阿特拉津降解菌CS3的分離鑒定及其降解特性的研究

楊曉燕，李艷苓，魏環(huán)宇，朱昌雄，李 峰，耿 兵

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081）

阿特拉津（Atrazine）是一種被世界各地廣泛應(yīng)用的三嗪類除草劑，可防除農(nóng)業(yè)和森林中的闊葉雜草及一些禾本科雜草[1-2]。雖然阿特拉津的雜草防除效果很好，但是由于其具有淋溶性好、易擴散、遷移率高等特點，導(dǎo)致其可以隨排灌水和降水流失，進而對土壤[3-5]、地表水和地下水[3，6-9]造成嚴(yán)重污染。此外，還有研究表明阿特拉津是一種內(nèi)分泌干擾物和致癌物，能夠干擾生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)，阻斷正常的激素功能，導(dǎo)致先天缺陷、生殖腫瘤、兩棲類和人類體重減輕等，進而影響生態(tài)平衡[10-11]。因此用生物法修復(fù)阿特拉津污染的環(huán)境受到廣大研究工作者的密切關(guān)注并逐漸成為一個研究熱點。

目前，已經(jīng)報道的能夠降解阿特拉津的細菌包括Pseudomonas sp.[12-13]、Arthrobacter sp.[14-15]、Acinetobacter sp.[16]、Rhodococcus sp.[17-18]、Pseudaminobacter sp.[19]、Nocardioides sp.[6]、Bacillus sp.[20]、Agrobacterium sp.[21-22]等許多屬。其中革蘭氏陰性菌Pseudomonas sp.ADP和革蘭氏陽性菌Arthrobacter sp.TC1是目前研究的比較透徹的代表性菌株，前者對阿特拉津的降解是通過降解基因 atzA、atzB、atzC、atzD、atzE 和 atzF編碼的6個酶來完成，最終可以將阿特拉津完全礦化[23-24]；后者則是由trzN、atzB、atzC這3個基因編碼的酶催化完成，最終只能將阿特拉津降解為氰尿酸[15]。

盡管目前對阿特拉津生物降解的研究已經(jīng)取得了顯著的進步，但鑒于阿特拉津的應(yīng)用范圍及其毒性，仍需要分離更多有效的降解菌以適應(yīng)不同環(huán)境需要。如Ye等[25]在2016年從中國東北的寒黑土壤中分離到Shewanella sp.菌株YJY4，為寒冷地區(qū)的阿特拉津污染修復(fù)提供新的候選菌株。本研究從河北省某農(nóng)藥廠排污廢水中分離出一株阿特拉津降解菌Arthrobacter ureafaciens CS3，并對其生長降解特性和相關(guān)基因等進行了分析。本研究分離的菌株CS3具有較好的耐堿性，豐富了阿特拉津降解的菌種資源并為未來偏堿環(huán)境中阿特拉津污染修復(fù)提供了優(yōu)良候選菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水樣來源

阿特拉津污染水樣采集自河北省某農(nóng)藥廠排污河中的廢水。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

阿特拉津標(biāo)準(zhǔn)樣品和純度97%的阿特拉津原藥，購自北京百靈威科技有限公司。將阿特拉津原藥溶解在甲醇中配制成10000 mg·L-1的母液備用。氰尿酸（純度98%）購自北京百靈威科技有限公司；用于高效液相色譜分析的試劑均為色譜純，其余試劑均為分析純。

無機鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MM）：NaCl 1.0 g、K2HPO41.5 g、KH2PO40.5 g、MgSO40.2 g，蒸餾水定容至 1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0，121℃條件下滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g，蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0，121℃條件下滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集與分離

在無菌條件下取10 mL阿特拉津污染廢水水樣加入到含有50 mg·L-1阿特拉津的100 mL MM中馴化培養(yǎng)，每個樣品6次重復(fù)，30℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d。然后取10 mL培養(yǎng)液接種到100 mL新鮮的培養(yǎng)基中，并逐漸增加培養(yǎng)基中阿特拉津濃度。按相同的富集培養(yǎng)方式培養(yǎng)，直至阿特拉津濃度增加到1000 mg·L-1，馴化結(jié)束。同時將所有濃度的富集培養(yǎng)物分別稀釋 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍，各取0.1 mL稀釋液分別涂布于含有相應(yīng)阿特拉津濃度的LB固體平板上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，挑取LB固體平板上不同形態(tài)特征的單菌落，在LB平板上連續(xù)劃線純化培養(yǎng)，得到純化菌株。

1.2.2 高效降解菌株的篩選

將得到的純化菌株分別接種到LB液體培養(yǎng)基中30℃過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)液以5000 r·min-1離心3 min收集菌體，并用無菌水洗滌兩次。接種1 mL菌懸液到含有50 mg·L-1阿特拉津的50 mL MM中，30℃、150 r·min-1培養(yǎng)7 d。用高效液相色譜法定量測定各樣品中阿特拉津的殘留濃度，并計算降解率，從中篩選出高效阿特拉津降解菌。

1.2.3 高效降解菌株的鑒定

根據(jù)常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊對菌株的形態(tài)和生理生化特征進行鑒定[26]。菌株16S rRNA基因的克隆及序列分析參照如下步驟進行：（1）基因組DNA的提取按照北京全式金生物技術(shù)有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行；（2）采用16S rRNA基因通用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），以基因組DNA為模板，進行PCR擴增。擴增條件為：95℃預(yù)變性 2 min，然后 95℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸90 s，共35個循環(huán)，最終72℃延伸10 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物大小并用北京全式金生物技術(shù)有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit試劑盒純化PCR產(chǎn)物。純化后的PCR產(chǎn)物由生工生物（上海）工程股份有限公司進行測序。通過NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將菌株 16S rRNA基因序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行比對，得出相似性。使用MEGA 6.0軟件中的Neighbor-Joining法對菌株的16S rRNA基因序列進行聚類分析[27]，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，用Bootstrap值進行檢驗，并重復(fù)1000次。

1.2.4 外加碳氮源對菌株生長及降解阿特拉津效果的影響

為了探究外加碳氮源對菌株CS3生長和降解阿特拉津的影響，本研究設(shè)立了四個不同處理，即在MM中分別加入50 mg·L-1阿特拉津作為唯一氮源，1 g·L-1蔗糖作為外加碳源（AT+C）；50 mg·L-1阿特拉津作為唯一碳源，1 g·L-1的NH4NO3作為外加氮源（AT+N）；50 mg·L-1阿特拉津和 1 g·L-1的 NH4NO3作為氮源，1 g·L-1蔗糖作為外加碳源（AT+CN）；只加入 50 mg·L-1阿特拉津作為唯一碳氮源（AT）。然后將1 mL濃度為1×108CFU·mL-1的菌懸液接種到100 mL上述四種培養(yǎng)基中，同時設(shè)立不接種菌液的樣品為空白對照。每個處理組設(shè)三個重復(fù)。將所有樣品在30℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)48 h，每隔12 h取樣測定樣品中的菌濃度和阿特拉津的殘留濃度，并計算阿特拉津的降解率。

另外，為了研究不同碳源對菌株生長及降解阿特拉津效果的影響，本研究分別在MM中添加1 g·L-1葡萄糖、蔗糖、乳糖、檸檬酸鈉作為外加碳源，然后將pH調(diào)節(jié)至7.0，121℃條件下滅菌30 min。將1 mL濃度為1×108CFU·mL-1的菌懸液接種到上述100 mL含有不同外加碳源的培養(yǎng)基中，并加入0.5 mL濃度為10 000 mg·L-1的阿特拉津甲醇母液，使阿特拉津的終濃度為50 mg·L-1。同時設(shè)立沒有添加外加碳源的樣品為空白對照。每個處理組設(shè)三個重復(fù)。將所有樣品在30℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24 h和48 h時取樣測定樣品中的菌濃度和阿特拉津的殘留濃度，并計算阿特拉津的降解率。

菌濃度測定方法：通過紫外分光光度計測定樣品在600 nm處的吸光值（OD600）來表示，阿特拉津降解率的計算參照方法1.2.8進行。

1.2.5 環(huán)境因素對菌株生長及降解阿特拉津效果的影響

為了研究不同的環(huán)境因素如pH、溫度、阿特拉津濃度等對菌株生長及降解阿特拉津的影響，本研究分別設(shè)置不同溫度（4、10、20、30、37、45 ℃）、不同 pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0） 和不同阿特拉津濃度（5、25、50、75、100、200 mg·L-1）處理組。分別將1 mL濃度為1×108CFU·mL-1的菌懸液接種到100 mL含1 g·L-1蔗糖的MM中，并加入0.5 mL濃度為10 000 mg·L-1的阿特拉津甲醇母液，使阿特拉津的終濃度為50 mg·L-1。同時設(shè)立不接種菌液的樣品為空白對照，每個處理組設(shè)三個重復(fù)。將所有樣品在30℃（不同溫度實驗除外）、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24 h和48 h時取樣測定樣品中的菌濃度和阿特拉津的殘留濃度，并計算阿特拉津的降解率。

1.2.6 阿特拉津降解基因的檢測

參考前人報道的 atzA、atzB、atzC、atzD、atzE、atzF、trzD和trzN基因引物序列[23，28-30]，以菌株CS3的基因組DNA為模板對上述8種降解基因進行PCR擴增。擴增條件為：95℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性1 min，最佳退火溫度退火60 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)，最終72℃延伸10 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并由生工生物（上海）工程股份有限公司進行測序。將測序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站上的BLAST 程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）與GeneBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進行同源性比對。

1.2.7 菌株的生長及降解曲線

將1 mL濃度為1×108CFU·mL-1的菌懸液接種到100 mL含1 g·L-1蔗糖的MM中，然后加入0.5 mL濃度為10 000 mg·L-1的阿特拉津甲醇母液，使阿特拉津的終濃度為50 mg·L-1。將樣品分別在30℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)。每隔6 h取樣并測定樣品中的菌濃度、阿特拉津的殘留濃度和氰尿酸濃度。每個處理設(shè)三個重復(fù)。

1.2.8 阿特拉津和氰尿酸的測定

將培養(yǎng)液與二氯甲烷以1∶2的比例混合萃取3次，合并有機相。將合并的有機萃取液放入圓底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將液體濃縮并蒸發(fā)至干，最后用色譜純的甲醇溶液調(diào)節(jié)體積。之后將樣品通過0.22 μm尼龍膜過濾，并裝進樣瓶中備用。

采用HP1050型高效液相色譜（HPLC）儀檢測阿特拉津和氰尿酸的濃度。阿特拉津檢測的液相條件為：反相 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相配比為甲醇∶水=70∶30（V/V），流速為 0.8 mL·min-1，可變波長紫外檢測器，檢測波長為225 nm，柱溫：40℃，進樣量：10 μL。氰尿酸檢測的液相條件為：Thermo氨基色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相配比為甲醇∶0.1%NH3·H2O=70∶30（V/V），流速：1.0 mL·min-1，可變波長紫外檢測器，檢測波長為215 nm，柱溫：30℃，進樣量：10 μL。

根據(jù)HPLC測定的結(jié)果，計算阿特拉津的降解率，計算公式如下：

式中：X為阿特拉津的降解率，%；CX為阿特拉津的終濃度，mg·L-1；CCK為阿特拉津的初始濃度，mg·L-1。

1.3 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計方法

實驗結(jié)果用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差來表示。采用軟件SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA）和相關(guān)性分析以確定所有處理組之間的差異。設(shè)定P＜0.05為顯著性差異。利用Origin 9.0軟件進行作圖。

圖1 菌株CS3的掃描電鏡圖（×20 000倍）Figure1 Scanning electron micrograph of strain CS3（×20 000 times）

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株CS3的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of strain CS3

2 結(jié)果與分析

2.1 高效阿特拉津降解菌的分離及鑒定

經(jīng)分離純化，最終篩選出1株高效阿特拉津降解菌，命名為菌株CS3。菌株CS3為革蘭氏陽性菌，在LB平板上的菌落形態(tài)特征為菌落邊緣整齊，表面凸起，呈金黃色，不透明，粘稠，光滑的圓形菌落。菌株CS3的菌體形態(tài)特征如圖1所示，在培養(yǎng)過程中有明顯的桿、球變化特征，培養(yǎng)2 d的幼齡菌體呈長桿狀，培養(yǎng)6 d后的老齡菌體則呈球狀或短桿狀。菌株CS3不水解淀粉，不產(chǎn)H2S和吲哚，氧化酶陰性，甲基紅試驗、V-P試驗、硝酸鹽還原試驗均為陰性；接觸酶陽性，能夠產(chǎn)氨。

通過PCR擴增得到菌株CS3的16S rRNA基因序列長度為1394 bp（GenBank登錄號為MF612193）。通過NCBI的BLAST程序與已知序列比對可知，菌株 CS3與產(chǎn)脲節(jié)桿菌（Arthrobacter ureafaciens）的16S rRNA基因序列同源，相似性在99%以上；與其余多株節(jié)桿菌屬細菌的16S rRNA基因序列亦同源，相似性都在97%以上。菌株CS3的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）遺傳距離顯示菌株CS3與Arthrobacter ureafaciens的親緣關(guān)系最近，并與其聚集在同一個分支上。結(jié)合其形態(tài)特征及生理生化特征，將菌株CS3初步鑒定為產(chǎn)脲節(jié)桿菌（Arthrobacter ureafaciens）。

2.2 外加碳氮源對菌株生長及降解阿特拉津效果的影響

圖3顯示了外加碳氮源對菌株CS3生長的影響和菌株CS3降解阿特拉津的影響。在整個培養(yǎng)過程中，處理組（AT+CN）和（AT+C）中菌株 CS3的菌濃度都顯著高于（AT+N）和（AT）處理組（P＜0.05）。處理組（AT+N）和（AT）中的菌株CS3的菌濃度增長微弱，且這兩個處理組之間無顯著性差異（P＜0.05）。以上結(jié)果表明外加碳源能夠明顯促進菌株CS3的生長，外加氮源對其生長影響不大，并且菌株CS3能夠利用阿特拉津作為唯一氮源生長，不能利用其作為唯一碳源生長。培養(yǎng)36 h之前，處理組（AT+CN）和（AT+C）中的阿特拉津降解率均顯著高于處理組（AT+N）和（AT）。36 h之后所有處理組中的阿特拉津基本都被完全降解，各處理組之間無顯著性差異，表明外加碳源或氮源對阿特拉津降解率的影響并不大。

外加不同碳源對菌株CS3生長的影響如圖4所示。在整個培養(yǎng)過程中，在含有外加蔗糖的處理組中菌株CS3的菌濃度都明顯高于其他處理組；其次為乳糖。葡萄糖處理組中的菌株生長最慢，與對照組之間無顯著性差異。以上結(jié)果表明外加蔗糖、乳糖和檸檬酸鈉均會明顯促進菌株CS3的生長，其中最佳外加碳源為蔗糖。葡萄糖對菌株CS3的生長無顯著影響。圖4還顯示了外加不同碳源對菌株CS3降解阿特拉津的影響。在培養(yǎng)24 h時，在含有外加蔗糖的處理組中菌株CS3對阿特拉津的降解效果最好且顯著高于其他處理組，其次為乳糖。培養(yǎng)48 h之后，外加蔗糖、乳糖和檸檬酸鈉的3個處理組中阿特拉津降解率均達到95%以上，無顯著性差異。此時葡萄糖處理組中菌株CS3對阿特拉津的降解率最低，僅為29.53%，甚至遠低于對照組的83.04%。綜上可知，外加葡萄糖會抑制菌株CS3對阿特拉津的降解，外加蔗糖、乳糖和檸檬酸鈉則均會促進菌株CS3對阿特拉津的降解。

圖3 外加碳氮源對菌株CS3生長及阿特拉津降解的影響Figure3 Growth and atrazine degradation of strain CS3 with exogenous carbon or nitrogen sources

圖4外加不同碳源對菌株CS3生長及阿特拉津降解的影響Figure4 Growth and atrazine degradation of strain CS3 with different carbon sources

2.3 環(huán)境因素對菌株生長及降解阿特拉津效果的影響

圖5 顯示了不同pH值、不同溫度和不同阿特拉津濃度對菌株CS3生長及降解阿特拉津效果的影響。當(dāng)pH值為7時菌株CS3的生長最好，對阿特拉津的降解率也最高。當(dāng)pH為6時，菌株生長及對阿特拉津的降解都受到較大影響，48 h后的阿特拉津降解率下降為58.90%。當(dāng)pH低于4時，菌株幾乎不能生長，48 h后對阿特拉津的降解率低于20%，表明該菌株不適宜在酸性環(huán)境降解阿特拉津。當(dāng)pH為11時，菌株仍能較好地生長，48 h后對阿特拉津的降解率依然保持在90%以上。當(dāng)pH為12時，菌株生長及對阿特拉津的降解則會受到較大影響，48 h后對阿特拉津的降解率為31.40%。由此可知菌株CS3能夠生長和降解阿特拉津的pH范圍在5～11之間，范圍很寬且具有較好的耐堿性，偏堿性環(huán)境對阿特拉津的降解效果影響不大。因此該菌株可以作為未來偏堿環(huán)境中修復(fù)阿特拉津污染的優(yōu)良候選菌株。

溫度過高或過低會抑制阿特拉津降解菌的生長，同時影響阿特拉津降解菌代謝和降解酶活性[31]。由圖5可知，菌株CS3生長和降解阿特拉津的最佳溫度為30℃，在溫度范圍為10～37℃之間，具有一定的生長和降解能力。當(dāng)溫度低于4℃或高于45℃時，菌株CS3幾乎不能生長。顯著性分析表明在實驗溫度條件下菌株CS3的生長與對阿特拉津的降解率之間存在極顯著相關(guān)性（R=0.959**）。

由圖5可知，當(dāng)阿特拉津濃度為5 mg·L-1時，菌株CS3的濃度基本保持不變，OD600的值沒有明顯增加，原因可能是低濃度阿特拉津不能夠為菌株生長提供足夠的營養(yǎng)。阿特拉津濃度在5～50 mg·L-1之間時，OD600的值隨著阿特拉津濃度的增高而逐漸增加。當(dāng)阿特拉津濃度超過50 mg·L-1后，OD600值開始下降，推測可能是因為高濃度的阿特拉津會對菌株CS3的生長產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)阿特拉津濃度高于75 mg·L-1時，由于其低水溶性（33 mg·L-1）而不能完全溶解在培養(yǎng)基中，因此之后未測定OD600的值。培養(yǎng)24 h時，隨著阿特拉津濃度的升高，降解率逐漸降低。培養(yǎng)48 h后，只有阿特拉津濃度為200 mg·L-1處理組的阿特拉津降解率為96.15%，其余處理組阿特拉津降解率都達到98.81%以上，且與其余處理組之間都存在顯著性差異。但在試驗最高濃度（200 mg·L-1）以內(nèi)，阿特拉津的降解率最終不會受到太大影響。另經(jīng)實驗證明，菌株CS3能在6 d內(nèi)將500 mg·L-1的阿特拉津降解完全（數(shù)據(jù)未顯示）。綜上可知，菌株CS3對低濃度和高濃度的阿特拉津都具有較好的降解能力。

圖5 不同環(huán)境條件對菌株CS3生長及阿特拉津降解的影響Figure5 Growth and atrazine degradation by strain CS3 under different culture conditions

圖6 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測菌株CS3的阿特拉津降解基因Figure6 Agarose gel electrophoresis（1%）detection of atrazinedegrading genes of strain CS3

2.4 阿特拉津降解基因的檢測

通過PCR擴增，分別獲得444 bp的trzN基因、537 bp的atzB基因和630 bp的atzC基因。盡管本研究還嘗試了用不同的擴增條件和引物去擴增其他5種降解基因，但是最終都未成功（圖6）。將序列測序后與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列比對，結(jié)果顯示本研究獲得的基因trzN（GenBank登錄號MF774327）分別與 Arthrobacter sp.SD41（KP994319）[32]和 Arthrobacter sp.C3（KR263873）[33]的 trzN 基因同源性分別為100%、99%。基因 atzB（GenBank登錄號 MF774328）和atzC（GenBank登錄號MF774329）分別與Arthro-bacter aurescens TC1（AY456696）[34]的 atzB 和 atzC 基因的同源性分別為98%和99%。

2.5 菌株的生長及降解曲線

從圖7可以看出，12 h內(nèi)OD600的值增加緩慢，對阿特拉津的降解效果也不明顯，可能因為前12 h菌株CS3處于延滯期，對于環(huán)境需要一個適應(yīng)的過程。從12 h開始菌株進入對數(shù)生長期，OD600的值增長迅速，其對阿特拉津的降解速度也相應(yīng)加快。到48 h時菌株CS3進入生長穩(wěn)定期，OD600的值基本保持不變，此時阿特拉津也被降解完全。在整個降解過程中，氰尿酸的濃度變化與阿特拉津濃度變化趨勢完全相反，從12 h至36 h之間濃度急劇增加，到48 h后保持在30 mg·L-1左右不再增加。相關(guān)性分析也表明，菌株的生長與阿特拉津的降解之間具有極顯著正相關(guān)性（R=0.991**），而氰尿酸濃度與阿特拉津濃度之間具有極顯著負(fù)相關(guān)性（R=-0.989**）。此外，阿特拉津的初始平均摩爾濃度等于累積的氰尿酸的平均摩爾濃度。以上結(jié)果表明，阿特拉津的降解和菌株的生長基本同步。結(jié)合菌株CS3降解基因的檢測結(jié)果，推測菌株CS3可能只能降解阿特拉津為無毒的氰尿酸，而不能進一步代謝氰尿酸為CO2和NH3。

圖7 菌株CS3的生長曲線及阿特拉津降解曲線Figure7 Growth curve of strain CS3 and atrazine degradation curve by strain CS3

3 討論

目前已經(jīng)報道了許多從不同地方分離到的屬于節(jié)桿菌屬的阿特拉津降解菌，如菌株HIM[35]、GZK-1[1]、KU001[36]、TC1[34]、ADH-2[37]、AD26[38]、MCM B-436[39]、AG1[40]、FM326[41]等。另有許多報道指出，該屬細菌能夠降解許多其他有機污染物，如苯胺、苯酚、石油、有機磷農(nóng)藥等[15，39]。這些工作顯示出節(jié)桿菌屬菌株在污染位點生物修復(fù)方面具有巨大潛力。

研究報道多數(shù)阿特拉津降解菌能夠以阿特拉津為氮源進行生長并將它降解[14，38，42-44]，因此外加氮源會抑制多數(shù)菌株對阿特拉津的利用和降解[45]，對外源氮源不敏感的阿特拉津降解菌的報道很少。本研究中菌株CS3也能夠利用阿特拉津為唯一氮源，但是外加氮源對其生長和降解阿特拉津沒有太大影響，具體原因還在進一步研究中。

本研究中，外加蔗糖、乳糖和檸檬酸鈉能夠促進菌株CS3的生長及對阿特拉津的降解，外加葡萄糖則會抑制其對阿特拉津的降解。不同外加碳源對不同阿特拉津降解菌的影響不同。在某些情況下，外加碳源甚至可以抑制阿特拉津的降解。前人研究報道，外加蔗糖和葡萄糖能顯著促進菌株ADH-2的生長，但對阿特拉津的降解表現(xiàn)出顯著的抑制，而淀粉對其生長和阿特拉津降解均表現(xiàn)出促進效應(yīng)[37]。Wang等[43]研究表明加入蔗糖、檸檬酸鈉或半乳糖可顯著促進菌株DAT1的生長，蔗糖是其生長最適合的碳源。然而，Wang等[46]2011年發(fā)現(xiàn)加入蔗糖并沒有加速菌株HB-5對阿特拉津的降解。李紹峰等[47]研究發(fā)現(xiàn)降解菌株L-6可以利用葡萄糖、果糖和檸檬酸鈉生長，不能利用蔗糖、乳糖和淀粉。因此，不同阿特拉津降解菌的生長及對阿特拉津的降解依賴于有機物質(zhì)的類型[42]。

與許多菌株，如菌株 HB-5[46]、DNS10[42]、T3AB1[48]、X-4[49]、FM326[41]等相比，菌株CS3能夠生長并降解阿特拉津的pH范圍更寬。菌株CS3降解阿特拉津的pH范圍不僅很寬，且具有一定的嗜堿性，在pH值為11的條件下，也具有很高的降解特性，這對于未來偏堿環(huán)境中修復(fù)阿特拉津提供了更好的選擇。

已經(jīng)分離到的節(jié)桿菌屬阿特拉津降解菌株中，除AD1[14]、MCMB436[39]、C3[33]外，許多其他 Arthrobacter sp.菌株都含有trzN、atzB、atzC基因。菌株CS3中包含的阿特拉津降解基因組合與許多已經(jīng)報道的節(jié)桿菌菌株如 SD41[32]、TC1[34]、ADH-2[37]、AD26[38]、X-4[49]、KU001[36]、DNS10[42]、DAT1[43]等含有相同的基因組合（trzN-atzBC）。結(jié)合前人報道的阿特拉津降解基因及降解途徑的研究報道[23-24]，初步推測其只能將阿特拉津降解為無毒的氰尿酸，而不能完全將阿特拉津礦化。菌株CS3降解阿特拉津的實驗結(jié)果也顯示，當(dāng)阿特拉津被降解時會積累氰尿酸，且阿特拉津的初始平均摩爾濃度等于累積的氰尿酸的平均摩爾濃度。因此可以推測菌株CS3通過trzN-atzB-atzC代謝途徑，經(jīng)水解脫氯和脫烷基化，將阿特拉津轉(zhuǎn)化為氰尿酸，但不能進一步催化三嗪環(huán)的裂解，使氰尿酸進一步降解為 CO2和 NH3[1，50-51]。

菌株CS3具有較好的降解性，對低濃度和高濃度阿特拉津都具有較好的降解能力。其降解速率遠高于Zhang等[31]篩選的菌株N1以及Vaishampayan等[39]報道的菌株MCM B-436，前者96 h將20 mg·L-1阿特拉津降解66.4%，后者30 h將25 mg·L-1阿特拉津完全降解。

目前本研究只是在實驗室條件下進行，下一步將重點研究其在生態(tài)環(huán)境中的實際應(yīng)用效果及特性，為進一步提高其實際應(yīng)用效果提供基礎(chǔ)。此外，關(guān)于菌株CS3與其他降解菌之間是否存在共存互作以及相互之間的互作機制也在進一步研究當(dāng)中。

4 結(jié)論

（1）從河北某農(nóng)藥廠排污河中的廢水中分離出一株以阿特拉津為唯一氮源生長的高效降解阿特拉津降解菌CS3。經(jīng)生理生化鑒定和16S rRNA基因序列分析，將其鑒定為產(chǎn)脲節(jié)桿菌（Arthrobacter ureafaciens）。

（2）菌株 CS3 含有降解基因 trzN、atzB、atzC，能夠?qū)⑻乩蚪到鉃闊o毒的氰尿酸。

（3）在最適條件（30℃，pH 為 7）下，菌株 CS3能在48 h內(nèi)完全降解50 mg·L-1的阿特拉津。甚至能夠在6 d內(nèi)將500 mg·L-1的阿特拉津完全降解，表明該菌株具有很好的降解能力。

（4）菌株CS3生長和降解阿特拉津的溫度和pH范圍較寬，分別為10～37℃和5～11，顯示出較好的環(huán)境生存能力及較好的生物修復(fù)潛力。此外，菌株CS3生長和降解阿特拉津的pH范圍表明該菌株具有較好的耐堿性，為未來偏堿環(huán)境中阿特拉津污染修復(fù)提供了良好的候選菌株。

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