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    刀孢蠟蚧菌ZJLP09液體發(fā)酵工藝的研究

    2018-06-25 08:36:14鹿連明杜丹超胡秀榮蒲占湑張利平黃振東陳國慶浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所浙江臺州318020
    浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年6期
    關(guān)鍵詞:孢量木虱分生孢子

    鹿連明,杜丹超,胡秀榮,蒲占湑,張利平,黃振東,陳國慶(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 柑橘研究所,浙江 臺州 318020)

    柑橘木虱、蚜蟲等是柑橘上的重要害蟲,目前對于這些害蟲的防治仍以吡蟲啉、噻嗪酮、毒死蜱等化學(xué)農(nóng)藥為主,然而化學(xué)農(nóng)藥的頻繁使用帶來的3R(抗性、再增猖獗和殘留)問題日趨嚴重。而生物農(nóng)藥因具有無殘留、特異性強、不殺傷害蟲天敵及有益生物、不易產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境相容性好、生產(chǎn)工藝簡單等特點越來越引起人們的重視。

    在利用生防菌防治柑橘木虱、蚜蟲等害蟲的研究方面,國內(nèi)外學(xué)者相繼開展了一些有益的探索。其中已報道的對柑橘木虱具致病力的真菌有玫煙色擬青霉、白僵菌、檬型被毛孢、宛式擬青霉等[1-5]。已報道的對橘蚜等柑橘蚜蟲有致病力的真菌有磚紅鐮孢菌、弗雷生蟲霉菌、蚜蟲霉菌等[5-9]。但目前研究多集中在實驗室探索階段,市場上尚無商品化的微生物農(nóng)藥產(chǎn)品可供使用。

    刀孢蠟蚧菌ZJLP09為本實驗室從浙江臺州地區(qū)橘園內(nèi)的柑橘木虱蟲體上分離篩選出的1株蟲生真菌[10],經(jīng)致病性測定,確定該菌株對柑橘木虱和蚜蟲具有強致病力,且其對高溫、低溫、低濕和紫外線等具有更高的抗逆性[11]。為此,本研究通過培養(yǎng)基、溫度、pH等條件的優(yōu)化,建立了一套穩(wěn)定的適于刀孢蠟蚧菌ZJLP09的液體發(fā)酵工藝,以期為進一步開發(fā)該菌株的生防菌制劑提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試菌株

    供試菌株刀孢蠟蚧菌ZJLP09為本實驗室從浙江臺州地區(qū)橘園內(nèi)的柑橘木虱蟲體上分離,接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基(PDA,配方為:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL,自然pH值)上,于4 ℃冰箱保存。

    1.2 發(fā)酵培養(yǎng)

    制備PDA培養(yǎng)基平板,在超凈工作臺中以無菌接種針挑取斜面上保存的刀孢蠟蚧菌ZJLP09菌塊,接種至PDA平板上,之后置于微生物培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。以無菌打孔器在菌落四周打取菌餅,接種至馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)中,在28 ℃恒溫搖床下以轉(zhuǎn)速180 r·min-1震蕩培養(yǎng)3 d。

    1.3 培養(yǎng)基的篩選

    取上述培養(yǎng)的刀孢蠟蚧菌ZJLP09的分生孢子懸浮液,按1%的比例接種到各供試培養(yǎng)基中(表1),置于28 ℃恒溫搖床下以轉(zhuǎn)速180 r·min-1震蕩培養(yǎng),培養(yǎng)不同時間后取樣,用血球計數(shù)板統(tǒng)計孢子數(shù)量, 計算各培養(yǎng)基中菌株ZJLP09的產(chǎn)孢量。

    1.4 初始接種量的篩選

    取刀孢蠟蚧菌ZJLP09分生孢子懸浮液,按l%、3%、5%、10%和20%的比例(V/V)分別接入裝有培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中(接種后共100 mL),每處理設(shè)3個重復(fù)。置于28 ℃恒溫搖床中以轉(zhuǎn)速180 r·min-1的條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)不同時間后取樣,用血球計數(shù)板法計算孢子濃度,重復(fù)測定3次,取平均值換算成產(chǎn)孢量。

    表1 液體搖床培養(yǎng)基及配方

    1.5 裝液量的篩選

    在250 mL三角瓶中分別裝入20%、40%、60%、80%的培養(yǎng)液,121 ℃滅菌20 min后,在無菌條件下接入分生孢子懸浮液,接菌量為5%,每處理設(shè)3個重復(fù)。置于28 ℃恒溫搖床中以轉(zhuǎn)速180 r·min-1的條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)不同時間后取樣,用血球計數(shù)板法計算孢子濃度,重復(fù)測定3次,取平均值換算成產(chǎn)孢量。

    1.6 初始pH值的篩選

    在250 mL三角瓶中分別裝入40%的培養(yǎng)液,將pH分別調(diào)至4.0、6.0、8.0、10.0,21 ℃滅菌20 min后,在無菌條件下接入分生孢子懸浮液,接菌量為5%,每處理設(shè)3個重復(fù)。置于28 ℃恒溫搖床中以轉(zhuǎn)速180 r·min-1的條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)不同時間后取樣,用血球計數(shù)板法計算孢子濃度,重復(fù)測定3次,取平均值換算成產(chǎn)孢量。

    1.7 震蕩轉(zhuǎn)速的篩選

    在250 mL三角瓶中分別裝入40%的培養(yǎng)液,將pH調(diào)至6.0,接菌量為5%,每處理設(shè)3個重復(fù)。置于恒溫搖床中,28 ℃下分別以100、150、180、200、220 r·min-1連續(xù)振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)不同時間后取樣,用血球計數(shù)板法計算孢子濃度,重復(fù)測定3次,取平均值換算成產(chǎn)孢量。

    1.8 培養(yǎng)時間的篩選

    在250 mL三角瓶中分別裝入40%的培養(yǎng)液,將pH調(diào)至6.0,接菌量為5%,每處理設(shè)3個重復(fù)。置于恒溫搖床中,28 ℃下以180 r·min-1連續(xù)振蕩培養(yǎng)6 d。每隔24 h從各三角瓶中取培養(yǎng)液,用血球計數(shù)板法計算孢子濃度,重復(fù)測定3次,取平均值換算成產(chǎn)孢量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 培養(yǎng)基的確定

    由表2可知,菌株ZJLP09在不同液體培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量存在明顯差異。培養(yǎng)3 d后,在沙氏葡萄糖酵母培養(yǎng)基(編號D)中的產(chǎn)孢量最高,含孢量為4.20×108個·mL-1;其次為麥麩培養(yǎng)液(編號J)和馬鈴薯葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(編號B),含孢量分別為3.25×108個和3.15×108個·mL-1;而察氏培養(yǎng)基(編號E)和玉米粉培養(yǎng)液(編號K)產(chǎn)孢量最低,分別僅為3.50×105個和4.00×105個·mL-1。隨著培養(yǎng)時間的延長,菌株ZJLP09在多數(shù)培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量均明顯上升,其在沙氏葡萄糖酵母培養(yǎng)基(編號D)中的產(chǎn)孢量更增加為1.27×109個·mL-1,為所有供試培養(yǎng)基中最高;但其在小米浸液培養(yǎng)基(編號L)和大豆粉玉米粉培養(yǎng)基(編號O)中的產(chǎn)孢量表現(xiàn)為下降,在玉米粉麥麩培養(yǎng)液(編號I)中更難以看到孢子的存在,多生長為菌絲。據(jù)此,篩選出適于刀孢蠟蚧菌ZJLP09產(chǎn)孢的最佳液體培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖酵母培養(yǎng)基。

    表2 菌株ZJLP09在不同液體培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時間后的產(chǎn)孢量

    注:同列數(shù)字后不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。表3~7同。

    2.2 初始接種量的確定

    在不同接種量條件下,菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量如表3所示。

    表3 在不同接種量條件下菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量

    由表3可知,接種量越大,菌株ZJLP09達到產(chǎn)孢高峰的時間越短。其中培養(yǎng)3 d,20%的接種量條件下菌株產(chǎn)孢量可達5.22×109個·mL-1,而1%接種量條件下菌株產(chǎn)孢量僅為4.35×108個·mL-1。隨著培養(yǎng)時間的延長,1%~5%接種量條件下菌株的產(chǎn)孢量明顯增加,其中5%接種量條件下在培養(yǎng)7 d后的產(chǎn)孢量可達5.35×109個·mL-1,而此時10%和20%接種量條件下的產(chǎn)孢量已表現(xiàn)下降趨勢。究其原因,同一液體培養(yǎng)基下,在通氣量等條件一致的情況下,接種量越大,孢子濃度越容易先達到最大。在工業(yè)化生產(chǎn)中,為了節(jié)約動力消耗,可以增加接種量;為了節(jié)約接種量,需增加動力消耗。綜合考慮兩個因素,可選用5%的接種量用于刀孢蠟蚧菌ZJLP09的發(fā)酵。

    2.3 裝液量的確定

    在不同裝液量條件下菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量如表4所示。

    表4 不同裝液量條件下菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量

    由表4可知,培養(yǎng)相同時間,裝液量越少,菌株ZJLP09產(chǎn)孢量越多。在培養(yǎng)3 d和20%裝液量條件下,菌株ZJLP09的產(chǎn)孢量可達3.20×109個·mL-1,而80%裝液量條件下,菌株的產(chǎn)孢量僅為8.25×108個·mL-1。說明菌株ZJLP09為好氧型菌株,增加通氣量(即減少裝液量)有利于增加菌株產(chǎn)孢。綜合考慮材料利用率和產(chǎn)孢總量,可選用40%的裝液量用于刀孢蠟蚧菌ZJLP09的發(fā)酵。

    2.4 初始pH值的確定

    在不同pH條件下菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量如表5所示。

    表5 不同pH條件下菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量

    由表5可知,菌株ZJLP09在不同pH的相同培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量差異明顯,過酸和過堿都不利于菌株產(chǎn)孢。在pH值5.0~7.0條件下,菌株ZJLP09的產(chǎn)孢量明顯高于其他pH條件下,在pH值6.0條件下培養(yǎng)3 d,菌株ZJLP09的產(chǎn)孢量為1.70×109個·mL-1,培養(yǎng)7 d,其產(chǎn)孢量可達5.35×109個·mL-1,而在pH值3.0和pH值10.0條件下培養(yǎng)3 d的產(chǎn)孢量僅為1.20×108個和8.85×107個·mL-1。因此,可選用培養(yǎng)基初始pH值6.0用于刀孢蠟蚧菌ZJLP09的發(fā)酵。

    2.5 震蕩轉(zhuǎn)速的確定

    在不同轉(zhuǎn)速條件下菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量如表6所示。

    表6 不同轉(zhuǎn)速條件下菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量

    由表6可知,轉(zhuǎn)速越快,菌株ZJLP09達到產(chǎn)孢高峰所需時間越短。在培養(yǎng)3 d及220 r·min-1轉(zhuǎn)速條件下,菌株產(chǎn)孢量為2.35×109個·mL-1;而在100 r·min-1轉(zhuǎn)速條件下,菌株產(chǎn)孢量僅為7.20×108個·mL-1,在180和200 r·min-1條件下,產(chǎn)孢量無顯著差異。綜合考慮產(chǎn)孢量和能量消耗等因素,可選用搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1用于刀孢蠟蚧菌ZJLP09的發(fā)酵。

    2.6 培養(yǎng)時間的確定

    不同培養(yǎng)時間后菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量如表7所示。

    表7 不同培養(yǎng)時間菌株ZJLP09在SDY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量

    由表7可知,菌株ZJLP09隨震蕩培養(yǎng)時間的延長,呈現(xiàn)先增加再飽和后衰減的趨勢。其中培養(yǎng)前5 d菌株的產(chǎn)孢量一直呈遞增趨勢,至培養(yǎng)第5天產(chǎn)孢量可達5.35×109個·mL-1,與培養(yǎng)第6、7和8天后的產(chǎn)孢量無顯著差異,8 d之后菌株產(chǎn)孢量開始下降。因此,可選用培養(yǎng)時間為5 d用于刀孢蠟蚧菌ZJLP09的發(fā)酵。

    3 小結(jié)與討論

    刀孢蠟蚧菌ZJLP09為從浙江臺州地區(qū)橘園內(nèi)的柑橘木虱蟲體上分離獲得的1株蟲生真菌,該菌株對柑橘木虱和蚜蟲具有強致病力,且對高溫、低溫、低濕和紫外線等具有更高的抗逆性,表現(xiàn)出良好的開發(fā)利用前景。本研究通過對培養(yǎng)基、初始接種量、裝液量、pH值、震蕩轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)時間等方面的篩選優(yōu)化,確定了刀孢蠟蚧菌ZJLP09產(chǎn)孢所需的最佳條件,建立了一套刀孢蠟蚧菌ZJLP09的液體發(fā)酵工藝,具體為:初始接種量5%、搖瓶裝液量40%~60%,初始pH值5.0~7.0、震蕩轉(zhuǎn)速180~220 r·min-1、培養(yǎng)溫度28 ℃、培養(yǎng)時間5 d。

    生防菌通常被開發(fā)為分生孢子可濕性粉劑等制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用,而制劑研制的前提即為制備獲得大量高純度的分生孢子。本研究建立的液體發(fā)酵工藝,可獲得大量的分生孢子,這為今后刀孢蠟蚧菌ZJLP09分生孢子制劑的研制提供了良好的依據(jù)。

    參考文獻:

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