cchromatography With Pulsed Amperometric Detection [J].Vaccine.2001, 19: 2987-2994.

[12] Guttman A.Analysis of Monosaccharide Composition by Capillary Electrophoresis [J].J.Chromatogr.A.1997, 763: 271-277.

[13] Tang KT, Liang LN, Cai YQ, et al.Determination of Sugars and Sugar Alcohols in Tobacco Feed Liquids by High Performance anion-exchange and Pulsed Amperometric Detection [J].Chin.J.Anal.Chem.2007, 35: 1274-1278.

[14] Li J, Ding S, Ding X.Comparison of Antioxidant Capacities of extracts from Five Cultivars of Chinese jujube [J].Process Biochem.2015, 40: 3607-3613.