H2S和NO在大白菜抵抗高溫脅迫中的作用

解夢潔，賀 烽，張麗萍，金竹萍，劉旦梅，裴雁曦

（山西大學生命科學學院，太原 030006）

植物對環(huán)境脅迫的承受和適應能力，是當前植物生理生態(tài)研究的熱點之一。隨著全球溫室效應加劇，高溫對植物生長的影響也日趨顯著。高溫脅迫可能擾亂細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，造成植物葉片萎蔫、植物體生長發(fā)育遲緩、甚至死亡[1]。

長期以來，一氧化氮（Nitric oxide，NO）被認為是一種大氣污染物，直到20世紀80年代，美國藥理學家Furchgott等發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞在乙酰膽堿等作用下產(chǎn)生了一種新型血管內(nèi)皮細胞松弛因子（Endothelium-derived relaxing factor，EDRF），這種因子就是NO。至此，有關(guān)NO信號分子作用的研究得到快速發(fā)展[2]。作為重要的氣體信號分子，NO參與植物的多種生理過程，如種子萌發(fā)、葉的伸展、根生長、去黃化、花的形成、果實的成熟及衰老等，同時也通過多種信號通路提高植物對生物和非生物脅迫的耐受性，研究表明，NO可以通過與H2O2和水楊酸共同作用，提高水稻幼苗抵抗鹽脅迫的能力[1-3]。此外，有報道稱，NO在脅迫期間還可觸發(fā)全身生物反應[2]。

硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S）在植物體生長發(fā)育及脅迫響應中的生理作用也受到廣泛關(guān)注[4]。早在20世紀80年代就發(fā)現(xiàn)植物體可以釋放H2S，但其生理功能近年來才逐漸被揭示。研究表明，H2S供體硫氫化鈉（NaHS）可以緩解甘薯葉片中葉綠素濃度的下降。另外，噴灑NaHS可以增加抗氧化酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和抗壞血酸過氧化物酶的活性，同時降低小麥幼苗中過氧化氫的濃度和脂氧合酶活性，表明H2S在保護植物氧化應激方面起著重要的作用[11]。除此之外，H2S還參與植物生長發(fā)育的許多過程，如調(diào)節(jié)氣孔運動、促進根的發(fā)育以及增強光合作用[5-7]；H2S還參與植物應答環(huán)境脅迫，能緩解干旱、滲透和金屬離子等多種非生物脅迫對植物造成的傷害[8-11]。

作為氣體信號分子，NO和H2S均能增強植物對逆境的耐受能力，但是兩者在植物對高溫脅迫的共同響應關(guān)系方面尚不明確。大白菜是我國北方重要的經(jīng)濟作物，高溫脅迫嚴重影響其生長。本文以大白菜為材料，結(jié)合藥理學和植物生理生化研究方法，檢測高溫下大白菜幼苗的生長情況，測定脅迫條件下的內(nèi)源H2S和NO含量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量、細胞死亡率等的變化，并結(jié)合氣體信號分子外源處理的方法，探討二者在大白菜響應高溫脅迫時的生理作用及其相互影響。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)和處理

實驗材料為津育75大白菜（Brassicarapa Pekinensis）。將經(jīng)過4℃過夜浸泡的種子均勻播種在鋪好紗布的培養(yǎng)皿中，加蒸餾水20 mL，23℃黑暗處理2 d，然后在溫度23℃、濕度50%、光照強度3000 lx、光周期16 h/8 h（晝夜）條件下培養(yǎng)，7 d后進行相關(guān)預處理，之后放入43℃人工氣候培養(yǎng)箱中進行高溫脅迫處理[12]。

處理分為3個階段：在熱脅迫對白菜幼苗生長及內(nèi)源H2S、NO含量影響實驗中，處理分為6組，分別為熱脅迫 0、1、3、5、7、9 h。在外源 H2S 和 NO 預處理對脅迫下幼苗生長的影響實驗中，實驗分為2個部分，每部分有6個處理組（表1），其中外源H2S與外源NO處理分別用50 μmol·L-1的H2S供體硫氫化鈉（Sodium hydrosulfide，NaHS）和 50 μmol·L-1的 NO 供體硝普鈉（Sodium Nitroprusside，SNP）溶液進行熏蒸，白菜處理的熏蒸裝置為容積7 L的密封透明玻璃缸，將相應濃度的NaHS和SNP溶液分別加入1.5 mL離心管，開蓋暴露在玻璃缸內(nèi)進行熏蒸處理，對照（CK）處理組放入盛有蒸餾水的離心管。清除內(nèi)源H2S和NO分別用1 mmol·L-1的H2S清除劑亞?；撬幔℉y potaurine，HT）和 1 mmol·L-1的 NO 清除劑 cPTIO（Carboxy-PTIO）溶液處理，將以上兩種溶液加入培養(yǎng)皿中，對照組加入等量蒸餾水，所有實驗組進行4 h處理后，去掉玻璃缸進行熱脅迫。每個處理做3次實驗內(nèi)重復。

整個實驗做3次生物學重復。

表1 外源H2S和外源NO不同處理組Table1 Different treatment for exogenous H2S and NO

1.2 測定方法

H2S含量測定參考金竹萍等[13]的方法；NO含量測定使用碧云天（S0021）NO檢測試劑盒；可溶性糖含量測定參考文獻[14]；可溶性蛋白含量及脯氨酸含量測定參考李合生[15]的方法；相對電導率測定使用上海雷磁（DDS-11 D）電導率儀。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 17軟件Duncan檢測進行顯著性分析，圖表由SigmaPlot 10軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對大白菜幼苗生長及內(nèi)源H2S、NO含量的影響

高溫脅迫對大白菜幼苗造成損傷，隨著脅迫時間的延長，幼苗的受傷害程度不斷加深。43℃處理1 h，植株長勢相對弱小，葉片卷曲。隨著處理時間的延長，葉片萎蔫，翻卷程度加深，處理9 h，部分幼苗出現(xiàn)整株萎蔫枯死現(xiàn)象（圖1）。

H2S和NO都是植物體內(nèi)重要的氣體信號分子，研究表明內(nèi)源H2S和NO均能對高溫脅迫做出響應。隨脅迫時間的延長，內(nèi)源H2S含量逐漸上升，脅迫5 h時幼苗H2S含量最高，并在5 h之后呈現(xiàn)下降趨勢；同時脅迫1～5 h，NO含量變化不明顯，但在脅迫7 h時NO含量顯著升高。根據(jù)以上實驗結(jié)果，后續(xù)實驗分別選取脅迫5 h和7 h的幼苗進行H2S和NO含量測定（圖2）。

圖1 高溫脅迫對大白菜幼苗生長的影響Figure1 Effect of heat stress on the growth of Chinese cabbage seedlings

圖2 高溫脅迫下內(nèi)源H2S、NO含量變化Figure2 Changes of endogenous H2S and NO contents under heat stress

圖3 不同處理下大白菜幼苗的生長情況Figure3 Growth of Chinese cabbage seedlings under different treatments

2.2 不同處理對高溫脅迫下白菜幼苗表型變化的影響

正常生長情況下（23℃）NaHS和HT處理的幼苗生長狀態(tài)與CK相比區(qū)別不大。43℃脅迫條件下，未經(jīng)NaHS處理的幼苗葉片明顯萎蔫、翻卷；而NaHS預處理后，脅迫并未造成明顯的幼苗變?nèi)跎踔廖璧默F(xiàn)象；HT處理后的幼苗，脅迫造成的萎蔫更加嚴重，甚至有部分幼苗枯死（圖3A）。說明外源H2S處理可以改善高溫脅迫對白菜幼苗葉片的損傷，相反HT會加重脅迫對幼苗的損傷。

正常生長情況下（23℃）SNP和cPTIO處理對幼苗生長沒有明顯影響。43℃脅迫時，未經(jīng)處理的幼苗出現(xiàn)明顯的萎蔫翻卷現(xiàn)象，甚至個別幼苗枯死；SNP預處理后，幼苗失綠并有部分萎蔫；cPTIO處理的幼苗，萎蔫嚴重，也有枯死現(xiàn)象（圖3B）。說明外源NO也能幫助大白菜幼苗抵御脅迫，而NO清除劑cPTIO起到相反作用。

2.3 H2S和NO對高溫脅迫下白菜幼苗的生理影響

可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸是植物中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在維持植物蛋白質(zhì)穩(wěn)定及對保持細胞與環(huán)境的滲透平衡中起到重要作用[16]。

正常生長狀態(tài)下，NaHS、HT、SNP、cPTIO 處理的幼苗與CK相比，可溶性糖含量無明顯變化。43℃脅迫條件下，未處理的大白菜幼苗可溶性糖含量顯著升高，而與23℃CK相比，NaHS預處理后可溶性糖含量升高不顯著，HT預處理后可溶性糖含量顯著升高；同樣，分別將43℃時SNP處理后幼苗和cPTIO處理后的幼苗與CK（23℃）的幼苗進行對比，可溶性糖含量的變化趨勢與上述NaHS和HT處理后的變化趨勢相類似（圖4A和圖4B）。

參考上述相同的方法處理大白菜幼苗并檢測其可溶性蛋白含量，結(jié)果如圖4中C、D所示。23℃環(huán)境中生長的大白菜幼苗，CK 與 NaHS、HT、SNP、cPTIO處理的幼苗可溶性蛋白含量無明顯差異。與23℃CK相比，43℃脅迫條件下，未經(jīng)預處理及HT、cPTIO預處理后的幼苗可溶性蛋白含量顯著升高，而NaHS和SNP預處理后可溶性蛋白升高不顯著。

如圖4中E、F結(jié)果可見，23℃環(huán)境中生長的大白菜幼苗，無論是否進行預處理，脯氨酸含量均無顯著變化。而43℃脅迫時脯氨酸含量與23℃CK相比顯著升高，NaHS和SNP預處理后升高不明顯，HT和cPTIO預處理后顯著升高。上述實驗結(jié)果說明高溫脅迫條件下細胞滲透性物質(zhì)可溶性糖、可溶性蛋白與脯氨酸含量升高，外源H2S與NO能夠降低脅迫下細胞滲透性物質(zhì)的含量，緩解高溫對細胞滲透性的破壞。

細胞膜透性的大小可用組織的相對電導率衡量，組織相對電導率越高，說明細胞膜遭到破壞的程度越大。正常環(huán)境（23℃）中生長的幼苗，處理組與CK相比，相對電導率沒有明顯差異。43℃環(huán)境中生長的幼苗相對電導率顯著升高，NaHS預處理使脅迫下的幼苗相對電導率恢復到與23℃CK同一水平，而SNP預處理，相對電導率較CK沒有明顯變化，但顯著低于cPTIO處理組；同時HT和cPTIO預處理的幼苗相對電導率與CK（23℃）相比顯著升高（圖4G和圖4H）。該實驗結(jié)果也說明高溫脅迫會使細胞膜完整性遭到破壞，H2S和NO清除劑會加劇高溫對細胞膜的損傷作用，而外源H2S與NO部分降低細胞在脅迫條件下的損傷率。

2.4 不同處理對高溫脅迫下白菜幼苗H2S和NO含量的影響

在動物的生理活動中，NO和H2S可以調(diào)節(jié)彼此的代謝，甚至共同起作用[17]。由于氣體信號分子可自由通過細胞膜，其作用可不依賴于質(zhì)膜受體，因此在外源施加H2S或NO供體時，氣體信號分子進入植物體內(nèi)，導致內(nèi)源H2S和NO含量上升，外源施加清除劑時，內(nèi)源氣體信號分子含量下降（圖5A和圖5B）。23℃生長環(huán)境下，外源施加NO和H2S分別對內(nèi)源H2S和NO的產(chǎn)生沒有明顯影響。而43℃脅迫時，內(nèi)源H2S與NO含量顯著升高，外源施加NO后，內(nèi)源產(chǎn)生的H2S含量變化不明顯，用cPTIO預處理后H2S含量變化不顯著，說明在熱脅迫時，外源NO對白菜幼苗產(chǎn)生H2S能力沒有顯著影響（圖5C）。脅迫條件下，外源施加H2S后NO含量明顯降低，相反若用H2S清除劑HT預處理，NO含量恢復到CK水平，可以看出在熱脅迫時，外源H2S可能會使內(nèi)源NO含量升高（圖5D）。

3 討論

逆境脅迫會導致葉片失水，進而影響葉綠素生物合成，加速葉綠素的分解，導致葉片萎蔫變黃[18]。本實驗中43℃脅迫1 h后，大白菜幼苗生長受到抑制，并且隨著高溫脅迫的時間延長，幼苗受損加劇，該現(xiàn)象與其他作物在高溫下的表現(xiàn)相同[19]?？梢姶蟀撞擞酌鐚Ω邷孛舾?，對持續(xù)高溫抵御能力差。有報道表明，在植物受到非生物脅迫時，內(nèi)源H2S和NO含量都會上調(diào)[16]。本實驗中，外源施加H2S和NO，可緩解高溫脅迫下大白菜幼苗的受損傷程度，表明H2S和NO作為氣體信號分子，參與對大白菜幼苗對高溫脅迫的響應。

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是植物耐熱和抵御高溫逆境的重要生理機制之一，高溫脅迫誘發(fā)的細胞脫水而使?jié)B透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累是高溫對細胞造成損害的主要原因[20]。但也有研究表明，高溫導致的光合色素降低會使光合產(chǎn)生的可溶性糖含量降低[21]。本實驗中，高溫造成細胞膜損傷，導致細胞滲透性遭到破壞，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量升高。外源施加H2S和NO后，高溫脅迫下的大白菜幼苗中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量都有所降低。說明大白菜幼苗的滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)會對高溫脅迫做出響應，并且外源H2S和NO有調(diào)控滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的作用，可能通過降低高溫脅迫對細胞膜造成的損傷來緩解滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累。

圖4 不同處理對高溫脅迫下白菜幼苗的生理影響Figure4 Effects of different treatments on physiology of cabbage seedlings during heat stress

植物受到高溫脅迫時脫水造成細胞膜液態(tài)化，膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起蛋白的凝聚和變性，導致外滲液急劇增加，相對電導率升高[19]。H2S可以通過調(diào)節(jié)氣孔開度響應逆境[22]。本實驗中高溫脅迫下的白菜幼苗細胞外滲液相對電導率顯著升高，可以看出高溫脅迫會使白菜幼苗細胞受損嚴重，細胞死亡率升高。而施加外源H2S后，相對電導率降低，施加外源NO供體，相對電導率變化不明顯，但清除劑的相反作用十分顯著，說明NO對熱脅迫下電導率有部分的恢復作用，這可能是通過H2S和NO對氣孔的調(diào)節(jié)，減少細胞水分散失來減緩細胞受損傷程度，降低細胞死亡率。

H2S和NO作為植物的氣體信號分子，參與植物對非生物脅迫的響應。本實驗中，當白菜幼苗受到高溫脅迫時，H2S含量和NO含量都顯著上調(diào)，H2S含量變化尤為明顯，隨著脅迫時間延長呈現(xiàn)倒“U”趨勢，可能是因為脅迫時間過長，大多數(shù)幼苗受到嚴重損傷，部分喪失調(diào)節(jié)能力造成。

Shi等[23]指出，NO會誘導H2S的合成進而增強植物對鎘脅迫的耐受，表明鎘脅迫下NO的產(chǎn)生先于H2S的產(chǎn)生。本研究結(jié)果可見，H2S對高溫脅迫的響應優(yōu)先于NO。外源施加NO后，內(nèi)源產(chǎn)生的H2S含量稍有降低，但不顯著；但外源施加H2S后，植物內(nèi)源產(chǎn)生的NO含量顯著下調(diào)。由此推測，高溫脅迫時H2S和NO的相互作用模式與鎘脅迫不完全一致。

圖5 不同處理對高溫脅迫下大白菜幼苗H2S和NO含量的影響Figure5 Effects of different treatments on the H2S and NO contents of cabbage seedlings after during heat stress

4 結(jié)論

大白菜幼苗在熱脅迫條件下，可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量以及相對電導率等生理指標均出現(xiàn)不同程度的波動來響應脅迫，外源施加H2S和NO可緩解脅迫對幼苗造成的損傷。并且在熱脅迫響應過程中，外源H2S會抑制NO的產(chǎn)生，而NO對H2S的含量變化沒有明顯影響。

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