枳砧紅綿蜜柚嫁接黃化苗的光合特性及其CgSGR基因克隆與表達(dá)分析

何 文，王 燕，陳 清，徐世榮，湯浩茹，潘東明*，王小蓉

(1 福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院，福州 350002；2 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，成都 611130)

‘紅綿蜜柚’[Citrusgrandis(L.) Osbeck. cv. ‘Hongmian miyou’]屬于‘琯溪蜜柚’芽變選育出的優(yōu)良新品種(審定編號(hào)：閩認(rèn)果 2011008；川審果 2016016)。枳[Poncirustrifoliata(L.) Raf.]作為‘琯溪蜜柚’栽培用砧木，植株生長(zhǎng)結(jié)果良好，但在‘紅綿蜜柚’引種四川后發(fā)現(xiàn)，枳砧‘紅綿蜜柚’初期長(zhǎng)勢(shì)良好，但從嫁接當(dāng)年夏季開(kāi)始植株逐漸黃化，出現(xiàn)砧穗不親和現(xiàn)象，導(dǎo)致了巨大的經(jīng)濟(jì)損失；而將枳砧上已表現(xiàn)黃化的‘紅綿蜜柚’枝梢嫁接于香橙砧(C.junosSieb. ex Tanaka)上，可恢復(fù)正常生長(zhǎng)[1-2]。嫁接是柑橘植株進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖的主要方法[3]，‘紅綿蜜柚’嫁接枳砧不親和現(xiàn)象限制了其在生產(chǎn)上的推廣利用，因此針對(duì)枳砧‘紅綿蜜柚’幼苗黃化機(jī)理的研究具有重要意義。

光合作用是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)和干物質(zhì)積累的重要來(lái)源，葉片黃化將大大降低光合產(chǎn)物的積累，不同砧穗組合間光合特性差異的相關(guān)報(bào)道很多[4-6]，但針對(duì)砧穗不親和嫁接植株的光合特性研究少有報(bào)道[7]。葉綠素降解不僅發(fā)生在葉片衰老過(guò)程中，也發(fā)生在植物響應(yīng)生物或非生物脅迫過(guò)程中。植物體內(nèi)的葉綠素分子主要通過(guò)脂肪烴側(cè)鏈插入到葉綠體的類囊體膜中，這種復(fù)合體的解離是葉綠素降解的前提[8]。最近的研究表明，SGR基因(stay green)通過(guò)招募其他的葉綠素降解酶形成蛋白復(fù)合物，促使葉綠素分子從LHCⅡ(light-harvesting complexⅡ)上解離[9]，在維持葉綠素合成和分解的動(dòng)態(tài)平衡中起著重要的作用。一些研究表明，SGR1/NYE1(SGR1/Non-Yellowing1)不僅調(diào)控葉片中葉綠素的降解，也參與調(diào)控果實(shí)成熟過(guò)程中葉綠素的降解[10]，SGR1基因在色素合成與積累中也同樣具有重要作用[11]，番茄SISGR1基因直接與類胡蘿卜素合成關(guān)鍵酶SIPSY1發(fā)生互作，SISGR1下調(diào)表達(dá)可以改變SIPSY1的表達(dá)模式和類胡蘿卜素的積累[12]。

色澤突變體是目前柑橘中報(bào)道最多的突變體，為研究果實(shí)類胡蘿卜素的合成和調(diào)控提供了豐富的材料[13-14]，但這些突變體中除了發(fā)生色澤相關(guān)性狀的變異外，還可能伴隨著其他性狀的變化，柑橘色澤突變體中受色素代謝潛在影響的生物學(xué)過(guò)程目前研究極少[15-17]。‘紅綿蜜柚’芽變自‘琯溪蜜柚’，其海綿層呈淡紅色，但嫁接在枳砧上表現(xiàn)出截然不同的親和性，為研究砧穗不親和提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。課題組在多地多次對(duì)枳砧紅綿嫁接苗黃化現(xiàn)象觀察研究后，排除了土壤條件及病蟲(chóng)害因素。因此，本試驗(yàn)以枳砧‘紅綿蜜柚’為實(shí)驗(yàn)組，枳砧‘琯溪蜜柚’和香橙砧‘紅綿蜜柚’為對(duì)照組，測(cè)定其光合特性和葉綠素含量，克隆并分析蜜柚滯綠基因CgSGR在不同時(shí)期不同嫁接組合中的相對(duì)表達(dá)量，為揭示枳砧‘紅綿蜜柚’砧穗不親和的機(jī)理和在育種實(shí)踐上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2016年在四川省成都市蒲江縣四川農(nóng)業(yè)大學(xué)科研基地進(jìn)行，弱酸性土壤，常規(guī)田間管理。接穗為‘紅綿蜜柚’[C.grandis(L.) cv. Hongmian miyou]和‘琯溪蜜柚’[C.grandis(L.) cv. Guanxi miyou]，砧木為2年生枳殼(P.trifoliata)及蒲江香橙(C.junos)。嫁接組合為枳砧‘紅綿蜜柚’(Hm/Pt)、枳砧‘琯溪蜜柚’(Gx/Pt)以及香橙砧‘紅綿蜜柚’(Hm/Cj)共計(jì)3種砧穗組合(圖1)，每個(gè)組合100株，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。于2016年3月7日定植，并分別于嫁接后70 d(2016年5月16日)、98 d(2016年6月13日)、139 d(2016年7月24日)以及404 d(2017年5月14日)進(jìn)行樣品采集和數(shù)據(jù)測(cè)定。

1.2 方 法

1.2.1凈光合速率測(cè)定采用Li-6400便攜式光合作用測(cè)定儀于70、98、139以及404 TAG(嫁接后時(shí)間/天；Time after gratfing/d)，上午8:30～10:30于試驗(yàn)園中進(jìn)行，CO2壓縮鋼瓶緩釋控制系統(tǒng)內(nèi)CO2含量為400 mol·mol-1，LED紅藍(lán)光源控制光強(qiáng)為1 200 mol·m-2·s-1，凈光合速率(Pn)、光合有效輻射(PAR)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和細(xì)胞間隙CO2濃度(Ci)等參數(shù)由光合儀同步測(cè)定并記錄。每個(gè)砧穗組合選擇3株植株，每株選擇3片中部葉齡相同的健康功能葉，取平均值進(jìn)行分析。氣孔限制值(Ls)及水分利用率(WUE)計(jì)算公式為：Ls(%)=[1-Ci/Ca]×100；WUE=Pn/Tr。

1.2.2葉綠素a、b的提取測(cè)定采用丙酮和乙醇(2∶1)混合液為提取液，提取葉綠素a和葉綠素b。每個(gè)砧穗組合選擇3株植株，每株選擇3片健康功能葉。利用分光光度計(jì)，在663和645 nm處分別測(cè)定，再由丙酮法公式計(jì)算其含量：葉綠素a含量=[12.7A663-2.69A645] V/1 000×W；葉綠素b含量=[22.7A645-4.68A663] V/1 000×W；葉綠素總含量=[20.2A645+8.02A663] V/1 000×W。式中A663和A645分別為相應(yīng)波長(zhǎng)下的吸光度值，V為提取液的體積，W為葉片鮮重，葉綠素含量的單位為mg/g。

1.2.3總RNA提取及cDNA第一鏈合成采用改良CTAB法提取葉片總RNA[18]，用分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度及濃度。cDNA第一鏈的合成使用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4引物設(shè)計(jì)與合成以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Gene ID為102625350的基因CDS序列為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)克隆引物及qPCR引物(表1)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 本研究所用引物Table 1 The primers used in the study

1.2.5CgSGR的克隆與序列分析以‘紅綿蜜柚’和‘琯溪蜜柚’葉片cDNA為模板，利用PCR技術(shù)進(jìn)行CgSGR的克隆，20 L反應(yīng)體系包括10×TaqBuffer 2 L、dNTP Mix 2 L、CgSGR-F(10 mol·L-1)和CgSGR-R(10 mol·L-1)各0.5 L、TaqDNA聚合酶(5 U·L-1)0.2 L、模板cDNA(約200 ng·L-1)2 L和ddH2O 12.8 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并進(jìn)行目的條帶的回收，與pEasy-T1克隆載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)快速鑒定篩選出陽(yáng)性克隆并送公司測(cè)序。采用NCBI的Blast和DNAMAN對(duì)獲得的基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析。CgSGR的生物信息學(xué)分析，采用以下分析工具進(jìn)行：蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)的分析(ExPASy Protparam, http://web.expasy.org/protparam/)，信號(hào)肽預(yù)測(cè)(SignalP 4.1 Server, http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)(Wolf PSORT, http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/)，蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)(EMBnet TMpred, http:// www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)，磷酸位點(diǎn)預(yù)測(cè)(NetPhos 3.1 Server, http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)，蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)(InterProScan 5，http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan5/和NCBI-ProteinTools，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(Protein Structure Prediction Server，http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(SWISS-MODEL，http://swissmodel.expasy.org/)，分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建(Mega 5)。

1.2.6不同嫁接組合生長(zhǎng)發(fā)育期間的基因表達(dá)分析以Hm/Pt、Hm/Cj和Gx/Pt不同時(shí)期植株葉片cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、CgSGR-qF(10 μmol·L-1)和CgSGR-qR(10 μmol·L-1)各0.5 μL，cDNA(約150 ng·μL-1)1 μL和ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件為96 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；56 ℃ 15 s；72 ℃ 45 s，45個(gè)循環(huán)，以β-Tubulin作為參照基因(表1)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖，采用2-ΔΔCT相對(duì)定量分析方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，并用SPSS 22.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行方差、顯著性及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同砧穗組合間葉綠素含量的差異

葉綠素含量直接影響植株的光合能力，通過(guò)測(cè)定3個(gè)不同嫁接組合葉片葉綠素a、葉綠素b含量可知(圖2)，3個(gè)嫁接組合的葉綠素含量變化趨勢(shì)一致，其中Hm/Cj在嫁接后98 d時(shí)達(dá)到頂峰，高葉綠

圖2 不同砧穗組合葉片葉綠素含量的差異Fig.2 The difference of the chlorophyll content of leaves on three graft combinations

素含量明顯提高了葉片光合活性，從而增加光合產(chǎn)物。整個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期，Hm/Pt的葉綠素含量與對(duì)照組材料差異顯著，葉綠素含量變化趨勢(shì)與光合指標(biāo)變化趨勢(shì)基本一致。Hm/Pt的黃化苗(404 TAG)葉片葉綠素a/b與對(duì)照組無(wú)顯著差異，嫁接后98 d起，基本維持在3∶1(圖2，D)，表明Hm/Pt的嫁接不親和黃化屬于總?cè)~綠素虧缺型。

2.2 不同砧穗組合間光合特性的差異

3種砧穗組合葉片的凈光合速率(Pn)最大值均出現(xiàn)在嫁接后98 d(圖3，A)，Gx/Pt、Hm/Cj、Hm/Pt依次為9.20、8.62和6.57 μmol·m-2·s-1。此外，3種砧穗組合相比，Hm/Pt的Pn值在嫁接初期最大(2.52 μmol·m-2·s-1)，其他發(fā)育階段均表現(xiàn)出較低的凈光合速率。圖3，B顯示，3種砧穗組合的蒸騰速率變化存在較大差異。Gx/Pt在整個(gè)發(fā)育期間蒸騰速率都維持在較高水平，Hm/Pt的蒸騰速率均處于較低水平，與同一時(shí)段其氣孔開(kāi)張程度較小相對(duì)應(yīng)(圖3，C、D)，從而造成其較低的光合速率。從圖3，E可以看出，3種砧穗組合水分利用率在嫁接發(fā)育初期差異不顯著，在嫁接后404 d，其水分利用率差異顯著，并以Gx/PtWUE值最高，Hm/Pt的WUE最低，其變化趨勢(shì)及差異與葉肉瞬時(shí)羧化效率類似(圖3，F(xiàn))。

2.3 滯綠基因CgSGR的克隆及序列分析

以‘紅綿蜜柚’、‘琯溪蜜柚’cDNA為模板，進(jìn)行CgSGR基因的PCR擴(kuò)增(圖4)。切膠回收并克隆測(cè)序表明，兩者核酸序列不存在堿基變異位點(diǎn)，基因片段長(zhǎng)度為816 bp。該基因序列在GenBank中的登錄號(hào)為MF945620。

為研究CgSGR基因調(diào)控的SGR蛋白結(jié)構(gòu)及功能，采用ExPASy中的蛋白質(zhì)基本參數(shù)分析工具ProtParam對(duì)CgSGR蛋白基本參數(shù)進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明，CgSGR編碼堿性蛋白(pI=8.93)，具有親水性(GRAVY=-0.373)，且?guī)д姾砂被釘?shù)量(Arg+Lys)大于帶負(fù)電荷的氨基酸數(shù)量(Asp+Glu)；CgSGR屬于不穩(wěn)定蛋白。采用SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)表明CgSGR不含信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。根據(jù)TMHMM Server v. 2.0在線分析，CgSGR蛋白不具跨膜結(jié)構(gòu)。采用Wolf PSORT分析顯示CgSGR蛋白定位于葉綠體中。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，CgSGR蛋白共含有21個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸的磷酸化位點(diǎn)為15個(gè)，蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)分別為5個(gè)和1個(gè)。對(duì)CgSGR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，CgSGR蛋白無(wú)規(guī)則卷曲所占的比例最大，而α螺旋和β折疊所占比例相當(dāng)。在了解蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)論相符。利用NCBI-CD-Search工具進(jìn)行蛋白保守區(qū)域分析(圖5)，結(jié)果顯示CgSGR氨基酸序列中50～202區(qū)域與滯綠蛋白超家族的核心序列高度同源。此外，使用InterProScan 5工具分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，其結(jié)果與NCBI-CD-Search預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。

A.凈光合速率；B.蒸騰速率；C.氣孔導(dǎo)度；D.氣孔限制值；E.水分利用效率；F.葉肉羧化效率A. Net photosynthetic rate; B. Transpiration rate; C. Stomatal conductance; D. Stomatal limitation; E. Water use efficiency; F. Instantaneous carboxylation efficiency

Hm.紅綿蜜柚；Gx.琯溪蜜柚Hongmian miyou and Guanxi miyou were named as Hm and Gx, respectively.

將‘紅綿蜜柚’CgSGR序列與柑橘屬柚(C.grandis)、甜橙(C.sinensis)和克里曼丁橘(C.clemetina)SGR序列進(jìn)行多重比對(duì)，顯示出它們之間一致性較高，其中‘紅綿蜜柚’與柚無(wú)堿基差異，與甜橙在第33 bp處有1個(gè)變異位點(diǎn)，與克里曼丁橘在33、52、118、159、622和765 bp處有6個(gè)變異位點(diǎn)(表2)。為了解‘紅綿蜜柚’CgSGR與其他植物SGR的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 5.0軟件建立不同植物的SGR核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖6)，表明CgSGR與柑橘屬甜橙、克里曼丁橘的距離最近，與荔枝關(guān)系較近，與其他物種的關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖6 不同植物的CgSGR系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.6 Phylogenetic analysis of CgSGR gene from different species

圖5 CgSGR蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.5 Functional domains prediction for CgSGR

表2 不同植物CgSGR序列的多重比對(duì)

不同字母表示在0.05水平上有顯著性差異Different letters represented significant difference at the 0.05 level

2.4 不同砧穗組合滯綠基因CgSGR的表達(dá)分析

CgSGR在不同砧穗組合中均有表達(dá)，其中在Hm/Cj中表達(dá)量相對(duì)較低，在Hm/Pt中一直處于較高表達(dá)水平(圖7)。隨著嫁接苗的生長(zhǎng)發(fā)育，CgSGR的表達(dá)水平總體變化趨勢(shì)與凈光合速率、葉綠素的變化趨勢(shì)相反。Hm/Pt隨著植株黃化，其CgSGR的表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)。

3 討 論

光合作用是光合生物體內(nèi)最為重要的同化作用，是地球上所有生命現(xiàn)象的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。植物Pn下降的自身因素分為氣孔限制和非氣孔限制，當(dāng)Pn下降時(shí)，若Ci隨著Gs的下降而上升，說(shuō)明氣孔因素不是導(dǎo)致光合速率下降的主要原因[19]。本試驗(yàn)中，枳砧‘紅綿蜜柚’Pn在下降過(guò)程中，其Ci隨著Gs下降而下降，表明氣孔因素是導(dǎo)致光合速率下降的主要原因。枳砧‘紅綿蜜柚’凈光合速率從139 TAG開(kāi)始與對(duì)照嫁接組合呈現(xiàn)顯著差異，到404 TAG時(shí)差異極顯著，表明枳砧‘紅綿蜜柚’嫁接初期生長(zhǎng)發(fā)育良好，但從139 TAG時(shí)出現(xiàn)嫁接不親和現(xiàn)象，這與之前對(duì)該現(xiàn)象的田間調(diào)查結(jié)果一致[1]。水分利用效率(WUE)是凈光合速率與蒸騰速率的比值，是耦合植物葉片光合與水分生理過(guò)程的重要指標(biāo)[20]，枳砧‘紅綿蜜柚’嫁接體發(fā)育初期WUE值與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異，表明枳砧‘紅綿蜜柚’不親和屬于嫁接后期不親和。

葉綠素含量是植物適應(yīng)和利用環(huán)境因子的重要指標(biāo)，同時(shí)也是反映植物生長(zhǎng)狀態(tài)的主要指標(biāo)之一[21]。本試驗(yàn)研究了3種不同砧穗組合的葉綠素變化情況，證實(shí)了不親和砧穗組合的葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素含量均發(fā)生了顯著下降，葉綠素a/葉綠素b的比值反映了枳砧‘紅綿蜜柚’葉片黃化屬于總?cè)~綠素虧缺型。葉綠素與凈光合速率相關(guān)系數(shù)為0.666，呈顯著正相關(guān)，但未達(dá)到極顯著，這與易干軍等[22]對(duì)‘琯溪蜜柚’光合特性的研究結(jié)論相似。

目前關(guān)于滯綠基因SGR的研究，主要集中于滯綠突變體葉片衰老和葉綠素降解方面[21]。前人研究發(fā)現(xiàn)SGR主要影響葉綠素代謝途徑中的關(guān)鍵酶脫鎂葉綠酸a加氧酶(PaO)，從而調(diào)控葉片中的葉綠素降解，導(dǎo)致葉片在衰老過(guò)程中不變黃，并且這個(gè)過(guò)程與光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)有著密切聯(lián)系[23-24]。CgSGR表達(dá)隨著枳砧‘紅綿蜜柚’的葉綠素降解總體呈上升趨勢(shì)，與葉片凈光合速率相關(guān)系數(shù)為-0.691，呈顯著負(fù)相關(guān)，表明蜜柚CgSGR可以參與了葉綠素降解調(diào)控。本次試驗(yàn)中蜜柚與柚的CgSGR基因不存在堿基變異，因此是否由于啟動(dòng)子突變等引起蜜柚SGR基因表達(dá)的變化，還需進(jìn)一步研究。SGR基因在色素合成與積累中也同樣具有重要作用[11]，可以直接與類胡蘿卜素合成關(guān)鍵酶PSY發(fā)生互作，改變類胡蘿卜素的積累[12]。關(guān)于色澤突變體‘紅綿蜜柚’與野生型‘琯溪蜜柚’嫁接同一種砧木不親和是否與類胡蘿卜素代謝突變有關(guān)，還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

枳砧‘紅綿蜜柚’嫁接苗初期生長(zhǎng)良好，光合指標(biāo)較對(duì)照組高，但隨著植株生長(zhǎng)其光合各指標(biāo)值較對(duì)照材料存在顯著差異，該結(jié)果與其葉綠素含量變化趨勢(shì)一致。進(jìn)一步對(duì)滯綠蛋白調(diào)控基因CgSGR研究發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)隨著植株黃化升高，表明其可能參與調(diào)控枳砧‘紅綿蜜柚’黃化苗葉綠素降解，今后還需進(jìn)一步研究其在枳砧‘紅綿蜜柚’嫁接不親和中起到的作用。

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