鎖陽(yáng)通過(guò)抑制炎癥因子的表達(dá)對(duì)抗CCL4導(dǎo)致的小鼠肝纖維化*

黃小梅，郭莉娜，李 燦，李榮華，李卉園，孔德華，胡康安， 林友勝，鄧峰美△，王航宇，劉漪淪

1.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都 610500)； 2.新疆石河子大學(xué) 藥學(xué)院(石河子 832000)；3.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(成都 610500)

慢性肝臟疾病、肝細(xì)胞損傷和炎癥等刺激造成肝星狀細(xì)胞(HSC)激活，活化的HSC轉(zhuǎn)化成為肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，過(guò)度的ECM累積形成肝纖維化[1]。肝纖維化未得到及時(shí)適宜的治療，可發(fā)展為肝硬化或肝癌。有文獻(xiàn)[2]報(bào)道，肝纖維化的發(fā)生具有可逆性，在恰當(dāng)時(shí)間給予治療，可以緩解甚至是逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

目前，對(duì)肝纖維化的治療中，中藥抗肝纖維化逐步進(jìn)入人們視野。很多中藥開(kāi)始運(yùn)用于治療慢性肝臟疾病[3-4]。但是中藥對(duì)肝纖維化的治療中沒(méi)有系統(tǒng)研究，缺乏臨床驗(yàn)證，因此，中藥的開(kāi)發(fā)和利用有利于為肝纖維化的治療提供新藥物。

鎖陽(yáng)作為一種重要的中藥材，對(duì)潤(rùn)腸通便、補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血有功效，并在防癌、抗癌、抗疲勞以及抗炎、抗氧化、抗衰老、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、增強(qiáng)免疫功能也具有重要醫(yī)療價(jià)值[5]。在肝纖維化形成過(guò)程中，活化的HSC轉(zhuǎn)化成為肌成纖維細(xì)胞，從而產(chǎn)生ECM是肝纖維化形成的主要機(jī)制[6]; 而肝纖維化形成過(guò)程中各種炎癥因子的表達(dá)，如TGF-β1、TNF-α、IL-1等[7-8],進(jìn)一步促進(jìn)ECM的產(chǎn)生，從而加重肝纖維化。前期課題組在大鼠實(shí)驗(yàn)[9]中發(fā)現(xiàn)，鎖陽(yáng)具有抗肝纖維化的作用，推測(cè)鎖陽(yáng)是否通過(guò)其抗炎作用減弱肝纖維化的形成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 購(gòu)買(mǎi)6周齡、雄性、SPF級(jí)別、18～22 g的C57BL/6J小鼠50只，購(gòu)自成都達(dá)碩公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(川)2013-024。飼養(yǎng)溫度為20 ℃左右，相對(duì)濕度為35%～40%，飼養(yǎng)的飼料為常規(guī)飼料，自由飲水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 藥物由新疆石河子大學(xué)藥學(xué)院王航宇教授提供。秋水仙堿(購(gòu)自云南玉藥生物制藥有限公司)；CCl4(購(gòu)自成都科龍化工試劑廠(chǎng))；ALT、AST、TGF-β1 、TNF-α、IL-1試劑盒 (購(gòu)自南京建成試劑公司)等。

1.1.3 儀器 組織包埋機(jī)(EG1150H)購(gòu)自L(fǎng)EICA；組織切片機(jī)(RM2016)購(gòu)自L(fǎng)EICA；生物顯微鏡(CX21FS1C) 購(gòu)自?shī)W林巴斯工業(yè)有限公司；Roche Modular D2400 生化分析儀購(gòu)自瑞士 Roche 公司等。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物的分組、造模、給藥 將50只6周齡的小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，即正常組、CCL4模型組、秋水仙堿組(實(shí)驗(yàn)劑量為0.1 mg/kg)和鎖陽(yáng)低、高劑量組(實(shí)驗(yàn)劑量為2.77 mg/kg、27.7 mg/kg)；從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1周，正常組給予橄欖油灌胃，按4 μL/g劑量腹腔注射，2次/周；其余4個(gè)組，給予橄欖油和CCL4按1∶3比例，4 mL/kg劑量腹腔注射，2次/周，直到第4周，復(fù)制肝纖維化模型；同時(shí)，從第5周開(kāi)始，秋水仙堿組、鎖陽(yáng)低劑量和鎖陽(yáng)高劑量組分別給予相應(yīng)的藥，1次/d，灌胃，持續(xù)至第6周。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定 用試劑盒檢測(cè)血清中ALT、AST的活性，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中TGF-β1、TNF-α、IL-1的含量。

1.2.3 組織病理學(xué)檢測(cè) 取肝臟組織進(jìn)行福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，進(jìn)行Masson染色，觀(guān)察肝臟纖維的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肝臟指數(shù)的比較

為觀(guān)察鎖陽(yáng)對(duì)小鼠體質(zhì)量和肝臟質(zhì)量的影響，本實(shí)驗(yàn)采用肝臟指數(shù)(肝臟體質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量)進(jìn)行比較，肝臟受到損傷越重肝臟指數(shù)越高。相比正常組小鼠肝臟指數(shù)，模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。秋水仙堿和鎖陽(yáng)低、高劑量組小鼠的肝臟指數(shù)相比模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。

圖1 各組肝臟指數(shù)注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

2.2 肝功能檢測(cè)

與正常組比較，模型組小鼠的AST、ALT明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，秋水仙堿和鎖陽(yáng)高劑量組的AST、ALT均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；鎖陽(yáng)低劑量組的AST、ALT均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但其降低的效果沒(méi)有鎖陽(yáng)高劑量組明顯(表1)。

2.3 肝臟血清中炎癥因子TGF-β1、TNF-α、IL-1檢測(cè)

模型組小鼠的TGF-β1、TNF-α、IL-1的濃度比正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，秋水仙堿和鎖陽(yáng)低、高劑量組的TGF-β1、TNF-α、IL-1均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

表1 各組ALT、AST比較

注：與正常組比較，*P<0.05、**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05、##P<0.01

圖2 肝臟血清中炎癥因子的檢測(cè)

注：A：各組TGF-β1檢測(cè)結(jié)果;B：各組TNF-α的檢測(cè)結(jié)果;C：各組IL-1的檢測(cè)結(jié)果；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.4 肝臟組織病理學(xué)的變化

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究鎖陽(yáng)對(duì)肝臟組織病理學(xué)變化的影響。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)Masson染色進(jìn)行觀(guān)察，相比正常組，模型組的小鼠肝臟組織中有明匯管區(qū)纖維組織增生，纖維化明顯;而給藥的3個(gè)組中，小鼠肝臟組織有不同程度的好轉(zhuǎn)；鎖陽(yáng)高劑量組與秋水仙堿組部分組織纖維化減輕；其中，鎖陽(yáng)低劑量組與鎖陽(yáng)高劑量組相比，組織情況略差。通過(guò)肝臟組織的病理學(xué)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，鎖陽(yáng)可減弱CCL4誘導(dǎo)的肝臟組織病理學(xué)惡化(圖3)。

圖3 肝臟組織病理學(xué)的變化(×100)注：A：正常組；B：模型組；C：秋水仙堿組；D：鎖陽(yáng)低劑量組；E：鎖陽(yáng)高劑量組

2.5 Image J分析肝纖維化的面積

通過(guò)Image J軟件處理，統(tǒng)計(jì)纖維化的面積，從而進(jìn)一步觀(guān)察鎖陽(yáng)抗纖維化的效果。模型組小鼠肝纖維化面積比正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組小鼠比較，秋水仙堿組和鎖陽(yáng)低、高組的肝纖維化面積明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖4)。

圖4 各組小鼠肝纖維化面積注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

3 討論

在慢性肝臟損傷和肝纖維化的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[10]中，最經(jīng)典的模型制造是用CCL4誘導(dǎo)肝纖維化，因此，本實(shí)驗(yàn)中采用CCL4誘導(dǎo)造成肝臟的損傷。在CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化造模成功后，采用不同濃度的鎖陽(yáng)作用于小鼠治療肝纖維化，主要是按前期大鼠用藥的劑量，根據(jù)大小鼠體表面積的比對(duì)來(lái)用藥[9]，將其分為鎖陽(yáng)低劑量組(2.77 mg/kg)和鎖陽(yáng)高劑量組(27.7 mg/kg)。本研究中發(fā)現(xiàn)，用藥小鼠的精神狀態(tài)、活躍程度都有所改善。模型組小鼠ALT、AST值比正常組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；秋水仙堿組和鎖陽(yáng)低、高劑量組的ALT、AST的值比模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。通過(guò)Masson染色可以看到鎖陽(yáng)可以減弱纖維的增生和膠原的產(chǎn)生。且秋水仙堿和鎖陽(yáng)高劑量組相比模型組，其纖維化減少的更明顯。這些說(shuō)明鎖陽(yáng)具有抗肝纖維化作用，且對(duì)鎖陽(yáng)低劑量和高劑量組之間進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)鎖陽(yáng)高劑量組的抗肝纖維化的作用改善更明顯，這說(shuō)明鎖陽(yáng)在抗肝纖維化的治療中，可能具有劑量依賴(lài)性。

炎癥與肝纖維化的形成密切相關(guān)[7]。TGF-β1作為經(jīng)典的炎癥因子，在纖維化形成中占有重要作用，它可以促進(jìn)HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞，產(chǎn)生大量的ECM[11]。TGF-β1一方面可以通過(guò)促進(jìn)下游的SMAD3過(guò)度激活，從而促進(jìn)HSC的活化[12]；另一方面，TGF-β1還可以過(guò)度激活NOX4，從而激活HSC[13],進(jìn)一步加重肝纖維化的形成。炎癥反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生TNF-α、IL-1,促進(jìn)了HSC的激活，從而形成肝纖維化[14]；同時(shí)，活化的HSC自身又可以產(chǎn)生這些因子，從而加重炎癥反應(yīng)[15]。實(shí)驗(yàn)中，相比正常組，模型組的TGF-β1、TNF-α、IL-1升高，而用鎖陽(yáng)治療后，TGF-β1、TNF-α、IL-1降低，對(duì)應(yīng)的小鼠肝纖維化的面積也減少；這說(shuō)明鎖陽(yáng)通過(guò)抑制TGF-β1、TNF-α、IL-1的表達(dá)而減弱了肝纖維化的形成，但其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

鎖陽(yáng)為中藥化合物，主要由有機(jī)酸、三萜、多糖、甾族化合物和類(lèi)黃酮組成[16]，其成分比較復(fù)雜，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出具有保肝的作用[17]，但是具體是鎖陽(yáng)中哪種成分起到主要作用，還有待進(jìn)一步研究。本課題組通過(guò)活性追蹤發(fā)現(xiàn)，鎖陽(yáng)中一種活性最強(qiáng)的新化合物-Songarin A，它具有籠狀碳苷結(jié)構(gòu)，對(duì)下一步深層次研究鎖陽(yáng)對(duì)肝纖維化的作用提供線(xiàn)索。

綜上所述，鎖陽(yáng)對(duì)CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中具有保護(hù)肝臟作用，它能夠降低肝臟中炎癥因子TGF-β1、TNF-α、IL-1的表達(dá)，避免了肝臟受到炎癥因子的刺激，從而減輕了肝纖維化，起到了保護(hù)肝臟的效果。但是其主要發(fā)揮作用的成分以及其抗肝纖維化的具體機(jī)制目前還有待進(jìn)一步研究。

[1]Zoubek M E, Trautwein C, Strnad P. Reversal of liver fibrosis: From fiction to reality[J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2017, 31(2): 129-141.

[2]Lee Y A, Wallace M C, Friedman S L. Pathobiology of liver fibrosis: a translational success story[J]. Gut, 2015, 64(5): 830-841.

[3]劉峰林, 黃焰. 肝病二號(hào)合劑對(duì)肝纖維化大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC)凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)醫(yī)藥指南, 2013, 11(1): 400-401.

[4]董妙先, 鄒宇, 劉玉章, 等. 大黃素對(duì)肝纖維化大鼠肝臟組織Sm ad3表達(dá)的影響[J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2013, 28(2): 529-531.

[5]趙亞峰, 李新領(lǐng). 鎖陽(yáng)的研究現(xiàn)狀及前景[J]. 食品安全導(dǎo)刊, 2014(17): 64-66.

[6]Wallace M C, Friedman S L, Mann D A. Emerging and disease-specific mechanisms of hepatic stellate cell activation[J]. Semin Liver Dis, 2015, 35(2): 107-118.

[7]Koyama Y, Brenner D A. Liver inflammation and fibrosis[J]. J Clin Invest, 2017, 127(1): 55-64.

[8]Jaeschke H. Inflammation in response to hepatocellular apoptosis[J]. Hepatology, 2002, 35(4): 964-966.

[9]李榮華, 林友勝, 王航宇, 等. 鎖陽(yáng)對(duì)大鼠肝纖維化干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2016, 11(3): 286-291.

[10] Jiang Y, Liu J, Waalkes M,etal. Changes in the gene expression associated with carbon tetrachloride-induced liver fibrosis persist after cessation of dosing in mice[J]. Toxicol Sci, 2004, 79(2): 404-410.

[11] Friedman S L. Mechanisms of Hepatic Fibrogenesis[J]. Gastroenterology, 2008, 134(6): 1655-1669.

[12] Uemura M, Swenson E S, Ga a M D,etal. Smad2 and Smad3 play different roles in rat hepatic stellate cell function and alpha-smooth muscle actin organization[J]. Mol Biol Cell, 2005, 16(9): 4214-4224.

[13] Sancho P, Mainez J, Crosas-Molist E,etal. NADPH oxidase NOX4 mediates stellate cell activation and hepatocyte cell death during liver fibrosis development[J]. PLoS ONE, 2012, 7(9): e45285.

[14] Pradere J P, Kluwe J, De Minicis S,etal. Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice[J]. Hepatology, 2013, 58(4): 1461-1473.

[15] Robert S, Gicquel T, Bodin A,etal. Characterization of the MMP/TIMP Imbalance and Collagen Production Induced by IL-1β or TNF-α Release from Human Hepatic Stellate Cells[J]. PLoS One, 2016, 11(4): e0153118.

[16] 李振華, 郭靜霞, 崔占虎, 等. 鎖陽(yáng)的研究進(jìn)展與資源保護(hù)[J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2014, 16(10): 861-869.

[17] Xie S A, Li G Y, Huang J,etal. A new flavanol from Cynomorium songaricum[J]. J Asian Nat Prod Res, 2013, 15(4): 413-416.