硅對鎘脅迫條件下兩個水稻品種鎘亞細(xì)胞分布、非蛋白巰基物質(zhì)含量的影響

李江遐，張 軍，馬友華*，蔡慢弟，高 飛

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036）

污水灌溉、污泥農(nóng)用以及農(nóng)藥和化肥的不合理施用，使農(nóng)田土壤受到不同程度的重金屬污染。據(jù)報道，目前我國遭受重金屬污染的土地面積占灌區(qū)總面積的64.8%[1]，尤以鎘（Cd）污染最為普遍。我國農(nóng)田Cd污染有日益加重的趨勢[2]。水稻是我國第一大作物，種植面積大、產(chǎn)量高、分布范圍廣，大部分人每天以稻米為主食。研究表明，水稻是極易累積Cd的作物，Cd可以從水稻根系向地上部轉(zhuǎn)運，從而導(dǎo)致稻米中Cd含量嚴(yán)重超標(biāo)[3-5]。受污染的水稻所產(chǎn)出的稻米可以通過食物鏈進(jìn)入人體，對人體危害很大。

目前采取施用鈍化劑的方法降低污染農(nóng)田土壤中重金屬的生物有效性，進(jìn)而阻止其對農(nóng)作物的污染，使一些污染程度較低的農(nóng)田可以繼續(xù)生產(chǎn)安全的農(nóng)產(chǎn)品。但因土壤類型、鈍化劑種類不同，不同土壤上施用鈍化劑的效果差別較大。硅（Si）是水稻的必需營養(yǎng)元素，它可提高植物對重金屬毒害的耐受力和農(nóng)作物的產(chǎn)量并改善作物品質(zhì)[6]。Si通過減少植物對重金屬的吸收及重金屬由根向地上部的轉(zhuǎn)運，增強(qiáng)植物對礦質(zhì)元素的吸收，提高植物細(xì)胞的抗氧化能力，保護(hù)植物免受重金屬的毒害[7]。對兩種Cd耐受力不同的花生進(jìn)行Si、Cd處理，研究表明Si可以減輕兩品種花生Cd毒害。對于Cd敏感品種，Si抑制Cd由根向地上部的運輸，降低葉片細(xì)胞器中的Cd含量；對于Cd耐性品種，Si主要降低莖中Cd含量同時刺激抗氧化系統(tǒng)以減輕Cd毒害[8]。Si對水稻幼苗Cd分布的影響研究結(jié)果表明，Si能夠降低水稻根及莖中Cd的含量，但沒有明顯改變Cd在共質(zhì)體及質(zhì)外體中的分布比例[9]。

目前有關(guān)植物螯合肽（PC）對重金屬的解毒機(jī)制及其在污染生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用備受關(guān)注。Cd在水稻體內(nèi)主要是以PC-Cd絡(luò)合物或Cd-GSHx絡(luò)合物[10]的形式運輸。PC對Cd離子的螯合能力很強(qiáng)，在Cd累積和解毒過程中發(fā)揮重要作用[11]。

本試驗采用營養(yǎng)液培養(yǎng)方法研究了不同Si濃度處理對水稻短期Cd脅迫的緩解效果，測定了水稻植株中非蛋白巰基（NPT）含量的變化及Cd的亞細(xì)胞分布特征。從微觀層次揭示Si對籽粒Cd含量不同的兩種水稻品種積累Cd的差異機(jī)理，以期探索Si對水稻Cd吸收積累的影響，從而為合理施用硅肥減輕土壤Cd毒害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

通過前期對我國南方80個栽種雜交水稻品種的篩選研究，選取籽粒含Cd量差異較大的2個雜交水稻品系：寧粳4號（籽粒低Cd含量品種，NJ4）和徽兩優(yōu)6號（籽粒高Cd含量品種，HY6）。兩品種的生育期為（150±20）d。水稻種子由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

將水稻種子經(jīng)過蒸餾水浸泡24 h后，催芽48 h，用蒸餾水澆灌1周后改為1/2營養(yǎng)液培養(yǎng)。選擇生長均勻健壯的幼苗移栽。調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH5.5左右，每周更換2～3次。培養(yǎng)4周后將水稻幼苗分別置于Si濃度為 0、0.5、1.8 mmol·L-1，Cd 濃度 0、50 μmol·L-1的營養(yǎng)液中培養(yǎng)，處理7 d后收獲。試驗處理如下：CK（Cd 0 μmol·L-1，Si 0 mmol·L-1）；T1（Cd 50 μmol·L-1，Si 0 mmol·L-1）；T2（Cd 50 μmol·L-1，Si 0.5 mmol·L-1）；T3（Cd 50 μmol·L-1，Si 1.8 mmol·L-1）。每個處理重復(fù) 3次，Cd 脅迫采用氯化鎘（CdCl2，AR）配制，Si采用硅酸鈉（Na2SiO3，AR）配制。

1.2 測定方法

1.2.1 生物量測定

樣品采集收獲后，用去離子水清洗3次，將水稻幼苗在天平上測定生物量。先將水稻幼苗從基部剪開，至于115℃殺青30 min，85℃烘干至恒重，測定地上部和根部的干重。

1.2.2 Cd含量和轉(zhuǎn)移系數(shù)的測定

將預(yù)處理的水稻幼苗烘干樣粉碎，然后稱取粉碎樣0.200 0 g于消煮管中，然后加入10 mL濃硝酸過夜。第2 d，先進(jìn)行微波消煮，然后在通風(fēng)櫥中高溫趕酸，最后將消煮液定容到50 mL的容量瓶中，用原子吸收分光光度計（AAS）測定樣品中的Cd含量[12]。

1.2.3 NPT的測定

NPT采用 5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）顯色法測定。稱取鮮樣1.00 g，加入4 mL預(yù)冷的5%磺基水楊酸，冰浴研磨，離心（Beckman-CoulterAvantiJ-25 8000×g，4 ℃）15 min，取上清液 0.8 mL，依次加入 3.05 mL 0.25 mol·L-1的 Tris-HCl（pH 8.3）和 0.15 mL 10 mmol·L-1的 DTNB，室溫下放置20 min，然后用分光光度計（波長412 nm）測定樣品的吸光度值[13]。以等量的未加DTNB的溶液作為對照，以GSH-SH為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。

1.2.4 Cd在水稻植株各器官的亞細(xì)胞分布

采用差速分級離心技術(shù)分離出各器官不同細(xì)胞組分[14]，稱取0.200 0 g樣品，加入2 mL提取劑，提取劑由0.25 mol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1Tris-HCl（調(diào)整pH在7.5左右）、1.0 mmol·L-1二硫赤蘚糖醇和5.0 mmol·L-1抗壞血酸組成。將研缽置于碎冰塊上，在研缽中將樣品研磨至勻漿，轉(zhuǎn)移到2 mL的離心管中，放于高速低溫冷凍離心機(jī)中7000 r·min-1離心20 min，沉淀為細(xì)胞壁（F1）組分；再將上清液倒入2 mL離心管，在高速低溫冷凍離心機(jī)中12 000 r·min-1離心40 min，此時得到的上清液用于細(xì)胞可溶性組分（F2）Cd含量測定，沉淀用于細(xì)胞器組分（F3）Cd含量測定，全部操作均在4℃下進(jìn)行[5]。獲得的上清液及沉淀分別用濃硝酸移入50 mL三角瓶中，放置過夜后于電熱板上消煮，少量多次地加入共5 mL混合酸（硝酸∶高氯酸=4∶1，體積比）消煮至澄清[14]，過濾并定容至50 mL，用石墨爐-原子吸收法測定Cd含量。

表1 兩品種水稻的生物量（g·盆-1）Table1 Dry weight of shoots and roots of rice plants（g·pot-1）

表2 兩品種水稻Cd含量及轉(zhuǎn)移系數(shù)Table2 Cd content and translocation ratios of two rice varieties

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用Excel 2003對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和SPSS Statistics 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Si對Cd脅迫下兩種水稻生物量的影響

Si對Cd脅迫下兩種水稻生物量的影響見表1。結(jié)果表明，單獨Cd處理時（T1），NJ4和HY6兩種水稻的生長受到明顯抑制，生物量較CK分別下降36.3%和38.3%（P＜0.05）。加入Si后Cd對水稻的脅迫有所緩解，表現(xiàn)為生物量較T1處理時上升，即：T2處理時，NJ4和HY6生物量相比T1處理分別增加了9.3%和30.62%，其中HY6水稻品種達(dá)顯著差異（P＜0.05）；T3處理時 NJ4和 HY6生物量分別增加了44.9%和51.8%（P＜0.05）。實驗結(jié)果表明，單獨Cd處理時兩個水稻品種的生物量較CK顯著下降，分別加入0.5、1.8 mmol·L-1Si后，兩種水稻生物量明顯升高。

2.2 Si對Cd脅迫下兩種水稻Cd含量和轉(zhuǎn)移系數(shù)的影響

不同處理下兩種水稻Cd含量及轉(zhuǎn)移系數(shù)見表2。CK處理由于未加Cd，因此含量非常低，未檢出。由表2可知在不同處理下，NJ4和HY6都表現(xiàn)為根部Cd含量高于地上部。加Si處理（T2、T3）NJ4水稻根部Cd含量高于T1單獨Cd處理，但地上部Cd含量較T1處理下降；HY6表現(xiàn)為根部Cd含量與T1處理無顯著差異，地上部Cd含量較T1處理下降。

轉(zhuǎn)移系數(shù)常以地上與地下重金屬元素含量的比值（S/R）來表示，可以反映重金屬在體內(nèi)吸收、運輸和分配情況。表2結(jié)果表明，兩種水稻Cd的轉(zhuǎn)移系數(shù)隨Si濃度的升高較單獨Cd處理明顯下降，即T2、T3處理較T1處理Cd的轉(zhuǎn)移系數(shù)明顯下降。隨Si濃度的升高，Si能進(jìn)一步促進(jìn)Cd在根中的積累，Cd的轉(zhuǎn)移系數(shù)下降。表明施Si可以改變Cd在水稻幼苗莖葉和根中的分配比例。Si可以抑制Cd向上運輸，從而降低了莖葉中Cd的含量，減輕了Cd對水稻地上部的毒害，進(jìn)而可能降低Cd在水稻籽粒中的積累。但不同品種水稻對Si的敏感性不同。

2.3 Si對Cd脅迫下兩種水稻根和葉中NPT含量的影響

表3結(jié)果表明，兩種水稻不同Si、Cd處理下的根中NPT含量均高于地上部。T1處理，NJ4及HY6品種水稻根部及地上部NPT含量較CK均顯著增加。

NJ4品種水稻T2較T1處理根中NPT含量無顯著差異，T3較T1處理顯著升高。T1較T2、T3處理地上部NPT含量無顯著差異。HY6品種水稻根NPT含量較T1處理升高，地上部NPT含量較T1處理下降。實驗結(jié)果表明，同樣Cd脅迫下，NJ4根中的NPT含量高于HY6，能夠結(jié)合更多Cd離子，減少向地上部的運輸。NJ4品種水稻細(xì)胞內(nèi)更多的NPT用于各種解毒過程，NJ4水稻對Cd脅迫的解毒能力更強(qiáng)。添加Si使NJ4根中NPT含量增加，但地上部NPT含量差異不明顯，HY6根中NPT含量增加，地上部NPT含量下降。

表3 兩品種水稻根和地上部NPT的含量（μmol·g-1）Table3 The content NPT in root and overground of two rice varieties（μmol·g-1）

表4 水稻根系中各亞細(xì)胞組分中Cd的含量及分配比例Table4 Subcellular content and distribution of Cd in rice roots

2.4 Si對Cd脅迫下兩種水稻體內(nèi)Cd的亞細(xì)胞分布

外源添加Si對兩種水稻根亞細(xì)胞組分中Cd含量的影響如表4所示。結(jié)果表明，不同處理條件下Cd在水稻根部亞細(xì)胞水平上分布規(guī)律一致，Cd在細(xì)胞可溶物質(zhì)中含量高于細(xì)胞壁，細(xì)胞器上含量最少。T3處理時，細(xì)胞壁、細(xì)胞可溶物質(zhì)及細(xì)胞器中Cd較T1明顯降低。T3較T1處理兩品種水稻根部亞細(xì)胞各組分中細(xì)胞壁中Cd的分配比例明顯升高，細(xì)胞器中Cd的比例明顯降低。NJ4品種水稻細(xì)胞器中Cd含量高于HY6品種。

不同Si濃度對兩種水稻地上部（莖葉）亞細(xì)胞組分中Cd含量的影響如表5所示。結(jié)果表明，不同處理條件下Cd在水稻莖葉亞細(xì)胞水平上分布規(guī)律一致，Cd主要積累在細(xì)胞壁上，其次積累在細(xì)胞可溶物質(zhì)中，而細(xì)胞器上含量最少。外源Si的添加會改變兩品種水稻亞細(xì)胞中Cd的分配比例，T3處理NJ4品種水稻根中細(xì)胞壁Cd的比例增加，細(xì)胞器中Cd的分配比例下降；HY6品種水稻添加Si后根中細(xì)胞壁Cd的分配比例沒有變化，但細(xì)胞器中Cd的分配比例明顯下降。NJ4品種水稻地上部細(xì)胞壁Cd的分配比例變化不明顯，T3處理細(xì)胞器中Cd的分配比例增加；HY6品種水稻T3處理時地上部細(xì)胞壁Cd的分配比例增加，細(xì)胞器中鎘的分配比例變化不明顯。

3 討論

Si是水稻的必需營養(yǎng)元素，研究表明Si可以有效緩解重金屬脅迫[4]。對Si減輕水稻Cd毒害的研究表明，Si減輕Cd的毒害效應(yīng)主要表現(xiàn)在植物生長、光合作用、元素平衡以及其他一些生化指標(biāo)。Si可以減輕Cd毒害引起的元素不平衡。提供Si 48 h后光合作用正常，同時顯著增強(qiáng)抗壞血酸谷胱甘肽系統(tǒng)，有效激活防御功能。轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步分析表明，Cd脅迫下水稻根中與Cd脅迫相關(guān)的植物螯合肽合成酶基因，轉(zhuǎn)錄因子AP2/Erf020、Hsf31和NAC6表達(dá)明顯增強(qiáng)，但供給Si后這些基因表達(dá)明顯下調(diào)[16]。本試驗結(jié)果表明，在單獨的Cd脅迫下水稻的生長受到抑制，生物量降低。施加Si后兩品種水稻生物量較單獨Cd處理明顯增加，有效緩解了Cd的毒害作用；地上部的Cd含量小于根部的Cd含量；兩個品種轉(zhuǎn)移系數(shù)不同，NJ4小于HY6。研究表明，Si結(jié)合蛋白通過誘導(dǎo)Si在水稻根的內(nèi)皮層及纖維層細(xì)胞附近沉積，進(jìn)而影響Cd的運輸，抑制Cd向地上部轉(zhuǎn)運[5]。

NPT在植物的重金屬解毒方面發(fā)揮重要作用，它由含有巰基的物質(zhì)組成，巰基具有結(jié)合Cd離子、減少細(xì)胞內(nèi)自由態(tài)Cd的能力，從而達(dá)到減輕毒害的目的[11]。已有研究表明，Cd脅迫能促進(jìn)植物體內(nèi)NPT的合成，根部NPT增加尤為顯著，根部NPT與Cd結(jié)合并鈍化在液泡內(nèi)，從而限制了Cd的移動性，降低了Cd向地上部的轉(zhuǎn)運[17]。

本實驗結(jié)果表明，在50 μmol·L-1Cd濃度脅迫下，NJ4品種水稻根中NPT含量都顯著高于HY6，NJ4增強(qiáng)了根部對Cd的滯留能力，減少Cd從根部向地上部的轉(zhuǎn)移。同樣50 μmol·L-1Cd濃度脅迫下，加入1.8 mmol·L-1Si后，兩品種水稻根及葉片NPT含量較對照明顯增加。研究表明，Mn脅迫下，施Si后水稻敏感品種根系的NPT含量沒有顯著變化，而耐性品種ZLY的NPT含量顯著升高。高M(jìn)n脅迫下，敏感品種葉片的NPT含量顯著降低，而耐性品種卻略有增加。施Si處理無論是在正常Mn濃度還是高M(jìn)n濃度下都增加了兩個品種葉片的NPT活性[18]。Si對Cd脅迫下水稻體內(nèi)NPT含量的變化與Si對Mn脅迫下水稻體內(nèi)NPT含量的變化一致，Cd和Mn都是重金屬，Si緩解水稻Cd、Mn重金屬毒害的機(jī)制可能是相似的。

本試驗結(jié)果表明，兩品種水稻根部Cd主要積累在細(xì)胞可溶物質(zhì)上，其次是細(xì)胞壁中，細(xì)胞器上含量最少（表4）。地上部Cd主要積累在細(xì)胞壁上，其次是細(xì)胞可溶物質(zhì)中，細(xì)胞器上含量最少（表5）。該分布趨勢與以往報道[7]一致。水稻根細(xì)胞將Cd積累在細(xì)胞可溶物質(zhì)中，而不是積累在進(jìn)行生物代謝活動的細(xì)胞器上，是水稻應(yīng)對Cd毒性的一種方式；同時水稻地上部細(xì)胞可以將Cd吸附于細(xì)胞壁上，使其被阻擋在細(xì)胞質(zhì)之外，這是水稻對Cd耐性的一種體現(xiàn)[19]。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在小麥根部的亞細(xì)胞水平上，Cd更傾向于與細(xì)胞可溶物質(zhì)組分中的熱穩(wěn)固蛋白（HSP）結(jié)合，因此能降低Cd的移動性，減小Cd對細(xì)胞的危害。外源Si的加入會降低植株各部分Cd含量，減少Cd的毒害。Se對水稻Cd毒性的影響及其機(jī)制的研究結(jié)果表明，Cd、Se復(fù)合處理會導(dǎo)致水稻地下部非蛋白巰基含量增加，同時改變Cd在地下部的亞細(xì)胞分布，使細(xì)胞壁組分的Cd含量上升，細(xì)胞可溶物質(zhì)組分和細(xì)胞器組分的Cd含量下降，從而減少Cd向莖葉的轉(zhuǎn)運，降低地上部的膜脂過氧化程度[21]。Se是對植物有益的元素，Si是水稻必需營養(yǎng)元素，Se對Cd緩解機(jī)制是否與Si相似有待進(jìn)一步研究。

表5 水稻地上部中不同亞細(xì)胞組分中Cd的含量及分配比例Table5 Subcellular content and distribution of Cd in rice stems

4 結(jié)論

（1）兩種籽粒Cd含量不同的水稻品種（寧粳4號和徽兩優(yōu)6號）受到Cd脅迫時生物量都明顯下降，加入外源Si后同樣Cd脅迫條件下兩種水稻生物量較對照無明顯差異；外源Si加入能降低水稻根向地上部對Cd的轉(zhuǎn)運。

（2）外源Si可以提高水稻根細(xì)胞NPT含量，促進(jìn)Cd與NPT的絡(luò)合。

（3）外源Si加入可以降低細(xì)胞壁、細(xì)胞可溶物質(zhì)及細(xì)胞器中Cd含量。相同處理間兩品種無顯著差異。

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