地衣芽胞桿菌DW2中敲除氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因yhdG提高桿菌肽產(chǎn)量

李陽，吳非，蔡冬波，占楊楊，李俊輝，陳曉斌，陳慧超，陳守文，馬昕

1湖北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物資源綠色轉(zhuǎn)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 湖北省環(huán)境微生物工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢430062

2 綠康生化股份有限公司，福建 浦城 353400

桿菌肽是一種主要由枯草芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌產(chǎn)生的廣譜性抗生素，由11種氨基酸殘基組成，包括 Orn、D-Phe、His、D-Asp、Asn、Lys、D-Glu、Cys、Leu、Ile和 Val[1-4]。作為一種廣譜性抗生素，桿菌肽能通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成從而抑制革蘭氏陽性細(xì)菌和部分革蘭氏陰性菌[2,5]，另外桿菌肽幾乎不會在動(dòng)物的腸道內(nèi)被吸收，因此被廣泛應(yīng)用于飼料添加[6-7]。

桿菌肽在動(dòng)物飼料添加方面具有巨大的市場前景，但是其合成效率低，嚴(yán)重影響了桿菌肽的產(chǎn)量和市場開發(fā)。目前，桿菌肽的高產(chǎn)主要是通過高產(chǎn)菌株的選育和發(fā)酵條件的優(yōu)化來實(shí)現(xiàn)的[8-9]，而高產(chǎn)菌株的選育主要是通過傳統(tǒng)的誘變方法，如紫外誘變、化學(xué)誘變等，但這些手段提高桿菌肽的產(chǎn)量有限，并且高產(chǎn)性狀極不穩(wěn)定，容易發(fā)生回復(fù)突變[10]。因此，通過代謝工程手段選育桿菌肽高產(chǎn)菌株具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值[11]。之前的研究表明，提高前體物質(zhì)的供應(yīng)可以提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，因此通過代謝工程手段提高桿菌肽的前體氨基酸的供應(yīng)，有望提高桿菌肽的產(chǎn)量[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過氨基酸添加實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加桿菌肽合成前體氨基酸Cys、Ile、Leu、Lys和Glu等均可以提高桿菌肽的產(chǎn)量，其中Ile的添加可以顯著提高桿菌肽的產(chǎn)量[6]。因此，通過代謝工程手段提高前體氨基酸的供給水平可能是提高桿菌肽生產(chǎn)水平的有效策略[13-15]。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是影響細(xì)胞內(nèi)氨基酸供應(yīng)的重要因素，其可以通過影響前體氨基酸胞內(nèi)胞外的分布從而影響目標(biāo)產(chǎn)物的高產(chǎn)[16-18]?？莶菅堪麠U菌中，BcaP (YhdG)負(fù)責(zé)包括支鏈氨基酸在內(nèi)的多種氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，并且是Ile最有效的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)Ile的攝入[19-21]。桿菌肽發(fā)酵原料主要為豆粕等蛋白質(zhì)資源，菌體如何高效利用胞外氨基酸是提高菌體高效合成桿菌肽的關(guān)鍵因素之一。本研究重點(diǎn)圍繞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 YhdG開展研究，通過研究不同表達(dá)水平的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG對桿菌肽發(fā)酵效價(jià)的影響，從而構(gòu)建桿菌肽高產(chǎn)菌株，并為構(gòu)建高效利用豆粕資源的桿菌肽重組菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究作用的菌株質(zhì)粒見表 1，其中出發(fā)菌株地衣芽胞桿菌DW2由福建浦城綠康生化股份有限公司提供，菌種保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌株保藏號：CCTCC M2011344。本研究所使用的引物見表2。

表1 本研究所用的菌株和質(zhì)粒Table 1 The strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用的引物Table 2 The primers used in this study

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶 (EcoRⅠ、XbaⅠ、SacⅠ)、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、溶菌酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) (如 DL15000 Marker，DL5000 Marker，DL2000 Marker) 購自TaKaRa公司；Fastpfu DNA酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自上海賽百盛公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；引物合成及序列測定由北京澳科公司完成；瓊脂糖為 Biowest產(chǎn)品；D-甘露醇、D-山梨醇均為武漢華順生物技術(shù)公司進(jìn)口分裝產(chǎn)品；高效液相色譜使用的甲醇及乙腈為色譜純；酵母抽提物、胰蛋白胨購自英國Oxoid公司；氯化鈉、硫酸銨等試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；豆粕、玉米淀粉、輕質(zhì)碳酸鈣由福建浦城綠康生化有限公司提供。

1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：酵母抽提物 0.5%，胰蛋白胨1%，NaCl 1%，瓊脂粉2%，pH 7.2。

LB液體培養(yǎng)基：酵母抽提物 0.5%，胰蛋白胨1%，NaCl 1%，pH 7.2。

桿菌肽發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕 10%，玉米淀粉4.5%，輕鈣0.6%，硫酸銨0.1%，pH 7.0。

1.4 工程菌的構(gòu)建

1.4.1 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 YhdG游離強(qiáng)化表達(dá)工程菌的構(gòu)建

游離表達(dá)工程菌DW2/pHY-yhdG的構(gòu)建步驟如下：首先以枯草芽胞桿菌168基因組為模板擴(kuò)增P43啟動(dòng)子，以地衣芽胞桿菌DW2基因組DNA為模板擴(kuò)增氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因yhdG和淀粉酶基因amyL終止子TamyL，通過Splicing Overlap Extension (SOE)-PCR (SOE-PCR) 連接成目的片段，然后通過限制性內(nèi)切酶EocRⅠ/XbaⅠ將目的片段插入游離表達(dá)載體 pHY300PLK中，構(gòu)成游離表達(dá)載體pHY-yhdG，最后將重組載體電轉(zhuǎn)化至地衣芽胞桿菌DW2中，獲得基因yhdG游離表達(dá)工程菌DW2/pHY-yhdG。

1.4.2 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG缺失工程菌的構(gòu)建

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG缺失工程菌的構(gòu)建是依據(jù)同源重組的原理，通過溫敏性穿梭載體T2(2)-ori實(shí)現(xiàn)的[22-23]，具體步驟如下：以地衣芽胞桿菌DW2基因組DNA為模板，擴(kuò)增出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因yhdG的上下游同源臂，PCR產(chǎn)物回收，通過SOE-PCR將上下游連接到一起，并將連接到一起的片段通過SacⅠ和XbaⅠ雙酶切插入溫敏型穿梭質(zhì)粒T2(2)-ori中，獲得敲除載體 T2-yhdG。將敲除載體T2-yhdG電轉(zhuǎn)化到地衣芽胞桿菌DW2中，然后挑取陽性克隆子，加入到含20 μg/mL的卡那青霉素，于 180 r/min、45 ℃的條件下傳代培養(yǎng)數(shù)代，直至發(fā)生單交換。最后將成功發(fā)生單交換的陽性克隆子接到不含抗性的LB中，于180 r/min、37 ℃的條件下傳代培養(yǎng)數(shù)代，直至發(fā)生雙交換。通過PCR驗(yàn)證和DNA測序分析，獲得yhdG缺失工程菌DW2△yhdG。

1.5 發(fā)酵方法

菌種活化：挑取甘油管保藏的地衣芽胞桿菌菌種，于含有相應(yīng)抗性或無抗性的 LB平板上稀釋涂布，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落再在相應(yīng)的LB平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)12 h。

種子培養(yǎng)：從 LB固體培養(yǎng)基上挑取單菌落接種至20 mL LB液體培養(yǎng)基 (250 mL搖瓶)，230 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng) 8–10 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)基用 250 mL三角瓶裝液量20 mL，接種量5%，轉(zhuǎn)速230 r/min，37 ℃培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)長為48 h。每株發(fā)酵菌株至少設(shè)置3個(gè)搖瓶重復(fù)。

1.6 桿菌肽效價(jià)測定

本實(shí)驗(yàn)桿菌肽效價(jià)采用高效液相色譜(HPLC)方法測量，使用Agilent 1260液相色譜儀檢測[6-7]。

色譜柱：Eclipse Plus C18 column (4.6 mm ×150 mm, 3.5 μm)。

流動(dòng)相：A∶B＝35∶65 (A相：100 mL磷酸鹽緩沖液 (pH 6.0) 中加入300 mL蒸餾水；B相：520 mL甲醇與40 mL乙腈混合均勻，V/V)，流速：1.0 mL/min，柱溫 30 ℃；紫外檢測器波長：254 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.7 氨基酸檢測方法

樣品前處理方法如下。胞外樣品：將發(fā)酵液置于2 mL離心管內(nèi)，12 000 r/min離心10 min，取上清液保存于4 ℃冰箱；胞內(nèi)樣品：取15 mL發(fā)酵液，2 000 r/min、4 ℃離心5 min。取出8 mL上清于 20 mL離心管中，快速加入 0 ℃預(yù)冷的2.5%氯化鈉 (W/V) 溶液 10 mL，迅速混勻后，10 000 r/min、4 ℃離心5 min，去上清。剩余細(xì)胞團(tuán)用2.5%碳酸銨(W/V，4 ℃)溶液洗滌2次，加入3 mL 80%甲醇 (V/V) 抽提5 min，10 000 r/min、4 ℃離心5 min，收集上清，凍干，4 ℃保存。

樣品衍生化方法：胞內(nèi)凍干樣品加600 μL蒸餾水溶解，從中取出 500 μL，胞外樣品直接取500 μL，加入10 μL 7 mol/L氫氧化鈉溶液使pH呈堿性，再加 500 μL無水乙醇與吡啶的混合液(無水乙醇∶吡啶=4∶1)，輕輕振蕩均勻。加100 μL氯甲酸乙酯(ECF)，超聲 1 min。再加 100 μL ECF，超聲 1 min。加 500 μL 含 1% ECF的氯仿和 200 μL飽和碳酸氫鈉，振蕩1 min，加40 μL內(nèi)標(biāo)溶液后移至2 mL離心管，靜置5 min，3 000 r/min離心5 min。取下層至預(yù)先裝有無水硫酸鈉粉末的1.5 mL離心管中。3 000 r/min離心5 min，將上清液用移液器轉(zhuǎn)入氣相瓶中，待檢測。

氨基酸用氣相色譜(GC)方法測量，使用Agilent 7890A氣相色譜儀檢測[6]。

色譜柱：Agilent HP-5 column (30 m×0.32 mm×0.25 μm)；載氣為氮?dú)?，柱流速?.5 mL/min；樣品進(jìn)樣量為 1 μL，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度為280 ℃；柱溫程序：起始溫度70 ℃，保持5 min，以10 ℃ /min速度升溫至280 ℃，保持5 min，全過程 31 min；檢測器：氫火焰離子化檢測器(FID)，溫度280 ℃。載氣流量：30 mL/min，氫氣流量：30 mL/min，空氣流量：300 mL/min。

1.8 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3個(gè)平行，采用Origin9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和顯著性分析；采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，其中顯著性分析選用Duncan多范圍檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源支鏈氨基酸添加對地衣芽胞桿菌DW2桿菌肽發(fā)酵效價(jià)的影響

首先研究了在桿菌肽發(fā)酵的不同時(shí)間點(diǎn)添加支鏈氨基酸對桿菌肽效價(jià)的影響。選取的時(shí)間點(diǎn)為0、6、12、18、24 h，支鏈氨基酸的添加濃度為0.08 g/L。桿菌肽發(fā)酵結(jié)果表明，分別在18 h時(shí)添加Ile和在24 h添加Leu時(shí)桿菌肽的效價(jià)最高 (圖 1A 和圖 2A)，相比于對照組分別提高了16%和6%。而添加Val對桿菌肽的效價(jià)基本沒有影響 (圖 3)。隨后，研究了添加不同濃度的 Ile和Leu對桿菌肽效價(jià)的影響。添加濃度為0.04、0.08、0.12 g/L，添加時(shí)間分別為18 h和24 h。發(fā)酵結(jié)果表明，當(dāng)Ile添加濃度為0.08 g/L時(shí)，桿菌肽的效價(jià)最高，達(dá)到900.7 U/mL，相比于對照組提高了17% (圖1 B)；當(dāng)Leu添加濃度為0.04 g/L時(shí)，桿菌肽的效價(jià)最高，達(dá)到871.6 U/mL，相比于對照組提高了7% (圖2 B)。說明Ile和Leu的添加可以提高桿菌肽效價(jià)，其中Ile的添加效果較為明顯。

2.2 不同表達(dá)水平轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG對地衣芽胞桿菌DW2桿菌肽發(fā)酵效價(jià)的影響

上述支鏈氨基酸添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提高Ile和 Leu的供給可以提高桿菌肽的效價(jià)，其中 Ile的添加可以顯著提高桿菌肽效價(jià)。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是影響胞內(nèi)氨基酸供應(yīng)的重要因素，枯草芽胞桿菌中支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG負(fù)責(zé)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)包括支鏈氨基酸在內(nèi)的多種氨基酸，并且被認(rèn)為是最有效的 Ile攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[19]。因此，我們?yōu)榱颂骄哭D(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG對桿菌肽發(fā)酵效價(jià)的影響，分別構(gòu)建了yhdG游離強(qiáng)化表達(dá)工程菌 DW2/pHY-yhdG和yhdG缺失工程菌DW2△yhdG。隨后進(jìn)行桿菌肽發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG缺失后可以提高桿菌肽效價(jià)，DW2△yhdG桿菌肽效價(jià)達(dá)到917.35 U/mL，與原始菌DW2相比提高了11%。強(qiáng)化表達(dá)YhdG后，桿菌肽效價(jià)有所下降，相比于對照菌株DW2/pHY300降低了25%。上述結(jié)果表明，yhdG的缺失有利于桿菌肽的合成，這與我們預(yù)期的結(jié)果相反。

圖1 外源Ile添加對地衣芽胞桿菌DW2桿菌肽發(fā)酵效價(jià)的影響 (A：不同時(shí)間點(diǎn)添加0.08 g/L Ile對桿菌肽發(fā)酵效價(jià)影響；B：18 h添加不同濃度的Ile對桿菌肽發(fā)酵效價(jià)影響)Fig. 1 Effects of Ile addition on the bacitracin production. (A) The effects of 0.08 g/L Ile addition at different time on bacitracin production. (B) The effects of different concentrations of Ile addition at 18 h on bacitracin production. The different letters indicated the significant differences of bacitracin titers when Isoleucine addition (P<0.05).

圖2 外源Leu添加對地衣芽胞桿菌DW2桿菌肽發(fā)酵效價(jià)的影響 (A：不同時(shí)間點(diǎn)添加0.08 g/L Leu對桿菌肽發(fā)酵效價(jià)影響；B：24 h添加不同濃度的Leu對桿菌肽發(fā)酵效價(jià)影響)Fig. 2 Effects of Leu addition on the bacitracin production. (A) The effects of 0.08 g/L Leu addition at different time on bacitracin production. (B) The effects of different concentrations of Leu addition at 24 h on bacitracin production.The different letters indicated the significant differences of bacitracin titers when Leucine addition (P<0.05).

圖3 外源Val添加對地衣芽胞桿菌DW2桿菌肽發(fā)酵效價(jià)的影響Fig. 3 Effects of Val addition on the bacitracin production.The different letters indicated the significant differences of bacitracin titers when Valine addition (P<0.05).

圖4 不同表達(dá)水平的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 YhdG對地衣芽胞桿菌桿菌肽發(fā)酵效價(jià)的影響Fig. 4 Effect of different expression levels of permease YhdG on bacitracin yield. The different letters indicated the significant differences of bacitracin titers among recombinant strains (P<0.05).

圖5 yhdG缺失和強(qiáng)化對yhdG轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig. 5 Effects of deficiency and overexpression of yhdG on the yhdG transcriptional level. *P<0.05 and **P<0.01 indicate the significance levels between recombinant strains and control strain.

為了確定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG的表達(dá)水平的確會影響桿菌肽效價(jià)，我們檢測了yhdG游離強(qiáng)化表達(dá)工程菌 DW2/pHY-yhdG和yhdG缺失工程菌 DW2△yhdG中基因yhdG在發(fā)酵 30 h (桿菌肽快速合成期) 的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果如圖 5所示，DW2△yhdG中基因yhdG的轉(zhuǎn)錄水平為 0，說明該基因在 DW2△yhdG被成功敲除。而DW2/pHY-yhdG中yhdG的轉(zhuǎn)錄水平為對照菌株DW2/pHY300的32.65倍，說明YhdG強(qiáng)化表達(dá)菌株中yhdG的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高。以上結(jié)果進(jìn)一步說明yhdG表達(dá)量越低，越有利于桿菌肽的合成。

2.3 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因yhdG缺失對桿菌肽發(fā)酵過程不同時(shí)期胞內(nèi)外支鏈氨基酸濃度的影響

為了進(jìn)一步確證轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG是通過影響胞內(nèi)外支鏈氨基酸濃度從而影響桿菌肽效價(jià)的，我們隨后檢測了DW2△yhdG和出發(fā)菌株DW2在桿菌肽合成不同時(shí)期的胞內(nèi)、胞外氨基酸含量。通過檢測桿菌肽發(fā)酵過程中24 h (桿菌肽合成初期)、30 h (桿菌肽快速合成期) 和48 h (發(fā)酵終點(diǎn))的胞內(nèi)外支鏈氨基酸濃度，發(fā)現(xiàn)與對照菌相比，工程菌DW2△yhdG的胞內(nèi)、胞外的支鏈氨基酸濃度在桿菌肽合成初期基本一致，但是在桿菌肽快速合成期和發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，胞內(nèi)支鏈氨基酸的濃度遠(yuǎn)高于對照菌株地衣芽胞桿菌DW2。如圖6所示，在30 h桿菌肽快速合成時(shí)期，DW2△yhdG胞內(nèi)支鏈氨基酸 (異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸) 的濃度分別達(dá)到24.51、11.18、21.25 μg/mL，分別比地衣芽胞桿菌DW2提高了6.27、5.36、5.9倍；而在48 h發(fā)酵終點(diǎn)，DW2△yhdG胞內(nèi)支鏈氨基酸(異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸) 的濃度分別為22.59、14.54、25.18 μg/mL，仍然比對照菌株地衣芽胞桿菌DW2的支鏈氨基酸濃度提高了5.34、23.69、3.6倍。上述結(jié)果表明缺失轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG的確可以提高胞內(nèi)支鏈氨基酸尤其是 Ile和 Leu的供應(yīng)，從而達(dá)到提高桿菌肽產(chǎn)量的效果。與此同時(shí)，DW2△yhdG的胞外支鏈氨基酸含量在30 h和48 h時(shí)與DW2相比都出現(xiàn)了下降。DW2△yhdG胞內(nèi)胞外支鏈氨基酸的檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG在地衣芽胞桿菌DW2中的功能可能為負(fù)責(zé)將胞內(nèi)的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，這與人們之前在枯草芽胞桿菌中得出的結(jié)論相反。

有研究表明YhdG在枯草芽胞桿菌中，除了負(fù)責(zé)支鏈氨基酸的攝入，還參與丙氨酸 (Ala)、蘇氨酸 (Thr)、絲氨酸 (Ser)、半胱氨酸 (Cys) 和天冬氨酸 (Asp) 的轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，我們隨后檢測了20種常見氨基酸的其他 17種氨基酸，其中精氨酸沒有檢測到。氨基酸檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)DW2△yhdG的胞內(nèi)Ala、甘氨酸 (Gly)、脯氨酸 (Pro) 和甲硫氨酸 (Met) 的含量在桿菌肽合成后期高于DW2(圖7)。這表明在地衣芽胞桿菌DW2中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG并不是支鏈氨基酸的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其功能可能為負(fù)責(zé)將胞內(nèi)氨基酸運(yùn)輸?shù)桨狻?/p>

2.4 地衣芽胞桿菌DW2△yhdG發(fā)酵過程曲線

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，工程菌 DW2△yhdG的桿菌肽效價(jià)高于DW2，并且氨基酸檢測結(jié)果顯示其胞內(nèi)Ile和Leu含量在桿菌肽合成時(shí)期的確大幅度提高。隨后，為了進(jìn)一步探究YhdG缺失對發(fā)酵過程中菌體生長及桿菌肽合成的影響，我們檢測了工程菌DW2△yhdG及對照菌株DW2在發(fā)酵過程中的生物量和桿菌肽效價(jià)的變化曲線。結(jié)果如圖8所示，DW2△yhdG在發(fā)酵過程中的生物量略高于原始菌DW2，其原因可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG缺失后，導(dǎo)致胞內(nèi)支鏈氨基酸的含量提高，進(jìn)而提高了支鏈脂肪酸的合成能力，從而提高了DW2△yhdG發(fā)酵過程生物量[24]。與此同時(shí)，yhdG缺失菌株在整合發(fā)酵過程中的效價(jià)都高于對照菌株DW2，這進(jìn)一步證實(shí)了缺失轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因yhdG可以提高桿菌肽發(fā)酵效價(jià)。綜上所述，DW2△yhdG具有作為桿菌肽高產(chǎn)菌株的巨大潛力，而缺失轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 YhdG是一種提高桿菌肽產(chǎn)量的合理策略。

圖6 缺失轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG對地衣芽胞桿菌菌株發(fā)酵過程中胞內(nèi)胞外支鏈氨基酸的影響 (A：24 h胞內(nèi)支鏈氨基酸濃度；B：30 h胞內(nèi)支鏈氨基酸濃度；C：48 h胞內(nèi)支鏈氨基酸濃度；D：24 h胞外支鏈氨基酸濃度；E：30 h胞外支鏈氨基酸濃度；F：48 h胞外支鏈氨基酸濃度)Fig. 6 Effects of deleting YhdGon the concentrations of intracellular and extracellular BCAA. (A) Concentrations of intracellular amino acids at 24 h. (B) Concentrations of intracellular amino acids at 30 h. (C) Concentrations of intracellular amino acids at 48 h. (D) Concentrations of extracellular amino acids at 24 h. (E) Concentrations of extracellular amino acids at 30 h. (F) Concentrations of extracellular amino acids at 48 h. *P<0.05; **P<0.01.

圖7 缺失轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG對地衣芽胞桿菌桿菌肽發(fā)酵過程的其他氨基酸的影響 (A：24 h胞內(nèi)氨基酸濃度；B：30 h胞內(nèi)氨基酸濃度；C：48 h胞內(nèi)氨基酸濃度；D：24 h胞外氨基酸濃度；E：30 h胞外氨基酸濃度；F：48 h胞外氨基酸濃度)Fig. 7 Effect of deficiency of yhdG on the transportation of other amino acids during the bacitracin fermentation. (A)Concentrations of intracellular amino acids at 24 h. (B) Concentrations of intracellular amino acids at 30 h. (C)Concentrations of intracellular amino acids at 48 h. (D). Concentrations of extracellular amino acids at 24 h. (E)Concentrations of extracellular amino acids at 30 h; (F) Concentrations of extracellular amino acids at 48 h. *P<0.05,**P<0.01.

圖8 工程菌 DW2△yhdG在發(fā)酵過程中生物量和效價(jià)變化曲線Fig. 8 The biomass and bacitracin titer of DW2△yhdG during fermentation.

3 結(jié)論

本研究首先通過支鏈氨基酸添加實(shí)驗(yàn)證實(shí)了提高Ile和Leu的供應(yīng)可以提高桿菌肽效價(jià)，尤其是Ile的添加會顯著提高桿菌肽效價(jià)。隨后通過代謝工程手段敲除了地衣芽胞桿菌氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG，獲得了一株高產(chǎn)桿菌肽的地衣芽胞桿菌工程菌DW2△yhdG，其桿菌肽效價(jià)達(dá)到917.35 U/mL，與原始菌 DW2相比提高了 11%，并且其生物量也略高于DW2。該研究結(jié)果表明DW2△yhdG具有作為桿菌肽高產(chǎn)菌株的巨大潛力，為桿菌肽高產(chǎn)菌株的改造提供了一種新的策略。

支鏈氨基酸都是桿菌肽的組成氨基酸，但氨基酸添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)只有Ile和Leu添加會提高桿菌肽的效價(jià)，其中Ile效果較為顯著，而Val添加基本不會影響桿菌肽的效價(jià)。同時(shí)，其他桿菌肽組成氨基酸添加實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除了 Ile和 leu外，只有Glu、Cys和Lys的添加會提高桿菌肽的效價(jià)[6]，這可能與桿菌肽的組成成分和桿菌肽發(fā)酵培養(yǎng)基中豆粕中的氨基酸組含量有關(guān)。桿菌肽含有A、B1、B2、C......G等多種組分，其中A、B1、B2約占95%以上的生物活性，其中A擁有最高的生物活性[3]，而分析桿菌肽A、B1、B2發(fā)現(xiàn)A與B1中有兩個(gè)Ile殘基，而Val只在B2中出現(xiàn)。同時(shí)，分析桿菌肽發(fā)酵培養(yǎng)基中豆粕的氨基酸含量發(fā)現(xiàn)，Ile、Leu和Val的比例分別為2.45%、3.70%和2.29%[6]，可能相比于細(xì)胞生長和合成桿菌肽的需求量，Ile和Leu仍然不足，而Val卻已經(jīng)基本能滿足生長和桿菌肽合成所需，這就導(dǎo)致Ile和Leu的添加可以提高桿菌肽效價(jià)，而Val添加基本沒有影響。

此外，前期研究發(fā)現(xiàn)，在枯草芽胞桿菌中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG負(fù)責(zé)通過支鏈氨基酸的攝入來維持胞內(nèi)支鏈氨基酸的供給，因此yhdG的缺失使胞內(nèi)氨基酸的濃度降低，從而影響氨基酸的供給和目的產(chǎn)物的合成。然而，本研究發(fā)現(xiàn)在地衣芽胞桿菌缺失轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因yhdG后，胞內(nèi)支鏈氨基酸濃度顯著提高，胞外支鏈氨基酸濃度明顯降低。以上結(jié)果表明，yhdG的缺失提高了胞內(nèi)支鏈氨基酸尤其是Ile和Leu的供給水平，與此同時(shí)，yhdG缺失菌株中桿菌肽的產(chǎn)量有所提高。另外，當(dāng)強(qiáng)化表達(dá)YhdG時(shí)，桿菌肽的產(chǎn)量顯著下降，說明強(qiáng)化 YhdG的表達(dá)降低了胞內(nèi)氨基酸的供給水平，從而影響了桿菌肽的合成。綜上所述，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YhdG在地衣芽胞桿菌DW2中的功能可能為負(fù)責(zé)將胞內(nèi)的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外以維持支鏈氨基酸的平衡，這與人們之前在枯草芽胞桿菌中得到的結(jié)論相反[25-27]。與此同時(shí)，我們也檢測了20種常見氨基酸中的其余 17種氨基酸，發(fā)現(xiàn)DW2△yhdG的胞內(nèi)Ala、Gly、Pro和Met的含量在桿菌肽合成后期高于DW2，由此說明YhdG并不是支鏈氨基酸的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這與人們之前在枯草芽胞桿菌中得出的結(jié)論相一致[19]。

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