微流控技術(shù)在女性人乳頭瘤病毒感染篩查中的應(yīng)用

王生余

（江蘇省第二中醫(yī)院/南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210017）

人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持續(xù)感染是女性宮頸癌發(fā)生的最主要的病因，并且1996年世界衛(wèi)生組織（world health orgnization，WHO）將HPV確認(rèn)為引發(fā)宮頸癌的根本性治病因子[1]，因此在女性宮頸癌篩查中有必要進(jìn)行HPV常規(guī)檢測。HPV亞型種類較多，并且研究表明不同型別的HPV亞型與宮頸癌的相關(guān)程度不一致。業(yè)界將HPV亞型劃分為高危型和低危型兩大類幾十種亞型，同時(shí)對這些HPV亞型進(jìn)行檢測不啻是一項(xiàng)繁瑣的工作，我們采用以微流控技術(shù)為核心的芯片平臺對南京地區(qū)女性患者HPV的感染狀況進(jìn)行檢測，以期提供一種快速且生物安全性高的HPV分型檢測手段。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

2017年2月～2018年2月江蘇省第二中醫(yī)院婦科門診和住院女性患者中自愿接受陰道HPV感染篩查的，共計(jì)2010例。

1.2 儀器和試劑

人乳頭瘤病毒核酸檢測試劑盒I、II（生物芯片法）和BHF-VI核酸芯片檢測儀（北京博暉創(chuàng)新光電技術(shù)股份有限公司）。

標(biāo)本采集和處理HPV檢測標(biāo)本由婦科醫(yī)生按照采樣步驟和要求，采集標(biāo)本保存于專用保存管內(nèi)（江蘇健有醫(yī)療科技有限公司）冷凍保存待檢。

1.3 HPV分型檢測步驟

按儀器使用說明進(jìn)行操作，將不同試劑擺放至正確位置，將解凍后樣本混勻，取樣加入芯片上的樣品孔內(nèi)，按“start”開始運(yùn)行。芯片點(diǎn)樣陣列為4×8，計(jì)32點(diǎn)（說明見圖1A）。結(jié)果判讀分高危型18種（含16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、83型）和6種低危型（含6、11、42、43、44、81型）。≧2個(gè)型別者為多重感染。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPV亞型檢測結(jié)果

微流控技術(shù)平臺能夠有效地對HPV亞型檢出，具體檢出見圖1所示。

圖1 微流控技術(shù)應(yīng)用于HPV篩查檢測結(jié)果圖

圖1A中1、2、3分別為3個(gè)不同濃度的內(nèi)參質(zhì)控探針?biāo)谖恢茫?、5、6為重復(fù)的三個(gè)顯色質(zhì)控探針?biāo)谖恢茫?號左邊為空白對照探針位，8號左邊為陰性對照探針位。A圖所對應(yīng)檢測樣本為HPV感染陰性標(biāo)本；B圖所對應(yīng)檢測樣本為HPV多重感染陽性標(biāo)本，除前述內(nèi)參、顯色質(zhì)控探針位置外，其余著色點(diǎn)皆為HPV亞型陽性雜交陽性半點(diǎn)（HPV42、16、18、51、52、56和58亞型）。

2.2 HPV感染分布

本文中所用芯片涵蓋的24種HPV 亞型均有檢出。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，HPV感染陽性率為29.3%，單一HPV亞型感染陽性率為18.2，多重HPV亞型感染陽性率為10.8%。

2.3 微流控技術(shù)檢測HPV

目前進(jìn)行HPV感染檢測的步驟不外乎分三步走，第一步提取靶DNA，第二步擴(kuò)增，第三步核酸雜交。在操作過程中，既有對工作環(huán)境的要求，亦有對操作人員的要求。操作人員必須經(jīng)PCR流程嚴(yán)格培訓(xùn)合格方可進(jìn)行操作；不同操作人員手法有所差異，導(dǎo)致最后檢測結(jié)果的重復(fù)性存在出入；整個(gè)操作過程繁瑣和費(fèi)時(shí)總所周知。另外，PCR流程對環(huán)境等硬件設(shè)施亦有嚴(yán)格的要求，多數(shù)基層醫(yī)院不具備這樣的條件。本報(bào)告中所述微流控芯片檢測平臺檢測HPV只需加樣和等待4個(gè)半小時(shí)左右即可完成。

微流控技術(shù)是以分析生物化學(xué)為基礎(chǔ)，將微機(jī)電加工技術(shù)作為依托，以微管道網(wǎng)絡(luò)作為結(jié)構(gòu)特征，將各工作單元獨(dú)立完成其單一反應(yīng)或單元操作，同時(shí)又能完成相對復(fù)雜的工作，使一個(gè)由分離、檢測、化學(xué)反應(yīng)等過程組成的動態(tài)系統(tǒng)，濃縮于只有幾平方厘米密閉的芯片系統(tǒng)[2]。結(jié)合微流控技術(shù)的諸多優(yōu)點(diǎn)[3]，在HPV的檢測上完全可以由微流控技術(shù)為核心的芯片實(shí)驗(yàn)室完成，不僅滿足傳統(tǒng)PCR實(shí)驗(yàn)室的要求，并且對操作人員的要求亦相對簡單得多。由此可見，以微流控技術(shù)為核心的芯片檢測平臺相比大型實(shí)驗(yàn)室具有尺寸規(guī)模小、檢測靈活性高等優(yōu)勢，檢測設(shè)備投入試劑和樣品的使用也明顯減少，同時(shí)操作簡便、速度更快、經(jīng)濟(jì)適用，特別適用于缺少昂貴檢驗(yàn)設(shè)備的基層醫(yī)療單位和偏遠(yuǎn)地區(qū)。

[1] 郎景和.子宮頸癌病變防治的幾個(gè)問題[J].世界醫(yī)學(xué)雜志,2004,8(11):1-3.

[2] 吳李剛,周武平,蔣克明,等.基于離心微流技術(shù)的陣列化檢測芯片[J].微納電子技術(shù),2016,53(10):658-662.

[3] 邢志芳,呂攀攀和曹國軍.基于微流控技術(shù)的分子診斷[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2017,38(16):2252-2255.