布拉酵母體外抑菌效果初步研究

趙寶頂 宋平 張怡 劉敬為 喬璐 童應凱

摘 要：本文通過對布拉酵母分別在YEPD培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、混合培養(yǎng)基（YEPD+肉湯）中與3種菌（大腸桿菌，藤黃八疊球菌，枯草芽孢桿菌）的混合培養(yǎng)，通過稀釋涂布、抑菌圈與液體發(fā)酵的方式來測定布拉酵母對于3種菌的抑菌性，結(jié)果顯示，布拉酵母在不同培養(yǎng)基中隊3種菌的抑菌效果不同，而抑菌圈實驗沒有出現(xiàn)抑菌圈，布拉酵母對不同菌的抑菌效果和生存環(huán)境有關。

關鍵詞：布拉酵母；抑菌性；混合培養(yǎng)基

中圖分類號：S816. 7 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20180233007

酵母菌也是在飼料中應用最早、最廣泛的微生物之一[1]。伴隨著生物的高速發(fā)展，酵母菌的研究與開發(fā)利用也在不斷深化，新發(fā)現(xiàn)的布拉酵母菌有促進腸道有益微生物的活性、抑制病原菌和促進腸黏膜免疫功能等作用[2]，布拉酵母菌（Saccharomyces boulardii）是益生菌的一種，它屬于釀酒酵母，布拉酵母菌具有促進腸道內(nèi)有益微生物的活性、中和腸道病原菌產(chǎn)生毒素的毒性、促進腸黏膜的免疫功能與降解病原菌毒素及腸黏膜毒素受體等作用，布拉酵母還擁有生物學優(yōu)勢，它可以耐高溫，在37℃環(huán)境中仍然生長良好，在耐酸性環(huán)境細胞存活率仍能達到75%[3]。

現(xiàn)在食品安全的問題受到人們重視，造成人們腸道疾病的的發(fā)病率越來越高[4]，抗生素的弊端越來越引起人們的重視，抗生素對于一些特異性體質(zhì)的人會產(chǎn)生過敏反應，嚴重時會導致死亡[5]。而布拉酵母菌作為一種益生菌，能構(gòu)建起抵抗病原體的第一道防線[6]。布拉氏酵母作為一種非病源酵母對抗生素相關的腹瀉和復發(fā)性艱難梭菌結(jié)腸炎具有保護作用，其機制與增強宿主腸道免疫應答有關[7]。布拉氏酵母菌還能夠促進腸道內(nèi)短鏈脂肪酸的活性，可以迅速地恢復腸道的正常生理功能[8]，另外，在酵母細胞還能夠作為飼料添加物，它含有豐富的氨基酸以及多種的維生素，這是動物生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)[9]。

大腸桿菌是人體與動物腸道內(nèi)最常見的一種菌類，大約占到腸道內(nèi)菌類的1%，大腸桿菌離開腸道后，會引起腹膜炎、膽囊炎、闌尾炎等，一些體質(zhì)偏弱的人極易感染，大腸桿菌還會進入血液，從而引起敗血癥[10]?？莶菅挎邨U菌自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，可以與體內(nèi)的其他酶共同作用，促進一些細胞的活性[11]。藤黃八疊球菌是一種條件致病菌，在特殊情況下才會對人體造成危害。

綜上所述，布拉酵母的研究性非常高，而且布拉酵母的體外抑菌效果尚很少有人研究，本實驗針對布拉酵母的抑菌性展開初步研究，通過布拉酵母與3種細菌的混合培養(yǎng)來了解布拉酵母的抑菌性，并且用抑菌圈實驗來研究布拉酵母抑菌的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

布拉酵母（Saccharomyces boulardii），大腸桿菌（Escherichia Coli），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），藤黃八疊球菌（sarcina lutea）均為天津農(nóng)學院生物技術系微生物實驗室保存菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

YEPD（酵母浸出粉胨葡萄糖）培養(yǎng)基（%）：酵母膏 1、蛋白胨2、葡萄糖2，在115℃高壓滅菌20min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（%）：牛肉膏0.5、蛋白胨1.0、氯化鈉0.5，pH7.2～7.4 121℃滅菌20min。

混合（YEPD：肉湯=1：1）培養(yǎng)基：121℃滅菌 20min。

1.2 種子液制備

在超凈工作臺中將布拉酵母菌用250mL三角瓶接入YEPD培養(yǎng)基中，放入30℃ 搖床中以180rpm培養(yǎng)18～24h，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

在超凈工作臺中將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、藤黃八疊球菌用250mL三角瓶接入肉湯培養(yǎng)基中，放入37℃搖床180rpm培養(yǎng)18～24h，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌種混合培養(yǎng)試驗

設置對照組，18個瓶子里每個瓶中分別添加5mL的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及藤黃八疊球菌，然后在每種培養(yǎng)基中取不同菌種各1瓶添加5mL的布拉酵母菌。

其余2個培養(yǎng)基的菌種添加同表1，添加后放至35℃搖床中，以200轉(zhuǎn)/min放置，養(yǎng)24h后涂布計數(shù)，并進行顯微鏡觀察。

1.4 抑菌圈試驗

1.4.1 培養(yǎng)基制備

配制600mL的肉湯培養(yǎng)基，高壓滅菌后在超凈工作臺中分于3個250mL三角瓶中，每個瓶中加200mL，待溫度于40～50℃時，加入3種細菌，每個三角瓶中加入4mL，每種培養(yǎng)基倒4個平板，共12個平板，等待凝固。

1.4.2 布拉酵母菌懸液處理

取布拉酵母菌懸液離心，清液和沉淀布拉酵母菌體，用生理鹽水多次沖洗離心沉淀布拉酵母菌體，得到布拉酵母菌體，取一部分布拉酵母菌體進行超聲波處理，破碎細胞，得到布拉酵母胞內(nèi)產(chǎn)物。

1.4.3 抑菌圈試驗

將凝固好的平板在超凈工作臺中打孔，平板中加入的因素如下表。

其余2種平板同上表2，添加后放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種混合培養(yǎng)試驗結(jié)果分析

由表3可知，在YEPD培養(yǎng)基中的單種大腸桿菌生長情況比較好，加入布拉酵母后大腸桿菌數(shù)量減少；單種枯草芽孢桿菌在10-6中生長情況良好，加入布拉酵母后數(shù)量明顯減少；單種藤黃八疊球菌生長情況都不好，加入布拉后數(shù)量有一定的增長。

由表4可知，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中的單種大腸桿菌生長情況非常好，加入布拉酵母后數(shù)量有一定的減少；而枯草芽孢桿菌和藤黃的生長都沒有收到明顯影響。

由表5可知，在混合培養(yǎng)基中的單種大腸桿菌生長情況良好，加入布拉酵母后受到明顯影響，數(shù)量明顯減少；枯草芽孢桿菌生長沒有影響，而藤黃八疊球菌在加入布拉酵母后受到明顯影響，數(shù)量減少。

由此可見，在YEPD培養(yǎng)基中布拉酵母菌對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有一定的抑制效果；在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中布拉酵母對枯草芽孢桿菌和藤黃八疊球菌沒有影響，而對大腸桿菌有輕微的抑制效果；在混合培養(yǎng)基中對大腸桿菌和藤黃八疊球菌都有明顯的抑制效果，因此，布拉酵母菌在特定的環(huán)境下對3種細菌有抑菌性，也可以促進一些細菌的生長，也可能是通過吸附病原菌的作用，將細菌吸附在周圍。

2.2 抑菌圈試驗結(jié)果分析

枯草芽孢桿菌平板的抑菌圈如圖1。

大腸桿菌平板的抑菌圈如圖2。

藤黃八疊球菌平板的抑菌圈如圖3。

由上圖觀察，并未發(fā)現(xiàn)抑菌圈，可以推測，布拉酵母自身或者代謝產(chǎn)物對細菌都沒有直接的抑制效果。

3 結(jié)論

混合培養(yǎng)試驗結(jié)果顯示，布拉酵母在一定環(huán)境下有抑制某些菌的生長，但抑菌圈試驗表明布拉酵母對細菌的抑制并不是直接的，其抑菌機理仍待進一步研究。

參考文獻

[1]李曉穎.布拉酵母的研究現(xiàn)狀[R].2013：3-25.

[2] Canani RB，Cucchiara S，Cuomo R，et al.Saccharomyces boulardii：a summary of the evidence for gastroenterology clinical practice in adults and children[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2011，15（7）：809-822.

[3] Badia R，Brufau MT，Guerrero-Zamora AM，et al.β–Galactomannan and Saccharomyces cerevisiae var.boulardii modulate the immune response against Salmonella enterica serovar typhimurium in porcine intestinal epithelialand dendriticcells[J].Clinical and Vaccine Immunology，2012，19（3）：368-376.

[4]楊新慶.便秘診治的若干問題[J].中國臨床醫(yī)生雜志，2007，35

（3）：9.

[5]孫云.他汀類藥物的臨床應用及不良反應[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學院學報，2006：S1.

[6]楚杰，張大偉，郝永任，等.布拉酵母菌對腸道菌群紊亂的調(diào)整作用研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2008，35（7）：87-89.

[7] Prevention of Further Recurrences of Clostridium difficile Colitis with Saccharomyces bourlardii[C].Digestive Diseases and Sciencse，1990：897-901.

[8] Badia R，Zanello G，Chevaleyre C，et al.Effect of Saccharomyces cerevisiaevar. boulardii and beta -galactomannan oligosaccharide on porcine intestinal epithelial and dendritic cells challenged in vitro with Escherichia coli F4（K88）[J].Veterinary Research，2012，doi：10.1186/1297-9716-43-4.

[9]貝氏.面包酵母的技術開發(fā)現(xiàn)狀[M].食品工業(yè)，1991（6）：35-38.

[10]霍清合.禽大腸桿菌病多發(fā)原因及防治[J].養(yǎng)禽與禽病防治，

2007（1）：4-5.

[11]郭小華，陸文清，鄧萍，等.益生枯草芽孢桿菌MA139增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國農(nóng)業(yè)大學學報，2006，11（3）：41-46.

作者簡介：童應凱，教授，天津農(nóng)學院農(nóng)學與資源環(huán)境學院生物技術系。