DTI quantitative evaluation of functional changes after acute traumatic spinal cord injury in rats

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(1.Department of Radiology, 2.Department of Hyperbaric Oxygen Chamber, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China)

創(chuàng)傷性脊髓損傷(traumatic spinal cord injury, TSCI)的致死率及致殘率較高，并常導致神經(jīng)功能障礙[1]，早期診斷和治療與預后密切相關。DTI可無創(chuàng)反映脊髓的病理生理改變，能早期發(fā)現(xiàn)病灶、量化損傷程度并輔助評估遠期功能預后，可較常規(guī)MRI提供更多的診斷和功能信息[2-4]。本研究采用改良Allen打擊法制備不同程度急性TSCI大鼠模型，分析DTI參數(shù)與不同程度TSCI后神經(jīng)功能改變的相關性，旨在尋找最佳治療時間窗，為臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取清潔級成年雌性SD大鼠30只，周齡6～8周，體質(zhì)量180～200 g，由福建醫(yī)科大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(閩)2016-0002。將大鼠隨機分為輕度、中度或重度損傷組，每組各10只。

1.2 建立大鼠急性TSCI模型 腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg體質(zhì)量麻醉大鼠后，將其俯臥保定于實驗操作臺，無菌條件下以T10椎體為中心作矢狀切口，暴露T9～T11椎板及棘突，去除T10椎板，暴露硬脊膜。將大鼠固定于NYU脊髓損傷打擊器，使用直徑2.5 mm、重量10 g的撞擊棒從不同高度(輕度損傷組12.5 mm，中度損傷組25.0 mm，重度損傷組50.0 mm)自由落下撞擊脊髓，從墜落到抬起撞擊棒持續(xù)時間為10 s。建模成功后壓迫止血，并縫合皮膚及皮下組織。

1.3 檢查方法 采用Siemens Magnetom Skyra 3.0T超導MR掃描儀，3.0T大鼠線圈(CG-MUC18-H300-AS，上海辰光醫(yī)療科技股份有限公司)，分別于損傷前、損傷后即刻、6 h、24 h、3天、7天及14天對大鼠行常規(guī)MR及DTI檢查。將大鼠俯臥位保定于線圈內(nèi)，以脊髓損傷處為掃描中心，掃描序列如下：軸位DTI采用讀出方向分段采樣技術(readout segmentation of long variable echo-trains, RESOLVE)擴散序列，梯度場方向為20個，b值=0、800 s/mm2，F(xiàn)OV 162 mm×81 mm，矩陣168×168，層厚2.0 mm，層間距0.2 mm；軸位T2WI，TR 3 510 ms，TE 80 ms，F(xiàn)OV 162 mm×81 mm，矩陣192×192，層厚2.0 mm，層間距0.2 mm；矢狀位T1WI，TR 628 ms，TE 12 ms，F(xiàn)OV 55 mm× 55 mm，矩陣256×256，層厚 1.5 mm，層間距0.1 mm；矢狀位T2WI，TR 2 070 ms，TE 79 ms，F(xiàn)OV 55 mm×55 mm，矩陣256×256，層厚1.5 mm，層間距0.1 mm。

1.4 圖像處理 將DTI數(shù)據(jù)傳送至Siemens Syngo.via VB10B后處理工作站，由2名主治醫(yī)師共同對照軸位T2WI，于脊髓損傷中心手動勾畫ROI，盡量包括病灶并避開腦脊液和出血區(qū)域，測量FA、平均擴散率(mean diffusion， MD)、徑向擴散率(radial diffusion， RD)及軸向擴散率(axial diffusion， AD)。所有數(shù)據(jù)各測量3次，并取其平均值。以病灶ROI為種子點，重建擴散張量纖維束成像(diffusion tensor tractography， DTT)圖。

1.5 行為學評價 在MRI檢查結束后的各個時間點，由2名研究人員以盲法采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)法[5]對大鼠運動功能進行評分，并取其平均值。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料用±s表示。以多因素方差分析比較輕、中、重度損傷組間和TSCI后不同時間點DTI參數(shù)及BBB評分的差異，兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以Pearson線性相關分析評估BBB評分與各參數(shù)值間的相關性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 常規(guī)MRI表現(xiàn) 12只急性TSCI大鼠表現(xiàn)為出血型，脊髓中央大范圍低信號，伴周邊環(huán)狀小范圍高信號出血區(qū)(輕度損傷組3只，中度組4只，重度組5只)；7只表現(xiàn)為水腫型，損傷區(qū)中央及周圍見高信號水腫區(qū)(輕度組4只，中度組2只，重度組1只)，11只表現(xiàn)為挫傷型，中央小范圍低信號伴周邊大范圍高信號的挫傷區(qū)(輕度組3只，中度組4只，重度組4只)。損傷后7天，脊髓水腫基本消失，挫傷范圍逐漸縮小，傷后7～10天脊髓內(nèi)軟化灶形成，或伴有不同程度萎縮(圖1)。

2.2 DTI參數(shù) 不同程度急性TSCI大鼠損傷區(qū)脊髓均出現(xiàn)神經(jīng)纖維束中斷及破壞(圖2)。輕、中、重度損傷組間和TSCI后不同時間點間FA、MD及RD值差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；TSCI后不同時間點間AD值差異有統(tǒng)計學意義(F=12.720，P<0.001)，而輕、中、重度損傷組間AD值差異無統(tǒng)計學意義(F=0.469，P=0.630)。大鼠TSCI即刻FA、MD值減低，RD值升高，之后FA值持續(xù)降低，MD和RD值持續(xù)升高，損傷前與損傷后即刻、損傷后即刻與6 h、6 h與24 h間差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，至24 h后趨于穩(wěn)定，損傷后24 h與3天、3天與7天及7天與14天間差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；AD值在TSCI即刻降低，損傷前與損傷后即刻差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，之后各時間點差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；見表1～4。

表1 各組TSCI大鼠脊髓損傷前及損傷后不同時間點FA值(±s)

表1 各組TSCI大鼠脊髓損傷前及損傷后不同時間點FA值(±s)

組別損傷前損傷后即刻6 h24 h3天7天14天重度損傷組0.62±0.010.38±0.010.37±0.040.34±0.040.34±0.020.34±0.030.34±0.02中度損傷組0.61±0.030.41±0.060.38±0.040.36±0.020.35±0.030.36±0.030.36±0.02輕度損傷組0.61±0.010.43±0.020.40±0.020.37±0.030.35±0.030.36±0.040.36±0.02

表2 各組TSCI大鼠脊髓損傷前及損傷后不同時間點MD值(×10-3 mm2/s，±s)

表2 各組TSCI大鼠脊髓損傷前及損傷后不同時間點MD值(×10-3 mm2/s，±s)

組別損傷前損傷后即刻6 h24 h3天7天14天重度損傷組1.20±0.211.00±0.101.11±0.241.22±0.291.33±0.141.37±0.301.42±0.26中度損傷組1.24±0.221.14±0.231.27±0.341.33±0.161.38±0.151.44±0.261.52±0.18輕度損傷組1.31±0.151.17±0.221.28±0.131.40±0.181.44±0.181.53±0.101.59±0.02

圖1 重度損傷組TSCI大鼠MRI A.損傷即刻T2WI示脊髓內(nèi)低信號區(qū)，周圍環(huán)繞高信號； B～D.損傷后6 h(B)、24 h(C)和3天(D)T2WI示脊髓內(nèi)出血范圍較前增大，周圍高信號范圍縮??； E.損傷7天脊髓內(nèi)見軟化灶形成 圖2 重度損傷組TSCI大鼠DTT圖像 損傷后即刻(A)、6 h(B)、24 h(C)、3天(D)和7天(E)脊髓神經(jīng)纖維束中斷、破壞

組別損傷前損傷后即刻6 h24 h3天7天14天重度損傷組1.91±0.231.74±0.201.82±0.241.77±0.281.76±0.181.91±0.301.95±0.21中度損傷組2.08±0.161.64±0.261.84±0.241.70±0.251.66±0.231.85±0.232.06±0.13輕度損傷組1.91±0.191.78±0.131.63±0.101.80±0.101.90±0.101.97±0.112.00±0.13

表4 各組TSCI大鼠脊髓損傷前及損傷后不同時間點RD值(×10-3 mm2/s，±s)

表4 各組TSCI大鼠脊髓損傷前及損傷后不同時間點RD值(×10-3 mm2/s，±s)

組別損傷前損傷后即刻6 h24 h3天7天14天重度損傷組0.86±0.101.04±0.231.11±0.231.20±0.371.25±0.211.18±0.321.18±0.22中度損傷組0.75±0.150.94±0.111.06±0.331.20±0.101.10±0.101.10±0.101.10±0.10輕度損傷組0.82±0.140.92±0.171.04±0.151.0±0.011.13±0.171.11±0.161.05±0.07

圖3 輕、中、重度損傷組TSCI大鼠損傷后各時間點BBB評分

2.3 BBB評分 不同損傷組間及TSCI后各個時間點間大鼠BBB評分差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。輕、中、重度損傷組中，損傷前BBB評分均為21分，TSCI后即刻評分降至最低點，之后持續(xù)上升，各時間點間評分差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05，圖3)。

2.4 相關性分析 BBB評分與MD、AD值呈正相關(r=0.958、0.695，P均<0.001)，與FA值呈負相關(r=-0.433，P=0.008)，與RD值無相關(r=0.232，P>0.05)。

3 討論

TSCI后脊髓的病理生理狀況呈動態(tài)變化，除直接損傷外，血脊髓屏障滲透性改變、微灌注紊亂及持續(xù)性軸突去極化等一系列改變亦可造成脊髓繼發(fā)性損傷，導致神經(jīng)功能障礙[6-7]。目前，常規(guī)MRI是脊髓損傷的首選影像學檢查方法[8]，可清晰顯示受損脊髓內(nèi)的挫傷、出血及水腫等，但在早期發(fā)現(xiàn)病灶及評估神經(jīng)功能狀態(tài)方面仍有局限性。DTI是在DWI基礎上發(fā)展而來的成像技術，通過量化水分子擴散的各向異性來反映組織微觀結構，現(xiàn)已被廣泛用于定量評價創(chuàng)傷后神經(jīng)纖維束的改變[9-10]。

本研究在TSCI后各時間點測量不同損傷程度大鼠的DTI參數(shù)，結果表明脊髓損傷即刻FA、MD及AD值減低，RD值升高。在脊髓神經(jīng)纖維束中，水分子受到髓鞘和細胞膜的限制，主要以平行于長軸的方向擴散；當TSCI造成原本縱向排列的神經(jīng)纖維束中斷，細胞骨架崩解及快速轉(zhuǎn)運功能喪失引起細胞器的障礙，可導致水分子擴散的各向異性減低，使得反映各向異性所占比重的FA值及平行于長軸方向擴散系數(shù)的AD值下降[11]；RD值升高的原因可能在于膠質(zhì)細胞凋亡、髓鞘脫失及血管源性水腫引起細胞外水分子數(shù)目增加[7,12]。本研究結果顯示，大鼠TSCI早期FA值隨時間而繼續(xù)降低，而MD及RD值持續(xù)升高則可能是血管源性水腫所致。FA、MD及RD值均于損傷后24 h時趨于穩(wěn)定，提示損傷后24 h的DTI參數(shù)值能較準確地反映軸索損傷及細胞壞死，可作為影像學檢查的最佳時間點，與Li等[13]的研究結果類似。

本研究對TSCI后各時間點大鼠進行BBB評分評估脊髓功能，結果顯示，在損傷即刻，因大鼠脊髓休克致正常神經(jīng)元活動受到破壞，各損傷組BBB評分均明顯下降，表現(xiàn)為后肢軟癱(19/30)或部分有輕微關節(jié)運動(11/30)；但傷后6 h大鼠BBB評分即可出現(xiàn)回升，部分輕度損傷組大鼠此時后肢關節(jié)活動功能可完全恢復(4/10)，而重度組恢復速率相對較慢，2周時多數(shù)大鼠尚無爪掌面支撐移動(6/10)。盡管大鼠在非治療情況下可出現(xiàn)自發(fā)性運動功能恢復，但打擊程度增加導致?lián)p傷脊髓白質(zhì)殘余量較少[14]，可能是造成重度損傷組恢復速率緩慢及功能恢復不完全的原因。

既往研究[12,15]認為FA值在反映病變及脊髓功能遠期預后方面敏感度最佳，但本研究結果表明MD值與大鼠的BBB評分相關性(r=0.958)更好，提示MD值更適宜作為定量評估急性脊髓損傷后功能評估的指標。此外，Zhao等[15]認為損傷后1～3天為病理生理改變的關鍵時期，而本研究中MD值于大鼠損傷后24 h即保持相對穩(wěn)定，原因可能為脊髓繼發(fā)性損傷及自發(fā)性恢復同時存在，推測損傷后1天內(nèi)進行早期治療，或有助于減少繼發(fā)性脊髓損傷，保護殘余神經(jīng)功能。

綜上所述，DTI特征性參數(shù)在動態(tài)評價不同程度大鼠急性TSCI后脊髓功能中具有重要價值；MD值能較好地量化急性脊髓損傷后神經(jīng)功能狀態(tài)的變化，且推測損傷后1天內(nèi)可作為TSCI臨床早期干預的最佳時間窗。但本實驗未能與脊髓組織病理學變化進行對照，且大鼠創(chuàng)傷模型雖然接近于人類TSCI的發(fā)生過程，并具有較好的臨床相關性，但仍需大樣本臨床試驗進一步加以驗證。

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