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    有機(jī)磷阻燃劑甲狀腺干擾效應(yīng)及其作用機(jī)制研究
    ——以磷酸三(2-氯丙基)酯(TCPP)為例

    2018-06-25 07:54:54孔東東王榮芳北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院北京師范大學(xué)地下水污染控制與修復(fù)教育部工程中心北京100875
    中國(guó)環(huán)境科學(xué) 2018年6期
    關(guān)鍵詞:酵母基因組激素

    沈 揚(yáng),于 暢,孔東東,王榮芳,李 劍 (北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院,北京師范大學(xué)地下水污染控制與修復(fù)教育部工程中心,北京 100875)

    甲狀腺激素由甲狀腺分泌,在人類和動(dòng)物的生理過程中發(fā)揮著重要的作用,包括調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、能量代謝、組織分化和發(fā)育以及維護(hù)大腦功能等[1].甲狀腺激素干擾物(TDCs)是一類能改變下丘腦-垂體-甲狀腺軸穩(wěn)態(tài)的維持和調(diào)節(jié)或者作用于依賴于甲狀腺激素的相關(guān)功能的一類外源性化合物[2].甲狀腺激素功能的紊亂可導(dǎo)致兒童大腦的發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育障礙[3-4].

    目前許多外源性化合物能夠干擾甲狀腺激素活性,已發(fā)現(xiàn)的可疑甲狀腺激素干擾物包括:多氯聯(lián)苯類(PCBs)、二噁英類物質(zhì)、溴代阻燃劑類(BFRs,如多溴聯(lián)苯類(PBBs),多溴聯(lián)苯醚(PBDEs))、有機(jī)磷阻燃劑類(OPFRs)、鄰苯二甲酸酯類(PAEs)等[4-5].其中,OPFRs由于其優(yōu)良的阻燃性能,成為 BFRs的替代產(chǎn)品,目前已廣泛應(yīng)用于紡織、化工、建材以及電子等行業(yè)[6].隨著BFRs在世界范圍逐步禁用, OPFRs目前的全球年產(chǎn)量已達(dá) 20萬(wàn) t[7].其中,磷酸三(2-氯丙基)酯(TCPP)是目前最常見的有機(jī)磷阻燃劑.TCPP的大量生產(chǎn)和使用導(dǎo)致其在環(huán)境和人體組織中的廣泛檢出. Khan等[8]在巴基斯坦的工業(yè)區(qū)和農(nóng)村的飲用水中檢出 TCPP是主要的阻燃劑類污染物.2014年,在我國(guó)黃海、東海海域廣泛檢出TCPP,檢出濃度范圍為 92~1392ng/L.TCPP甚至在南京飲用水中被檢出,濃度為 325ng/L[9].TCPP在環(huán)境中的廣泛檢出可能對(duì)人體健康和生態(tài)安全構(gòu)成威脅[10].例如,TCPP會(huì)干擾內(nèi)分泌系統(tǒng),影響斑馬魚的正常發(fā)育[11].

    TCPP在分子結(jié)構(gòu)方面與天然甲狀腺激素三碘甲狀腺原氨酸(T3)和四碘甲狀腺原氨酸(T4)結(jié)構(gòu)類似,可能模擬天然甲狀腺激素對(duì)生物體產(chǎn)生干擾.TCPP已被列入可疑TDCs清單,因此TCPP可能對(duì)甲狀腺激素產(chǎn)生干擾效應(yīng).陸美婭等[12]采用報(bào)告基因檢測(cè)方法考察9種OPFRs與甲狀腺激素受體(TR)的作用,結(jié)果表明 TCPP表現(xiàn)出顯著的TR抑制活性.但是,Kojima等[13]開展TCPP與甲狀腺核受體 TRα、TRβ的作用研究發(fā)現(xiàn),未檢出其對(duì) TRα/β誘導(dǎo)或抑制活性.可見,對(duì)于TCPP甲狀腺激素毒性,目前的研究報(bào)道并沒有得到一致性的結(jié)論.綜上所述,TCPP甲狀腺激素干擾毒性及其致毒機(jī)理的研究才剛剛起步,急需開展 TCPP的甲狀腺激素干擾活性及其作用機(jī)理的相關(guān)研究.

    由于 TCPP可能模擬天然甲狀腺激素干擾其活性,關(guān)于 TCPP對(duì)甲狀腺激素干擾作用機(jī)理的研究通常以甲狀腺激素的分子作用機(jī)制研究為基礎(chǔ).目前的研究發(fā)現(xiàn),甲狀腺激素主要通過基因組作用和非基因組作用兩種途徑在不同的組織中行使生理功能[14].目前的研究多集中于基因組作用途徑,即經(jīng)典核受體途徑.近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),甲狀腺激素還可以通過非基因轉(zhuǎn)錄的方式對(duì)靶細(xì)胞或組織進(jìn)行調(diào)節(jié),即存在非基因組(nongenomic)途徑.甲狀腺激素的非基因組作用可以定義為 THs與細(xì)胞核外的受體不通過核內(nèi)結(jié)合過程所產(chǎn)生的作用[15].此前,有文獻(xiàn)[16-17]證實(shí)PCB153可通過非基因組作用途徑產(chǎn)生甲狀腺激素干擾效應(yīng),進(jìn)一步佐證了非基因組作用途徑是TDCs的甲狀腺激素干擾效應(yīng)的重要因素.但是目前關(guān)于 TDCs對(duì)甲狀腺激素的非基因組作用途徑的研究報(bào)道較少.

    本文選擇典型的OPFRs TCPP作為研究對(duì)象,通過對(duì)GH3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和重組TR基因酵母實(shí)驗(yàn)考察其甲狀腺激素干擾效應(yīng),同時(shí)采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),表征TCPP暴露對(duì)GH3細(xì)胞關(guān)鍵基因表達(dá)的調(diào)節(jié),初步探明其干擾作用機(jī)理.以期為TCPP的甲狀腺激素毒性及TCPP環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論支持;同時(shí),本研究可為其他 TDCs的甲狀腺激素干擾機(jī)理的研究提供方法學(xué)上的借鑒.

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    F10培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、15%馬血清均購(gòu)自Gibco公司(美國(guó));胰蛋白酶購(gòu)自 Life Technologies公司(美國(guó));牛胰島素(≥95%)、牛血清白蛋白(98%)購(gòu)自 Sigma公司(美國(guó));人脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白(98%)購(gòu)自 Solarbio公司;乙醇胺(99.5%),亞硒酸鈉(99.75%),TCPP(99%),T3(98%,購(gòu)自上海百靈威化學(xué)公司);MTT試劑盒和LDH試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所.二甲亞砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)(99.5%)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(美國(guó)).

    1.2 重組TR基因酵母實(shí)驗(yàn)

    重組TR基因酵母由中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質(zhì)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供.測(cè)試方法參考文獻(xiàn)[18]進(jìn)行.可簡(jiǎn)述為,選擇指數(shù)生長(zhǎng)期的酵母,調(diào)節(jié)酵母菌株培養(yǎng)液在600nm波長(zhǎng)處的吸光度值為0.8左右.在無(wú)菌條件下取995μL菌株培養(yǎng)液、5μL DMSO 溶解的樣品,混勻成暴露培養(yǎng)液.DMSO作為陰性對(duì)照,T3作為陽(yáng)性對(duì)照.將200μL暴露培養(yǎng)液加入無(wú)菌的 96孔培養(yǎng)板中,800r/min、30℃下振蕩培養(yǎng)2h.酶標(biāo)儀(TECAN GENios A-5002, Austria)測(cè)定 OD600的值.從培養(yǎng)板中吸出150μL菌液,加入120μL緩沖液,在微孔搖床上預(yù)培養(yǎng)5min后加入20μL三氯甲烷,微孔搖床最大轉(zhuǎn)速振蕩 10min破碎酵母細(xì)胞;再加入40μL o-NPG 反應(yīng)液?jiǎn)?dòng)酶反應(yīng),并計(jì)時(shí)直至出現(xiàn)明顯的黃色,反應(yīng)完成后加入 100μL (1mol/L)的碳酸鈉溶液,固定反應(yīng),吸取200μL轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板中測(cè)定420nm波長(zhǎng)處的吸光度值,計(jì)算目標(biāo)化合物誘導(dǎo)酶活性值如文獻(xiàn)[18]所述.對(duì)目標(biāo)化合物的 TR抑制活性開展檢測(cè)時(shí),在測(cè)試體系中添加5×10-6mol/L T3,檢測(cè)目標(biāo)化合物對(duì)T3誘導(dǎo)酶活性的抑制作用,每個(gè)樣品設(shè) 4組平行,參考文獻(xiàn)[19]報(bào)道計(jì)算目標(biāo)化合物的抑制率.

    1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

    GH3大鼠垂體瘤細(xì)胞株引自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心,GH3(TRβ-)細(xì)胞由英茂盛業(yè)生物科技有限公司提供,其原理可簡(jiǎn)述為:根據(jù)TRβ1mRNA序列設(shè)計(jì)6個(gè)靶點(diǎn)和一個(gè)陰性隨機(jī)對(duì)照序列,構(gòu)建慢病毒 TRβ1RNA 干擾載體和陰性對(duì)照載體.將慢病毒 TRβ1RNA 干擾載體和陰性對(duì)照載體分別包裝為慢病毒后感染GH3細(xì)胞,通過嘌呤霉素(puromycin)篩選 TRβ1基因 RNA干擾穩(wěn)定細(xì)胞株,驗(yàn)證結(jié)果表明 GH3(TRβ-)細(xì)胞株TRβ1的相對(duì)表達(dá)量為空白對(duì)照的17.95%,可認(rèn)為 TRβ1缺陷細(xì)胞.GH3細(xì)胞和 GH3(TRβ-)細(xì)胞的培養(yǎng)方式細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)步驟相同,參考文獻(xiàn)[20],可簡(jiǎn)述為:用F10培養(yǎng)基(含2.5%胎牛血清、15%馬血清)37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3~4天傳代 1次.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,經(jīng) 0.25%胰蛋白酶消化后,用貼壁培養(yǎng)基(1mg 牛胰島素,0.6μL 乙醇胺(1μmol/L),1μg亞硒酸鈉,1mg人輔基轉(zhuǎn)鐵蛋白及 50mg牛血清白蛋白定容于100mL DMEM/F12培養(yǎng)基)調(diào)整細(xì)胞密度為4×l05個(gè)/mL.每孔加入 100μL 細(xì)胞懸液,8μL 目標(biāo)化合物加入到4mL培養(yǎng)基中制備暴露培養(yǎng)液,待24h細(xì)胞貼壁后,加入暴露培養(yǎng)液20μL,DMSO作為空白對(duì)照,保證每孔 DMSO終濃度為 0.1%.繼續(xù)培養(yǎng)48h后,每孔加入20μL的MTT溶液,培養(yǎng)箱中孵化 4h后吸盡所有溶液,加入 150μL/孔DMSO,置于搖床上振搖 10min后,酶標(biāo)儀測(cè)定570nm 下的吸光度值 OD570.樣品(Iai)和對(duì)照(IT3)的細(xì)胞增殖率的計(jì)算參考文獻(xiàn)[18]報(bào)道進(jìn)行.細(xì)胞增殖抑制率Ibi計(jì)算公式如下.

    式中:Ibi為細(xì)胞增殖抑制率;IT3為T3的細(xì)胞增殖率;Iai為樣品誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖率.

    1.4 乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)方法

    為排除目標(biāo)化合物急性細(xì)胞毒性對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響,重組基因酵母實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[18]報(bào)道方法檢測(cè)目標(biāo)化合物對(duì)酵母細(xì)胞的急性毒性.

    LDH實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充檢測(cè)化合物暴露后誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的乳酸脫氫酶,以表征目標(biāo)化合物對(duì)GH3細(xì)胞的急性毒性.測(cè)試流程可簡(jiǎn)述為:細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)在加入 MTT溶液之前,從對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)板中取上清液100μL加入新的96孔板中,置于 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10min,根據(jù)LDH試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè).酶標(biāo)儀于440nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值,

    式中:Ui為L(zhǎng)DH露出率;ODd為目標(biāo)化合物的吸光度值;ODc為對(duì)照的吸光度值;ODt為標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值;ODb為空白樣品的吸光度值;C為標(biāo)準(zhǔn)品濃度2mmol/L;D為稀釋倍數(shù);Ri為L(zhǎng)DH相對(duì)露出率;Uii為目標(biāo)化合物的 LDH露出率;Uio為DMSO的LDH露出率.Uii和Uio均由式(2)計(jì)算得到.

    1.5 RT-PCR法檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)[21]

    1.5.1 RNA提取方法與逆轉(zhuǎn)錄 GH3細(xì)胞暴露TCPP與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)前期步驟相同,暴露完成后,使用RNA-Solv reagent試劑盒(Omega公司,美國(guó))并按照其步驟提取總 RNA.通過測(cè)定樣品在A260nm/A280nm的比值確定樣品的純度在1.8到2.0的范圍內(nèi)(Nanodrop ND-1000, Nano-Drop,Wilmington, USA).使用 PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(Takara公司,日本)逆轉(zhuǎn)錄,具體操作方法參見試劑盒的說(shuō)明書.

    1.5.2 熒光定量PCR方法 使用ABI7500Realtime PCR System對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行SYBR Green絕對(duì)定量PCR反應(yīng),每個(gè)樣品設(shè)4組平行.在無(wú)菌96孔板中配置20μL PCR反應(yīng)體系.SYBR Green溶液10μL;前引物、后引物各1μL;DNA樣品<1μg;無(wú)菌水補(bǔ)齊20μL.反應(yīng)過程為:95℃下變性5min,之后進(jìn)行40個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)在95℃下15s,退火溫度55℃1min.以 β-actin為內(nèi)參照.各目的基因及內(nèi)參基因β-actin的引物見表1.采用比較循環(huán)閾值法分析各組中mRNA的相對(duì)表達(dá)量.

    表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1 Primer sequence for quantitative Real-time PCR in GH3cell

    1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

    所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理.所得數(shù)據(jù)以±s表示,組間差異采用 t檢驗(yàn).P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 TCPP對(duì)GH3細(xì)胞增殖的影響

    TCPP 暴露濃度范圍設(shè)定為 2×10-8~2×10-4(mol/L),檢測(cè)不同暴露濃度下 TCPP對(duì)甲狀腺激素效應(yīng)的干擾.測(cè)試結(jié)果如圖1(a)所示, TCPP與空白對(duì)照相比對(duì)GH3細(xì)胞無(wú)顯著的增殖促進(jìn)作用(P>0.05).

    圖1 TCPP對(duì)GH3細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of different treatment concentrations on GH3 proliferation of TCPP

    為表征 TCPP對(duì) T3增殖活性的抑制,將TCPP與T3(2×10-8mol/L)共同暴露,考察TCPP對(duì)GH3細(xì)胞增殖的影響.結(jié)果如圖 1(b)所示,TCPP在 1×10-4mol/L和2×10-4mol/L暴露濃度下抑制率分別達(dá)到24.47%和34.43%,對(duì)T3的增殖具有明顯的抑制作用(P<0.01).GH3細(xì)胞富含 TR,具有甲狀腺激素依賴增殖的特點(diǎn),通過檢測(cè)化合物暴露對(duì)GH3細(xì)胞增殖的影響發(fā)展了該方法,已成為TDCs篩選的主要方法,廣泛應(yīng)用于PCBs等甲狀腺激素干擾效應(yīng)的檢測(cè)[22].本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,TCPP對(duì)于GH3細(xì)胞無(wú)明顯的細(xì)胞增殖誘導(dǎo)效應(yīng).但是,TCPP能夠抑制天然甲狀腺激素T3對(duì)GH3細(xì)胞的增殖效應(yīng),表現(xiàn)出GH3細(xì)胞增殖抑制活性.說(shuō)明TCPP可干擾甲狀腺激素效應(yīng),表現(xiàn)為甲狀腺激素的抑制劑.

    為排除目標(biāo)化合物的急性毒性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,添加 LDH 檢測(cè)實(shí)驗(yàn).其測(cè)試原理可表征為:化合物暴露導(dǎo)致細(xì)胞損傷,受損細(xì)胞在培養(yǎng)過程中破碎并釋放LDH,因此通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH露出率的高低反映暴露化合物的急性毒性[23].TCPP 暴露 GH3細(xì)胞后,通過檢測(cè)培養(yǎng)液中的LDH活性變化,表征TCPP對(duì)GH3細(xì)胞的急性毒性.測(cè)試結(jié)果如圖 2所示,所有暴露濃度下,TCPP對(duì)GH3細(xì)胞的LDH露出率與空白對(duì)照相比無(wú)顯著變化(P>0.01),表明測(cè)試濃度下,TCPP未對(duì)GH3細(xì)胞產(chǎn)生顯著損傷.該實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本排除 TCPP產(chǎn)生細(xì)胞毒性對(duì)細(xì)胞增殖的影響,表明TCPP對(duì) T3誘導(dǎo)的 GH3細(xì)胞增殖具有抑制活性,TCPP具有甲狀腺激素干擾效應(yīng).

    圖2 TCPP染毒對(duì)GH3細(xì)胞LDH露出率的影響Fig.2 LDH leakage rate of GH3cells exposure to TCPP

    2.2 TCPP甲狀腺激素干擾途徑初步研究

    2.2.1 TCPP對(duì)重組TR基因酵母的甲狀腺激素干擾效應(yīng) 為了考察 TCPP對(duì) TR的干擾作用,選擇暴露濃度為 2×10-8~2×10-4(mol/L)開展重組TR基因酵母實(shí)驗(yàn),測(cè)試結(jié)果表明,所有樣品均未檢出顯著的酵母細(xì)胞急性毒性,表明了 TCPP即使在最高暴露濃度下也不會(huì)誘導(dǎo)酵母細(xì)胞損傷,排除了待測(cè)化合物急性毒性對(duì)酵母細(xì)胞甲狀腺激素干擾效應(yīng)測(cè)試結(jié)果的影響.

    如圖3(a)所示,對(duì)比各濃度下TCPP與T3的誘導(dǎo)率(100.50%)可知,TCPP未表現(xiàn)出明顯的TR誘導(dǎo)活性.低濃度下,TCPP未表現(xiàn)出顯著的TR抑制活性;高濃度(>2×10-5mol/L)情況下,TCPP 表現(xiàn)出顯著的TR抑制效應(yīng)(P<0.05),在TCPP的暴露濃度為 2×10-4mol/L 時(shí),誘導(dǎo)率達(dá)到 36.09%(P<0.01)(圖 3(b)).陸美婭等[12]采用報(bào)告基因檢測(cè)方法考察 TCPP等的甲狀腺激素干擾效應(yīng),結(jié)果表明 TCPP 在(1×10-9mol/L~1×10-5mol/L)濃度范圍內(nèi)無(wú)TR誘導(dǎo)活性,而在1×10-5mol/L濃度下表現(xiàn)出 TR抑制活性,與本文的研究結(jié)論基本一致.該結(jié)果與上文報(bào)道的GH3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也具有一致性,均未檢測(cè)出顯著的 TCPP甲狀腺激素誘導(dǎo)活性,但是檢測(cè)出 TCPP甲狀腺激素抑制活性.重組 TR基因酵母方法實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)原理可簡(jiǎn)述為采用酵母雙雜交技術(shù)將TR基因和受體共激活因子基因共轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母細(xì)胞,通過測(cè)定報(bào)告基因 LacZ表達(dá)產(chǎn)物 β-半乳糖苷酶活性,表征化合物對(duì) TR的干擾活性[24].結(jié)合本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可初步表明TCPP可通過TR途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)甲狀腺激素活性的干擾.大量文獻(xiàn)報(bào)道典型的 TDCs,例如PCBs、PBDEs和PBBs[25-26],均可通過作用TR,實(shí)現(xiàn)對(duì)甲狀腺激素活性的干擾.

    2.2.2 TCPP對(duì) GH3(TRβ-)細(xì)胞增殖的影響 近年來(lái)有研究表明,甲狀腺激素不僅可以通過 TR對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行作用,還可以通過非基因轉(zhuǎn)錄的方式對(duì)靶細(xì)胞或組織進(jìn)行調(diào)節(jié),即存在非基因組途徑.已有研究表明在 TR眾多亞型中,甲狀腺激素主要通過TRβ對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行作用[27].因此,本研究采用基因沉默技術(shù)敲除 GH3細(xì)胞中的TRβ 基因,構(gòu)建 GH3(TRβ-)缺陷型細(xì)胞,并通過GH3(TRβ-)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),考察 TCPP是否通過非基因組途徑干擾甲狀腺激素效應(yīng).本文重點(diǎn)考察 TCPP對(duì) GH3(TRβ-)細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng).TCPP和T3共同暴露于GH3(TRβ-)細(xì)胞,結(jié)果表明,TCPP的暴露濃度在 1×10-4mol/L 和 2×10-4mol/L時(shí),細(xì)胞增殖率分別為 113.39%和109.23%,顯著低于T3單獨(dú)作用下的細(xì)胞增殖率(P<0.05),表明 TCPP 對(duì) T3 誘導(dǎo)的 GH3(TRβ-)細(xì)胞增殖具有抑制活性.

    本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TCPP在暴露濃度為1×10-4mol/L和2×10-4mol/L時(shí)可抑制T3誘導(dǎo)的GH3(TRβ-)細(xì)胞增殖,表明TCPP可能存在TR途徑外的作用方式.Liu等[16]的報(bào)道也證實(shí)PCB153可通過刺激氨基末端激酶(JNK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路下調(diào)甲狀腺激素水平,證實(shí) PCB153可通過非基因組作用產(chǎn)生甲狀腺激素干擾效應(yīng).進(jìn)一步佐證了非基因組作用途徑不僅存在于 THs 調(diào)節(jié)的生物學(xué)效應(yīng),同時(shí)也是TDCs甲狀腺激素干擾效應(yīng)的重要作用方式.此前的研究表明非基因組途徑不依賴基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、能夠在數(shù)秒或分鐘時(shí)間內(nèi)快速應(yīng)答,對(duì)維持THs的生物學(xué)效應(yīng)起著至關(guān)重要的作用[15].因此,研究 TDCs的甲狀腺激素干擾非基因組效應(yīng)的作用機(jī)理具有重要的環(huán)境意義,其對(duì)于更加全面的評(píng)估 TDCs的毒理學(xué)效應(yīng),從而預(yù)測(cè)造成的生態(tài)與健康風(fēng)險(xiǎn).由此可見,研究TDCs不應(yīng)僅僅局限于對(duì)基因組作用途徑的考察,應(yīng)拓展 TDCs作用途徑的研究.

    圖4 TCPP對(duì)GH3(TRβ-)細(xì)胞的抑制效應(yīng)Fig.4 Antagonist activities of TCPP using the GH3(TRβ-)cell proliferation assay

    2.3 TCPP對(duì)相關(guān)mRNA表達(dá)的影響

    為探究TCPP的甲狀腺激素干擾效應(yīng)及可能的作用途徑,在基因?qū)用嫔?考察 TCPP暴露對(duì)相關(guān)基因mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié).測(cè)試結(jié)果如圖5所示,TCPP與T3共同暴露GH3細(xì)胞48h后, c-fos基因、TRβ基因, integrin-av基因和k-ras基因mRNA表達(dá)顯著下調(diào);TRα基因、raf-1基因和Mapk-3基因mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化.

    已有研究證明 TDCs能夠在不同的組織干擾TRα、TRβ mRNA的表達(dá)[26].此外,Scarlett等[29]通過對(duì)人類成骨細(xì)胞對(duì)甲狀腺激素信號(hào)通路的研究,結(jié)果表明甲狀腺激素能通過結(jié)合細(xì)胞膜整合素 αvβ3能夠迅速激活 ERK-1/2活性.ERK1/2是一條重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化和凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其主要受各種生長(zhǎng)因子或外來(lái)化合物等磷酸化而激活[30].ERK1/2的活化是信號(hào)從細(xì)胞膜表面轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)的關(guān)鍵,這一轉(zhuǎn)導(dǎo)過程包括k-ras、raf-1、Mapk-3等基因的參與.

    已有研究表明,c-fos基因是一個(gè)與細(xì)胞增殖相關(guān)的原癌基因,可調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的動(dòng)態(tài)平衡,誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成[31].GH3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明TCPP可抑制T3誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖效應(yīng),c-fos表達(dá)的下調(diào)與此結(jié)果相符合,提示TCPP可能通過下調(diào)c-fos抑制細(xì)胞增殖.

    如圖5所示,TCPP暴露可導(dǎo)致TRβ mRNA表達(dá)顯著下調(diào).Augustine等報(bào)道了與本文類似的結(jié)論,證實(shí)典型 TDCs可以通過干擾 TRβmRNA的表達(dá)干擾甲狀腺激素活性.p,p,-DDE在0.01mg/kg暴露青蛙后,檢測(cè)到腎臟中 TRβ基因表達(dá)下調(diào)[32].Shi等[33]研究也表明全氟辛烷磺酸暴露導(dǎo)致斑馬魚幼魚 TRβ表達(dá)下調(diào).THs與 TR結(jié)合通過受體級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控,而TDCs通過調(diào)節(jié)TRβ基因表達(dá),可能導(dǎo)致THs不能激活受體級(jí)聯(lián)反應(yīng)[34],從而影響細(xì)胞增殖等激素調(diào)節(jié)過程.基于此,可初步認(rèn)為TCPP可能通過影響 TRβ基因表達(dá),干擾激素-受體級(jí)聯(lián)反應(yīng),產(chǎn)生甲狀腺激素干擾效應(yīng).

    圖5 TCPP與T3(2×10-8mol/L)共同暴露GH3細(xì)胞對(duì)相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的調(diào)節(jié)Fig.5 mRNA levels of related gene in GH3cell** P<0.01

    αvβ3-ERK-1/2轉(zhuǎn)導(dǎo)過程包括 integrin-av、k-ras和 raf-1等基因的參與[30].本研究中,integrin-av和k-ras基因的mRNA顯著下調(diào),說(shuō)明 TCPP可能激活 αvβ3-ERK-1/2通路.已有文獻(xiàn)[35]報(bào)道典型 TDCs 鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)染毒大鼠睪丸支持細(xì)胞后致使ERK通路相關(guān)基因表達(dá)顯著降低.相關(guān)理論研究表明,αvβ3-ERK-1/2信號(hào)通路在細(xì)胞的分裂、遷移及存活方面有重要的調(diào)節(jié)作用,主要參與各種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、絲裂原以及激素受體活化后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),參與細(xì)胞的生存、增殖[36].初步表明TCPP可通過αvβ3-ERK-1/2信號(hào)通路,即通過非基因組作用途徑,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖,與本文 2.2.2研究結(jié)果一致.此外,有研究表明[15],非基因組途徑可能和基因組途徑產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng).以 αvβ3-ERK1/2 信號(hào)通路為例, ERK1/2亦可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),通過磷酸化激活 TR,直接作用于甲狀腺激素反應(yīng)基因.因此,TCPP也可能兩種作用途徑的整合干擾甲狀腺激素調(diào)節(jié)的快速及長(zhǎng)期效應(yīng).

    3 結(jié)論

    3.1 GH3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明TCPP可對(duì)甲狀腺激素產(chǎn)生干擾效應(yīng).同時(shí),重組 TR基因酵母實(shí)驗(yàn)和 GH3(TRβ-)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)初步表明,TCPP可能通過基因組途徑和非基因組途徑實(shí)現(xiàn)其甲狀腺激素干擾.

    3.2 TCPP對(duì)GH3細(xì)胞相關(guān)基因mRNA表達(dá)影響測(cè)試結(jié)果表明:TCPP與T3的共同暴露,下調(diào)c-fos、TRβ、integrin-av和k-ras的mRNA表達(dá).初步認(rèn)為TCPP可能通過影響 TRβ基因表達(dá)和激活 αvβ3-ERK-1/2信號(hào)通路產(chǎn)生甲狀腺激素干擾效應(yīng).

    3.3 本研究初步表明 TCPP不僅可以通過基因組途徑,還可以通過非基因組途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)甲狀腺激素的干擾.結(jié)果能夠更加全面地反映 TCPP的生物學(xué)毒性,有利于進(jìn)一步開展 TCPP的生態(tài)和健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià).

    [1]艾 揚(yáng),孔東東,于 暢,等.水環(huán)境中溶解態(tài)腐殖酸對(duì)鋅抗甲狀腺激素干擾效應(yīng)的影響 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2017,38(1):195-200.

    [2]Murk A. J, Rijntjes E, Blaauboer B J, et al. Mechanism-based testing strategy using in vitro approaches for identification of thyroid hormone disrupting chemicals [J]. Toxicology in Vitro,2013,27(4):1320-1346.

    [3]Shi W, Hu X X, Zhang F X, et al. Occurrence of thyroid hormone activities in drinking water from Eastern China: Contributions of phthalate esters [J]. Environmental Science & Technology,2012,46(3):1811-1818.

    [4]Boas M, Feldt-Rasmussen U, Main K M. Thyroid effects of endocrine disrupting chemicals [J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2012,355(2):240-248.

    [5]穆希巖,李成龍,黃 瑛,等.兩種鄰苯二甲酸酯類污染物對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2017,(9):3566-3575.

    [6]王曉偉,劉景富,陰永光.有機(jī)磷酸酯阻燃劑污染現(xiàn)狀與研究進(jìn)展 [J]. 化學(xué)進(jìn)展, 2010,22(10):1983-1992.

    [7]Zhao F R, Chen M, Gao F M, et al. Organophosphorus flame retardants in pregnant women and their transfer to chorionic Villi [J].Environmental Science & Technology, 2017,51(11):6489-6497.

    [8]Khan M, Li, J, Zhang, G et al. First insight into the levels and distribution of flame retardants in potable water in Pakistan: An underestimated problem with an associated health risk diagnosis[J]. Science of Total Environment, 2016,565:346-359.

    [9]Farhat A, Crump D, Chiu S, et al. In ovo effects of two organophosphate flame retardants-TCPP and TDCPP-on pipping success, development, mRNA expression, and thyroid hormone levels in chicken embryos [J]. Toxicological Sciences, 2013,134(1):92-102.

    [10]van der Veen I, de Boer J. Phosphorus flame retardants: Properties,production, environmental occurrence, toxicity and analysis [J].Chemosphere, 2012,88(10):1119-1153.

    [11]皮天星,蔡磊明,蔣金花.新型阻燃劑TCPP對(duì)斑馬魚的毒性研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2016,11(2):247-256.

    [12]陸美婭.雌激素受體ER和甲狀腺激素受體TR介導(dǎo)的典型環(huán)境內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)研究 [D]. 杭州:浙江工業(yè)大學(xué), 2015.

    [13]Kojima H, Takeuchi S, Itoh T, et al. In vitro endocrine disruption potential of organophosphate flame retardants via human nuclear receptors [J]. Toxicology, 2013,314(1):76-83.

    [14]Davis P J, Lin H Y, Mousa SA, et al. Overlapping nongenomic and genomic actions of thyroid hormone and steroids [J]. Steroids,2011,76(9):829-833.

    [15]Davis P J, Leonard J L, Davis F B. Mechanisms of nongenomic actions of thyroid hormone [J]. Frontiers in Neuroendocrinology,2008,29(2):211-218.

    [16]Liu C, Ha M, Cui Y, et al. JNK pathway decreases thyroid hormones via TRH receptor: A novel mechanism for disturbance of thyroid hormone homeostasis by PCB153 [J]. Toxicology,2012,302(1):68-76.

    [17]周 君. p,p'-DDE,PCB-153單獨(dú)及聯(lián)合作用通過ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)大鼠離體腦垂體細(xì)胞的類激素效應(yīng) [D]. 武漢:華中科技大學(xué), 2013.

    [18]Li J, Ma M, Wang Z J. A two-hybrid yeast assay to quantify the effects of xenobiotics on thyroid hormone-mediated gene expression [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2008,27(1):159-167.

    [19]劉 蕓,李 劍,馬 梅,等.代謝活化作用對(duì)多溴代聯(lián)苯類污染物類/抗甲狀腺激素活性的影響 [J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2008,3(1):27-33.

    [20]Schriks M., Vrabie C M, Gutleb A C, et al. T-screen to quantify functional potentiating, antagonistic and thyroid hormone-like activities of poly halogenated aromatic hydrocarbons (PHAHs)[J]. Toxicology in Vitro, 2006,20(4):490-498.

    [21]Pruden A, Pei R T, Stortrboom H, et al. Antibiotic resistance genes as emerging contaminants: studies in northern Colorado [J].Environmental Science and Technology, 2006,40(23):7445-7450.

    [22]李 劍,任姝娟,馬 梅,等.改進(jìn)型重組基因酵母 TR-GRIP1檢測(cè)化合物甲狀腺激素干擾活性 [J]. 環(huán)境科學(xué)研究, 2011,24(10):1172-1177.

    [23]文 育,雷炳莉,康 佳,等.雙酚 A 類同系物的雌激素效應(yīng)及對(duì)MCF-7細(xì)胞的毒性 [J]. 上海大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2015,21(4):515-524.

    [24]Li J, Liu Y, Kong D, et al. T-screen and yeast assay for the detection of the thyroid-disrupting activities of cadmium,mercury, and zinc [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2016,23(10):9843-9851.

    [25]Techer R, Houde M, Verreault J. Associations between organohalogen concentrations and transcription of thyroid-related genes in a highly contaminated gull population [J]. Science of Total Environment, 2016,545:289-298.

    [26]Dingemans M M L, van den Berg M, Westerink RHS.Neurotoxicity of brominated flame retardants: (in) direct effects of parent and hydroxylated polybrominated diphenyl Ethers on the (Developing) Nervous System [J]. Environmental Health Perspectives, 2011,119(7):900-907.

    [27]Sandler B, Webb P, Apriletti J W. Thyroxine-thyroid hormone receptor interactions [J]. Journal of Biological Chemistry,2004,279(53):55801-55808.

    [28]Arukwe A, Jenssen B M. Differential organ expression patterns of thyroid hormone receptor isoform genes in p.p’-DDE-treated adult male common frog Rana temporaria [J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2005,20:485-492.

    [29]Scarlett A, Parsons M P, Hanson P L, et al. Thyroid hormone stimulation of extracellular signal-regulated kinase and cell proliferation in human osteoblast-like cells is initiated at integrin V 3[J]. Journal of Endocrinology, 2008,196(3):509-517.

    [30]Cohen K, Ellis M, Khoury S. Thyroid hormone is a MAPK dependent growth factor for human myeloma cells acting via αvβ3integrin [J]. Molecular Cancer Research, 2011,9:1385-1394.

    [31]Ashida R, Tominaga K, Sasaki E, et al. AP-1and colorectal cancer [J]. Inflammopharmacology, 2005,13:113-125.

    [32]Augustine A, Bj?rn M J. Differential organ expression patterns of thyroid hormone receptor isoform genes in p, p’-DDE-treated adult male common frog, Rana temporaria [J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2005,20:485—492.

    [33]Shi X Y, Liu C S, Wu G Q, et al. Waterborne exposure to PFOS causes disruption of the hypothalamus-pituitary-thyroid axis in zebrafish larvae [J]. Chemosphere, 2009,77:1010-1018.

    [34]Wu Y F, Koenig R J. Gene regulation by thyroid hormone [J].Trends in Endocrinology Metabolism, 2000,11:207-211.

    [35]邱志群.鄰苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞的聯(lián)合毒性研究 [D]. 重慶:第三軍醫(yī)大學(xué), 2008.

    [36]Cohen-Armon M. PARP-1activation in the ERK signaling pathway [J]. Trends in pharmacological sciences, 2007,28(11):556-560.

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