抗、感綠豆象綠豆種子差異蛋白的分離與鑒定

成小芳，王宏民，張耀文，張仙紅

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801

2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院，山西 太谷 030801

3 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，山西 太谷 030801

4 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所，山西 太原 030000

綠豆象Callosobruchus chinensisL.，屬鞘翅目 (Bruchidae) 豆象科(Coleoptera)。主要危害綠豆Vigna radiata、豌豆Pisum sativum、豇豆Vigna unguiculata、紅小豆Vigna angularis等食用豆類，尤對(duì)綠豆危害最為嚴(yán)重[1]。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了一定的抗蟲(chóng)機(jī)制，目前已知參與抗蟲(chóng)防御體系的物質(zhì)主要有氰化物、生物堿、萜烯和蛋白質(zhì)[2-3]。Sugawara等曾從完全抗豆象的綠豆野生種TC1966中分離出2種環(huán)肽生物堿，認(rèn)為它們與抗豆象有關(guān)[4]，但后來(lái)Kaga等否認(rèn)了環(huán)肽生物堿抗豆象的觀點(diǎn)[5]；Kaga 等從TC1966中分離出一種對(duì)豆象有毒性的肽化合物“GIF-5”；Lin等發(fā)現(xiàn)一種富含半胱氨酸的 VRCRP (Vigna radiata cysteine rich protein) 蛋白，該蛋白對(duì)綠豆象幼蟲(chóng)有致死作用[6]。

蛋白質(zhì)組學(xué)及其技術(shù)已成為蛋白質(zhì)組功能和應(yīng)用研究的基本手段。其中，聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳 (Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2-DE) 以其在同一塊膠上可同時(shí)分離數(shù)千甚至上萬(wàn)種蛋白的優(yōu)勢(shì)，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中一直處于核心地位[7]；肽質(zhì)量指紋圖譜是近年來(lái)采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)量法 (Matrix-assistedlaser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)發(fā)展起來(lái)的新型技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、與很多蛋白分離方法相匹配，運(yùn)用這兩大技術(shù)可研究不同時(shí)空領(lǐng)域發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)組。因此，這些蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已成為對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行比較和鑒定的主要方法。

前期研究表明，綠豆晉綠7號(hào)和B20對(duì)綠豆象具有高抗性[8]，這些抗蟲(chóng)綠豆是否是由于某些特殊蛋白而對(duì)綠豆象具有抗性作用目前還未見(jiàn)報(bào)道。為初步了解抗蟲(chóng)綠豆抗綠豆象的生理生化機(jī)制，選取對(duì)綠豆象抗性有顯著差異的3個(gè)綠豆品種作為研究對(duì)象，采用 2-DE比較分析抗、感綠豆象綠豆種子中的差異蛋白，并結(jié)合MALDI-TOF MS技術(shù)和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，進(jìn)行抗、感綠豆象綠豆種子中差異蛋白的研究，以期為明確抗蟲(chóng)綠豆的抗蟲(chóng)成分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試綠豆

綠豆品種晉綠7號(hào) (92%抗蟲(chóng))、B20(100%抗蟲(chóng))、濰綠2117 (100%感蟲(chóng)) 由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。

1.1.2 主要試劑及儀器

蛋白酶抑制劑PMSF為Amresco公司產(chǎn)品；十二烷基磺酸鈉、三氟乙酸、胰酶為Promega公司產(chǎn)品；低熔點(diǎn)瓊脂糖、膠條覆蓋油為Usb產(chǎn)品。真空干燥機(jī) (上海一恒科學(xué)儀器有限公司DZF-6020)、掃描儀 (MICROTEK ScanMaker i800)、電泳槽 (GE ETTAN DALTsix)、分光光度計(jì) (上海沛歐 318C+)、冷凍離心機(jī) (湘儀H5050R)、超聲儀 (寧波新芝生物科技股份有限公司 Ningbo Scientz Biotechnology Co., LTD JY96-Ⅱn)、 等 電 聚 焦 儀 (GE ETTAN IPGPHOR3)、Autoflex speed? MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀 (德國(guó)布魯克Bruker Dalton)。

1.2 方法

1.2.1 綠豆蛋白樣品制備

將綠豆研成粉末后，加入含等體積Tris飽和酚蛋白的提取液，振蕩離心后，取上清，再加醋酸銨甲醇溶液振蕩，取沉淀–20 ℃過(guò)夜，次日離心并棄上清，用甲醇和丙酮分別洗滌沉淀，將沉淀室溫干燥即得蛋白質(zhì)團(tuán)塊，–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 一向等點(diǎn)聚焦

蛋白溶解后，Bradford法定量測(cè)定蛋白[9]，依定量所得數(shù)據(jù)取相應(yīng)量的蛋白質(zhì)，分析膠 (銀染) 和質(zhì)譜膠 (考染) 的上樣量分別為120 μg和1 200 μg。干膠條室溫20 ℃泡脹12 h后記錄膠條號(hào)碼。一向等電聚焦，程序?yàn)椋篠1 stp 500 V 1 h，S2 grd 1 000 V 1 h，S3 grd 8 000 V 3 h，S4 stp 8 000 V 5.36 h，整個(gè)聚焦過(guò)程中所用總電壓約為60 kVh。等電聚焦完成后，置于平衡管，于–70 ℃保存膠條。

1.2.3 二向SDS-PAGE

灌膠器裝好并調(diào)節(jié)水平后，加入 12.5%SDS-PAGE凝膠液，用飽和正丁醇?jí)浩揭好?，凝固過(guò)夜。各平衡管加平衡液平衡2次后，進(jìn)行二向電泳，程序?yàn)椋篠1 2 W/gel 60 min，S2 17 W/gel直到溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部。每個(gè)樣品重復(fù)3次，凝膠采用銀染和考染法染色。

1.2.4 圖像采集與分析

凝膠采用256灰階透視掃描模式，于分辨率為200 dpi的掃描儀上掃描后，使用ImageMaster 2D platinum 5.0 (GE) 軟件對(duì)凝膠進(jìn)行分析。

1.2.5 質(zhì)譜鑒定

將差異蛋白點(diǎn)挖出，置于離心管進(jìn)行膠內(nèi)酶切、肽段抽提、點(diǎn)靶后利用 Autoflex speed?MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，flexAnalysis軟件 (Bruker Dalton) 過(guò)濾基線峰、識(shí)別信號(hào)峰，并采用BioTools (Bruker Dalton) 軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得蛋白質(zhì)相關(guān)信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗、感綠豆種子總蛋白的雙向電泳分離圖譜

預(yù)實(shí)驗(yàn)中，采用pH 3–10的IPG膠條對(duì)感蟲(chóng)綠豆濰綠2117進(jìn)行雙向電泳 (圖1)，結(jié)果顯示，綠豆蛋白主要分布在pH 4–7范圍內(nèi)，因此，為提高雙向電泳圖譜的分辨率，選用pH 4–7的IPG膠條對(duì)抗、感綠豆進(jìn)行雙向電泳。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建了分辨率高、重復(fù)性較好的抗蟲(chóng)綠豆 (晉綠7號(hào)、B20) 和感蟲(chóng)綠豆 (濰綠 2117) 的蛋白質(zhì)二維電泳圖譜 (圖2)。由圖2可知，供試綠豆的蛋白質(zhì)在2個(gè)方向都得到較好的分離，且較低含量的蛋白也能清晰顯現(xiàn)出來(lái)。

圖1 感蟲(chóng)綠豆濰綠2117種子蛋白質(zhì)的2-DE圖譜Fig. 1 2-DE maps of seed proteins from susceptible mungbean Weilv 2117 to bruchids.

2.2 抗、感綠豆差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定與分析

對(duì)抗、感 3組綠豆的 2-DE圖譜 (圖 2) 進(jìn)行ImageMaster 2D platinum 5.0 (GE) 軟件凝膠自動(dòng)匹配和蛋白點(diǎn)差異篩選，結(jié)果顯示，2個(gè)抗蟲(chóng)綠豆品種晉綠7號(hào)和B20蛋白表達(dá)量都上調(diào)的蛋白點(diǎn)共有28個(gè)，表達(dá)量上調(diào)2.5倍以上的共15個(gè)蛋白點(diǎn)，其中，達(dá)到10 000倍的有2個(gè)，分別為B47和B49，其余各點(diǎn)僅表現(xiàn)為量的差異 (圖 3) (每個(gè)蛋白點(diǎn)的量是指構(gòu)成這個(gè)點(diǎn)的所有像素強(qiáng)度值的總和)。

圖2 抗蟲(chóng)綠豆與感蟲(chóng)綠豆種子蛋白的 2-DE圖譜 (第一向用 pH4-7的膠條等電聚焦，第二向采用 12.5%的SDS-PAGE進(jìn)行分離，A、B、C分別代表濰綠2117號(hào)、晉綠7號(hào)、B20)Fig. 2 2-DE maps of seed proteins from resistance and susceptible mungbean to bruchids. The first dimension was run using a pH gradient from 4 to 7, and the second dimension was a 12.5% SDS-PAGE. A, B and C corresponding to Weilv 2117, Jinlv No. 7, B20.

對(duì)15個(gè)差異蛋白點(diǎn)經(jīng)切膠后挖點(diǎn)、脫色、還原及進(jìn)一步的烷基化回收，并用胰蛋白酶酶解，抽提酶解肽段進(jìn)行萃取和ZipTip脫鹽處理，并利用 MALDI-TOF MS質(zhì)譜對(duì)獲得的蛋白進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定分析。通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定，抗蟲(chóng)品種蛋白表達(dá)量為感蟲(chóng)品種10 000倍的2個(gè)蛋白斑點(diǎn)中只有 B49得到成功鑒定，為 8S球蛋白；超過(guò)2.5倍被成功鑒定出共 5個(gè)蛋白點(diǎn)，分別為B13、B31、B34、B41和B56 (表1)。其中，B13、B49和B56屬同一種蛋白質(zhì)，均為8S球蛋白α亞型，B56和B49具有相同的等電點(diǎn)和分子量，而B(niǎo)13與它們只是等電點(diǎn)相同而分子量不同；B34為8S球蛋白β亞型，與前3個(gè)蛋白點(diǎn)的等電點(diǎn)和分子量均不相同；蛋白點(diǎn)B31為1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶亞基結(jié)合蛋白，作為陪伴蛋白幫助RuBis CO在體內(nèi)正確折疊組裝；B41為合成淀粉酶抑制劑和胰蛋白酶抑制劑的前體多肽鏈。還有2個(gè)分子量相同而等電點(diǎn)不同的未知蛋白 (B20、B21)，另外7個(gè)蛋白點(diǎn) (B58、B48、B47、B38、B25、B12、B39) 在 UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有得到驗(yàn)證。

圖3 抗、感綠豆種子差異蛋白點(diǎn) (箭頭所指為差異蛋白點(diǎn))Fig. 3 Principal differentiated protein spots from insect-resistant and insect-susceptible mungbean. The differentiated spots are marked by arrows.

表1 抗、感綠豆種子差異蛋白點(diǎn)的鑒定結(jié)果Table 1 Identification of differentially expressed protein spot s from insect-resistant and insect-susceptible mungbean

3 討論

目前，雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)已成為生物學(xué)領(lǐng)域?qū)?xì)胞或組織內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和鑒定的核心技術(shù)。本研究采用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)，結(jié)合UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，成功鑒定出抗、感蟲(chóng)綠豆的15個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中抗蟲(chóng)綠豆與感蟲(chóng)綠豆蛋白表達(dá)差異為10 000倍的蛋白點(diǎn)有2個(gè)，分別為α亞型8S球蛋白和未知蛋白；抗蟲(chóng)綠豆與感蟲(chóng)綠豆蛋白表達(dá)差異為23倍的蛋白點(diǎn)有1個(gè)，是核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶 (RuBis CO) 亞基結(jié)合蛋白。

據(jù)報(bào)道，8S球蛋白α亞型與大豆β伴大豆球蛋白約有61%的序列一致性，與大豆β伴大豆球蛋白 β肽鏈序列有 71.4%的一致性[10-11]。大豆抗原中的主要致敏因子β伴大豆球蛋白可導(dǎo)致飼料中的蛋白質(zhì)利用率降低，而不利于畜禽的生長(zhǎng)發(fā)育，尤其是對(duì)于低齡動(dòng)物，因其腸道發(fā)育不成熟，嚴(yán)重者會(huì)引起小腸絨毛脫落[12]。在本研究中，抗蟲(chóng)綠豆品種中4個(gè)8S球蛋白α亞型及β亞型的表達(dá)量均為感蟲(chóng)綠豆2.5倍以上，其中一個(gè)8S球蛋白α亞型蛋白點(diǎn)達(dá)10 000倍，推測(cè)抗蟲(chóng)綠豆中8S球蛋白α亞型及β亞型可能與大豆β伴大豆球蛋白有同樣的作用，影響到綠豆象對(duì)蛋白的吸收利用，尤其是在卵發(fā)育為幼蟲(chóng)初期，嚴(yán)重影響了幼蟲(chóng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)的正常吸收，從而阻礙了綠豆象的正常生長(zhǎng)發(fā)育。我們的前期實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)綠豆象取食抗蟲(chóng)綠豆后，綠豆種子內(nèi)存在大量低齡死亡幼蟲(chóng)，且成蟲(chóng)羽化率顯著下降[13]，推測(cè)可能與這些抗蟲(chóng)品種中含有較多的抗蟲(chóng)性8S球蛋白有關(guān)。

核酮糖 1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶伴侶蛋白(RuBis CO), 即分子伴侶60 (Cpn60)，也能作為細(xì)胞表面受體與各種配體和細(xì)菌作用，作為毒素發(fā)揮作用[14-17]。據(jù)報(bào)道，昆蟲(chóng)體內(nèi)的RuBis CO伴侶蛋白與細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖密切相關(guān)[18-20]。在本試實(shí)中，抗蟲(chóng)綠豆 RuBis CO伴侶蛋白表達(dá)量是感蟲(chóng)綠豆的23倍，當(dāng)綠豆象取食抗蟲(chóng)綠豆后其體內(nèi)RuBis CO伴侶蛋白增多，是促進(jìn)了綠豆象體內(nèi)細(xì)菌的繁殖，或與其他配體結(jié)合形成毒素導(dǎo)致綠豆象發(fā)育受阻甚至死亡，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證，核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶伴侶蛋白與綠豆象的互作機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

胰蛋白酶抑制劑 (Trypsin inhibitor，TI) 是一類具有抑制胰蛋白酶活性的多肽或蛋白質(zhì)，也是參與抗蟲(chóng)防御體系中最重要的蛋白質(zhì)之一[21]。據(jù)報(bào)道，豇豆籽粒內(nèi)所含的胰蛋白酶抑制劑對(duì)四紋豆象生長(zhǎng)發(fā)育有很好的阻滯作用，且對(duì)其他鱗翅目和部分鞘翅目害蟲(chóng)如玉米根甲Diabroticaundocinpunctata、棉鈴象甲Anthonomus grandis、雜擬谷盜Tribolium confusum等也有抑制作用[22]。Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑 (BBI) 可抑制甜菜夜蛾Spodoperaexigua幼蟲(chóng)腸道內(nèi)的胰蛋白酶活性，使幼蟲(chóng)體重變輕、發(fā)育歷期延長(zhǎng)[23]。BBI對(duì)棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigeraHubner的抗?fàn)I養(yǎng)效應(yīng)在于它激活和抑制了棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)的蛋白酶活性，導(dǎo)致其體內(nèi)蛋白酶之間的相互協(xié)調(diào)性遭到破壞，使進(jìn)入中腸的蛋白質(zhì)不能有效消化吸收，從而使昆蟲(chóng)的正常生長(zhǎng)發(fā)育受阻[24]，據(jù)報(bào)道，綠豆胰蛋白酶抑制劑Lys片段活性中心序列在體外成功地合成了對(duì)furin蛋白有強(qiáng)抑制活力的16肽[25]，表明胰蛋白酶抑制劑的前體加工酶的前體肽具有特異性抑制劑的功能。本研究中，抗蟲(chóng)綠豆合成胰蛋白酶抑制劑的前體物質(zhì)含量顯著高于感蟲(chóng)綠豆，其抗蟲(chóng)作用可能是這些前體物質(zhì)本身或其在綠豆象體內(nèi)合成蛋白酶抑制劑抑制了綠豆象體內(nèi)的蛋白酶活性，從而使綠豆象的生長(zhǎng)發(fā)育受到影響。

綜上所述，在抗、感蟲(chóng)綠豆中差異較大的蛋白點(diǎn)8S球蛋白α和β亞型、RuBis CO伴侶蛋白及胰蛋白酶抑制劑的前體，在抗蟲(chóng)綠豆中存在的作用可能是作為抗蟲(chóng)物質(zhì)中一種單獨(dú)作用或幾種物質(zhì)聯(lián)合作用，影響了綠豆象的生長(zhǎng)發(fā)育甚至導(dǎo)致死亡，這些差異蛋白與抗蟲(chóng)性的量效關(guān)系及聯(lián)合效應(yīng)還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

REFERENCES

[1]Wang Y, Talekar NS, Chen B, et al. Study on the influence of legume varieties on the growth and oviposition preference ofCallosobruchus chinensis(L.). J Yunnan Agric Univ, 2010, 25(1): 34–39 (in Chinese).王燕, Talekar NS, 陳斌, 等. 綠豆象在不同豆類上的生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)卵選擇性研究. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 25(1): 34–39.

[2]Wang XF, Gao WQ, Liu JF, et al. Plant defensive strategies and environment-driven mechanisms.Chin J Ecol, 2015, 34(12): 3542–3552 (in Chinese).王小菲, 高文強(qiáng), 劉建鋒, 等. 植物防御策略及其環(huán)境驅(qū)動(dòng)機(jī)制. 生態(tài)學(xué)雜志, 2015, 34(12):3542–3552.

[3]Zhang B, Liu Y, Zhang YH, et al. Research progress in regulatory mechanism and proteomics of plant induced insect resistance. Hebei J For Orch Res,2016, 31(3): 239–244 (in Chinese).張斌, 劉洋, 張玉賀, 等. 植物誘導(dǎo)抗蟲(chóng)性的調(diào)控機(jī)制及蛋白組學(xué)研究進(jìn)展. 河北林果研究, 2016,31(3): 239–244.

[4]Sugawara F, Ishimoto M, Le-Van N, et al.Insecticidal peptide from mungbean: a resistant factor against infestation with azuki bean weevil. J Agric Food Chem, 1996, 44(10): 3360–3364.

[5]Kaga A, Ishimoto M. Genetic localization of a bruchid resistance gene and its relationship to insecticidal cyclopeptide alkaloids, the vignatic acids,in mungbean (Vigna radiataL. Wilczek). Mol Gen Genet, 1998, 258(4): 378–384.

[6]Lin C, Chen CS, Horng SB. Characterization of resistance toCallosobruchus maculatus(Coleoptera:Bruchidae) in mungbean variety VC6089A and its resistance-associated protein VrD1. J Econ Entomol,2005, 98(4): 1369–1373.

[7]Abbott A. A post-genomic challenge: learning to read patterns of protein synthesis. Nature, 1999,402(6763): 715–720.

[8]Zhu HJ, Zhao XY, Yan HB, et al. Breeding of bruchid resistant mung bean variety Jinlyudou 7. J Shanxi Agric Sci, 2012, 40(6): 606–607, 612 (in Chinese).朱慧珺, 趙雪英, 閻虎斌, 等. 抗豆象綠豆新品種晉綠豆 7號(hào)的選育. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(6):606–607, 612.

[9]Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976, 72(1/2): 248–254.

[10]Bernardo AEN, Garcia RN, Adachi M, et al. 8S globulin of mung bean [Vigna radiate(L.) Wilczek]:cloning and characterization of its cDNA isoforms,expression inEscherichia coli, purification, and crystallization of the major recombinant 8S isoform. J Agric Food Chem, 2004, 52(9): 2552–2560.

[11]Liu H, Kang YF. Research progress on globulins of edible legumes. Cer Oil, 2013, 26(5): 5–8 (in Chinese).劉紅, 康玉凡. 食用豆類球蛋白研究進(jìn)展. 糧食與油脂, 2013, 26(5): 5–8.

[12]Wang JX, Qin GX, Long GH, et al. Stability and immunoreactivity of β-conglycinin to hydrolysisin vitro. Chin J Anim Sci, 2014, 50(9): 45–49 (in Chinese).王錦欣, 秦貴信, 龍國(guó)徽, 等. Β-伴大豆球蛋白酶解物的抗消化性及免疫活性變化的研究. 中國(guó)畜牧雜志, 2014, 50(9): 45–49.

[13]Cheng XF, Zhang YW, Zhang XH. Effects of insect-resistant mung bean on development and activities of several enzymes of Chinese bean weevilCallosobruchus chinensisL. (Coleoptera: Bruchidae).J Plant Protect, 2017, 44(3): 420–426 (in Chinese).成小芳, 張耀文, 張仙紅. 抗蟲(chóng)綠豆對(duì)綠豆象生長(zhǎng)發(fā)育及體內(nèi)幾種酶活性的影響. 植物保護(hù)學(xué)報(bào),2017, 44(3): 420–426.

[14]Yong ZH.In vitorreassembly of ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase and the function of chaperone[D]. Beijing: Chinese Academy of Sciences, 2007 (in Chinese).勇振華. 核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的體外重組及分子陪伴蛋白的功能[D]. 北京: 中國(guó)科學(xué)院, 2007.

[15]Ashida H, Danchin A, Yokota A. Was photosynthetic RuBisCO recruited by acquisitive evolution from RuBisCO-like proteins involved in sulfur metabolism? Res Microbiol, 2005, 156(5/6):611–618.

[16]Chen HM, Chen Y, Wang D, et al. The role of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase activase in resistance of plant to abiotic stresses.Plant Physiol J, 2016, 52(11): 1637–1648 (in Chinese).陳候鳴, 陳躍, 王盾, 等. 核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶在植物抗逆性中的作用. 植物生理學(xué), 2016, 52(11): 1637–1648.

[17]Zhou L. Study on agronomic traits and resistance to salt of rice lines over-expressed chloroplast Chaperonin 60[D]. Hangzhou: Zhejiang University,2015 (in Chinese).周麗. 水稻葉綠體伴侶蛋白 Cpn60超表達(dá)株系農(nóng)藝性狀和抗鹽性研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2015.

[18]Henderson B, Fares MA, Lund PA. Chaperonin 60: a paradoxical, evolutionarily conserved protein family with multiple moonlighting functions. Biol Rev,2013, 88(4): 955–987.

[19]Horwich AL, Apetri AC, Fenton WA. The GroEL/GroESciscavity as a passive anti-aggregation device. FEBS Lett, 2009, 583(16): 2654–2662.

[20]Sakamoto M, Ohkuma M. Usefulness of thehsp60gene for the identification and classification of Gram-negative anaerobic rods. J Med Microbiol,2010, 59(11): 1293–1302.

[21]Ruan JJ, Yan J, Han XY, et al. Extraction of trypsin inhibitor from walnut seeds by reverse micelle and study on anti-insect. J Environ Entomol, 2016, 38(2):418–423 (in Chinese).阮景軍, 嚴(yán)俊, 韓學(xué)易, 等. 反膠束法萃取核桃胰蛋白酶抑制劑及其抗蟲(chóng)研究. 環(huán)境昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),2016, 38(2): 418–423.

[22]Xu HL, Zhai HL, Wang F, et al. Cowpea trypsin inhibitor gene (cpti) and its application in insect resistance transgenic plants. J Agric Sci Technol,2008, 10(1): 18–27 (in Chinese).徐鴻林, 翟紅利, 王鋒, 等. 豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(cpti)及其在抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2008, 10(1): 18–27.

[23]Broadway RM, Duffey SS. Plant proteinase inhibitors: mechanism of action and effect on the growth and digestive physiology of larvalHeliothis zeaandSpodoptera-exiqua. J Insect Physiol, 1986,32(10): 827–833.

[24]Wang CL, Zhang YZ, Sun ZG. Progress on the research of Bowman-Birk soybean trypsin inhibitor.Soybean Sci, 2007, 26(5): 757–761 (in Chinese).王長(zhǎng)良, 張永忠, 孫志剛. Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制劑研究進(jìn)展. 大豆科學(xué), 2007, 26(5):757–761.

[25]Qi RF. The gene cloning and expression of mung bean trypsin inhibitor[D]. Lanzhou: Northwest Normal University, 2005 (in Chinese).祁瑞峰. 綠豆胰蛋白酶抑制劑的基因克隆及其表達(dá)[D]. 蘭州: 西北師范大學(xué), 2005.