雷公藤鯊烯環(huán)氧酶基因克隆與表達(dá)分析

祝傳書，劉 艷，陳蒙蒙，蒲 時(shí)，馮俊濤，2，張 興，2

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心，陜西楊陵 712100；2 陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，陜西楊陵 712100)

雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)系衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，是一種重要的藥用植物。在醫(yī)學(xué)方面，具有抗癌[1]、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[2]等作用。在農(nóng)業(yè)方面，雷公藤對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、蜚蠊目昆蟲表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒殺、拒食、麻醉、生長(zhǎng)發(fā)育抑制和種群抑制等多種特異性殺蟲作用[3]。雷公藤的主要活性成分為二萜、三萜等萜類物質(zhì)和倍半萜類生物堿[4]，雷公藤紅素就是從傳統(tǒng)中藥雷公藤根皮中提取分離得到的一種醌甲基三萜，因其具有重要的藥理活性，而極具開發(fā)價(jià)值[5]，是雷公藤最具代表性的三萜物質(zhì)，現(xiàn)被國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。作為一個(gè)天然藥物，雷公藤紅素不僅在抗腫瘤、抗炎與免疫抑制、抗神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域顯示了良好的藥理活性，還在治療感染、涎酸貯積癥及高血壓病等疾病方面展示了其潛力[6-7]。但野生雷公藤生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，次生代謝物含量低限制了雷公藤的應(yīng)用。現(xiàn)在通過(guò)對(duì)萜類化合物生物合成途徑中所涉及的關(guān)鍵酶進(jìn)行克隆和表達(dá)調(diào)控，是提高植物中萜類化合物含量最有效的途徑之一，同時(shí)也是代謝工程與合成生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。

鯊烯環(huán)氧酶(squalene epoxidase，SE，EC1.14.99.7)屬于單加氧酶，所以又稱為鯊烯單加氧酶，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，可催化鯊烯(角鯊烯)合成2,3-氧化鯊烯，2,3-氧化鯊烯經(jīng)過(guò)糖基化、羥基化以及環(huán)化作用等修飾后可以得到不同的三萜物質(zhì)[8]。2,3-氧化鯊烯是三萜類物質(zhì)的前體物質(zhì)，故鯊烯環(huán)氧酶的活性和含量決定了下游產(chǎn)物的產(chǎn)量。從三萜類化合物的合成通路發(fā)現(xiàn)，鯊烯環(huán)氧酶是其合成通路中的關(guān)鍵酶[9]，因此，鯊烯環(huán)氧酶被認(rèn)為是三萜類化合物生物合成途徑中一種重要的限速酶。鯊烯環(huán)氧酶作為三萜類化合物生物合成途徑上的關(guān)鍵酶，在合成三萜過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，因此雷公藤鯊烯環(huán)氧酶相關(guān)信息對(duì)于雷公藤三萜類物質(zhì)的生物合成研究具有重要意義。目前鯊烯環(huán)氧酶已經(jīng)在擬南芥[10]，蒺藜苜蓿[11]、人參[12]等多種植物中克隆得到并獲得功能驗(yàn)證。

本研究從雷公藤中克隆得到了2個(gè)鯊烯環(huán)氧酶編碼基因(TwSE1、TwSE2)，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并結(jié)合熒光定量PCR方法檢測(cè)其在不同組織部位的表達(dá)模式，以及在雷公藤發(fā)狀根中受茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)處理后基因表達(dá)量變化，為雷公藤三萜類物質(zhì)生物合成研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

雷公藤植物采自于福建泰寧，經(jīng)鑒定后移植于無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心；雷公藤發(fā)狀根[13]保存于MS液體培養(yǎng)基中25 ℃，120 r·min-1于黑暗條件下振蕩培養(yǎng)，每30 d繼代1次。

1.2 方 法

1.2.1雷公藤發(fā)狀根RNA提取選擇培養(yǎng)2個(gè)周期(1個(gè)周期30 d)的雷公藤發(fā)狀根，在培養(yǎng)發(fā)狀根的MS液體培養(yǎng)基中加入MeJA誘導(dǎo)子，使誘導(dǎo)終濃度為100 μmol·L-1。于誘導(dǎo)后0、1、3、6、9、12、24、48 h后取樣，液氮速凍后置于-80 ℃保存。利用Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(博日生物科技有限公司，杭州)提取雷公藤發(fā)狀根總RNA。

1.2.2雷公藤不同組織RNA提取分別取雷公藤根、莖、嫩葉、老葉、花5個(gè)組織部位的材料，在液氮中速凍研磨，采用天根公司(北京)多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取雷公藤各組織總RNA。

1.2.3cDNA合成根據(jù)PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(TaKaRa)將MeJA誘導(dǎo)3 h的雷公藤發(fā)狀根總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于基因克隆試驗(yàn)；利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)將雷公藤5個(gè)組織部位的總RNA和MeJA誘導(dǎo)處理的雷公藤發(fā)狀根總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于熒光定量PCR試驗(yàn)。各試劑購(gòu)自TaKaRa大連寶生物工程有限公司。

1.2.4TwSE1與TwSE2基因克隆以反轉(zhuǎn)錄cDNA作為模板，按照下列體系對(duì)雷公藤TwSE1與TwSE2基因進(jìn)行擴(kuò)增。配制反應(yīng)體系：1 μL cDNA、1 μL上游引物 (10 μmol·L-1)、1 μL下游引物 (10 μmol·L-1)、12.5 μL PrimeSTAR(TaKaRa)和9.5 μL ddH2O。反應(yīng)程序: 95 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 100 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；12 ℃保存。利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增TwSE1與TwSE2基因引物(表1，下劃線堿基為相應(yīng)酶切位點(diǎn))。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，對(duì)擴(kuò)增所得目的片段進(jìn)行切膠純化回收。PCR產(chǎn)物回收后利用Premix Taq(TaKaRa)進(jìn)行加“A”反應(yīng)，然后連接pMD 19-T載體(TaKaRa)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa)中，在氨芐抗性平板上進(jìn)行篩選，再經(jīng)菌落PCR檢測(cè)后選擇陽(yáng)性克隆送北京奧科生物技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.5TwSE1與TwSE2基因的生物信息學(xué)分析通過(guò)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)BLAST搜索蛋白質(zhì)和核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)，并由DNAMAN軟件翻譯成氨基酸序列，使用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找開放閱讀框(ORF)。利用ExPASy Proteomics Server的在線軟件對(duì)基因編碼預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用SOPMA對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。采用InterproScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan)在線進(jìn)行結(jié)構(gòu)域比對(duì)預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域。應(yīng)用在線SinalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services /Signal P/)軟件分析蛋白是否含信號(hào)肽。使用TMHMM Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk /services/TMHMM/)預(yù)測(cè)蛋白跨膜區(qū)域。用DNAMAN軟件對(duì)序列進(jìn)行多重比對(duì)，通過(guò)MEGA6.0軟件構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000次。

1.2.6TwSE1與TwSE2基因差異表達(dá)采用CFX96 Real-Time PCR Detection System 擴(kuò)增儀，檢測(cè)TwSE1與TwSE2基因在雷公藤根、莖、嫩葉、老葉、花中的表達(dá)量，并檢測(cè)雷公藤發(fā)狀根受MeJA誘導(dǎo)后2個(gè)基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量。反應(yīng)體系為：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa)12.5 μL；正反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL；cDNA 模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。于延伸階段進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，65～95 ℃做融解曲線分析。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，以Elongation factor 1 α(EF1α)為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法分析相對(duì)表達(dá)量。不同組織基因表達(dá)量以根中的表達(dá)量為對(duì)照，MeJA誘導(dǎo)后基因表達(dá)水平以處理0 h的表達(dá)量為對(duì)照。引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 雷公藤TwSE1與TwSE2基因的克隆

以雷公藤發(fā)狀根cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到單一、特異的擴(kuò)增帶，片段大小約為1 600 bp(圖1)。通過(guò)進(jìn)一步分離分析，獲得1條長(zhǎng)為1 578 bp cDNA序列，將該基因命名為TwSE1(GenBank登錄號(hào)MG717395)；1條長(zhǎng)為1 584 bp cDNA序列，將該基因命名為TwSE2(GenBank登錄號(hào)MG717396)。

2.2 雷公藤TwSE1與TwSE2基因序列生物信息學(xué)分析

2.2.1雷公藤TwSE1與TwSE2理化性質(zhì)分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用 Protparam生物信息學(xué)工具對(duì)SE基因編碼氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示：TwSE1基因編碼525個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量是57.34 kD，推測(cè)該蛋白的分子式為C2568H4100N706O728S26，等電點(diǎn)為8.74；不穩(wěn)定系數(shù)為43.17，該蛋白為不穩(wěn)定蛋白(不穩(wěn)定系數(shù)<40時(shí)，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)穩(wěn)定，反之則不穩(wěn)定)；總平均親水性為0.050，具有疏水性。TwSE2基因編碼527個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量是57.54 kD，推測(cè)該蛋白的分子式為C2596H4128N700O733S21，等電點(diǎn)為8.97；不穩(wěn)定系數(shù)為35.65，該蛋白為穩(wěn)定蛋白；總平均親水性為0.085，具有疏水性。

圖1 雷公藤TwSE1、TwSE2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The PCR amplification of TwSE1 and TwSE2 gene

表1 克隆和RT-PCR引物Table 1 Primers designed for cloning and RT-PCR

利用SOPMA對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)結(jié)果表明，TwSE1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占34.67%，延伸鏈占21.71%，β-轉(zhuǎn)角占10.10%，無(wú)規(guī)則卷曲占33.52%；TwSE2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占31.31%，延伸鏈占26.19%，β-轉(zhuǎn)角占10.06%，無(wú)規(guī)則卷曲占32.45%。

利用InterProscan進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)TwSE1和TwSE2基因編碼蛋白都存在鯊烯環(huán)氧酶保守結(jié)構(gòu)域，且都在212～484位氨基酸。TwSE1、TwSE2基因編碼蛋白均含有2個(gè)FAD-結(jié)合位點(diǎn)，TwSE1在60～232位、326～436位氨基酸，TwSE2在61～232位、326～436位氨基酸。TwSE1與TwSE2基因編碼蛋白的保守位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域基本一致，都有FAD結(jié)合位點(diǎn)和鯊烯環(huán)氧酶保守位點(diǎn)，顯示出SE蛋白的共有特性。

2.2.2信號(hào)肽及跨膜區(qū)預(yù)測(cè)利用生物學(xué)軟件Signal P4.1Server軟件分析TwSE1和TwSE2編碼的蛋白質(zhì)序列，氨基酸殘基的加權(quán)平均值分別為0.257、0.375,均小于0.5，由此推測(cè)TwSE1和TwSE2基因所編碼的蛋白不存在信號(hào)肽為非分泌性蛋白。

使用TMHMM Server v.2.0對(duì)TwSE1及TwSE2編碼蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)：TwSE1具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，分別在6～25位、429～451位、455～477位、484～501位氨基酸；但TwSE2僅有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，在7～29位氨基酸(圖3)。

2.2.3氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化分析DNAMAN中多重序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)TwSE1、TwSE2基因編碼氨基酸序列相似度高達(dá)76.18%，但是2個(gè)預(yù)測(cè)蛋白N-端氨基酸顯示出很高的特異性，前60個(gè)氨基酸的相似性只有19.35%(圖4)。利用Blast搜索NCBI上的核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)和氨基酸數(shù)據(jù)庫(kù)中近緣物種的SE序列信息，發(fā)現(xiàn)TwSE與其他植物SE氨基酸序列具有較高的相似性。雷公藤TwSE1基因氨基酸序列與人參、三七、蒺藜苜蓿等氨基酸序列相似度分別為80%、76%和75%，TwSE2分別為76%、79%和79%。

利用MEGA6.0軟件采用鄰結(jié)法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建TwSE的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)?？梢钥闯觯琓wSE1、TwSE2與南非醉茄、玉米、蒺藜苜蓿聚為同一分支，并且TwSE1與南非醉茄聚為一支，親緣關(guān)系最高，TwSE2與玉米聚為一支，親緣關(guān)系最高。

圖2 TwSE1(A)和TwSE2(B)蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.2 The conserved domains of TwSE1 and TwSE2 protein

圖3 TwSE1和TwSE2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of the transmembrane regions of TwSE1 and TwSE2 proteins

圖4 雷公藤TwSE1、TwSE2氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Amino acid alignment between TwSE1 and TwSE2 in T. wilfordii

圖5 雷公藤TwSE蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of T.wilfordii TwSE proteins

2.3 TwSE1與TwSE2基因表達(dá)模式分析

2.3.1組織特異性表達(dá)分析利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)TwSE1與TwSE2基因組織表達(dá)特異性，結(jié)果(圖6)表明，2個(gè)基因在雷公藤根、莖、嫩葉、老葉、花中均有表達(dá)，但表達(dá)模式不同。TwSE1基因在花中表達(dá)量最高，在嫩葉和老葉中表達(dá)量相當(dāng)?shù)陀诨?，在莖中表達(dá)量低于嫩葉和老葉，在根中表達(dá)量最低。TwSE2基因在嫩葉和花中表達(dá)量相當(dāng)表達(dá)量最高，在莖中的表達(dá)量高于根，在老葉中的表達(dá)量最低。

2.3.2MeJA誘導(dǎo)表達(dá)分析對(duì)雷公藤發(fā)狀根進(jìn)行MeJA誘導(dǎo)處理，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析SE基因誘導(dǎo)后不同時(shí)間的表達(dá)水平，結(jié)果(圖7)顯示，誘導(dǎo)后48 h內(nèi)TwSE1相對(duì)表達(dá)量有不同程度的提高，誘導(dǎo)后3 h時(shí)達(dá)到一個(gè)高表達(dá)水平，是0 h的8.91

圖6 TwSE1和TwSE2在雷公藤不同組織相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Expression analysis of TwSE1 and TwSE2 on different tissues in T. wilfordii

圖7 MeJA誘導(dǎo)后雷公藤發(fā)狀根TwSE1和TwSE2基因的表達(dá)Fig.7 Expression analysis of TwSE1 and TwSE2 after MeJA treatment in T. wilfordii hairy roots

倍，之后表達(dá)量下降，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)在誘導(dǎo)12 h后表達(dá)量又顯著上升，24 h時(shí)表達(dá)量顯著高于3 h，表達(dá)量水平是0 h的9.97倍。TwSE2與TwSE1呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，誘導(dǎo)后3 h時(shí)達(dá)到一個(gè)高表達(dá)量水平，是0 h的1.95倍，之后表達(dá)量下降，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)在誘導(dǎo)12 h后表達(dá)量又顯著上升，誘導(dǎo)后24 h時(shí)表達(dá)量顯著高于誘導(dǎo)后3 h，表達(dá)量是0 h的3.20倍。

3 討 論

雷公藤作為重要的藥用植物，因生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、植物中次生代謝物含量低、資源不足等原因，急需構(gòu)建體外生物合成的辦法獲得次生代謝產(chǎn)物。其中通過(guò)對(duì)萜類化合物生物合成途徑中所涉及的關(guān)鍵酶進(jìn)行克隆及表達(dá)調(diào)控，是利用代謝工程和合成生物學(xué)方法的基礎(chǔ)，同時(shí)也是提高植物中萜類化合物含量最有效途徑之一。目前對(duì)雷公藤三萜類生物合成途徑研究較少，限制了雷公藤三萜類成分的合成生物學(xué)研究。本研究首次從雷公藤發(fā)狀根中克隆得到2個(gè)鯊烯環(huán)氧酶基因，2個(gè)SE基因(TwSE1與TwSE2)具有較高的相似性。已知的鯊烯環(huán)氧酶均含有FAD結(jié)合區(qū)域，該區(qū)域涉及到與FAD結(jié)合的很多酶，這些酶以FAD為輔助因子參與多種催化反應(yīng)[14]，是三萜類化合物生物合成中的關(guān)鍵位點(diǎn)[15]。雷公藤的2個(gè)SE中也都包含F(xiàn)AD結(jié)合的基序序列和典型的鯊烯環(huán)氧酶保守結(jié)構(gòu)域，顯示出SE家族的共有特性。雷公藤TwSE1蛋白具有4個(gè)跨膜螺旋，與三七中的2個(gè)SE一樣[16]，但TwSE2蛋白僅有1個(gè)跨膜螺旋。SE被認(rèn)為是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的酶[17]，因跨膜螺旋差異推測(cè)TwSE1和TwSE2兩者在膜內(nèi)外結(jié)構(gòu)上可能存在差異。序列分析發(fā)現(xiàn)TwSE與其他物種的SE基因具有較高相似性，相似度達(dá)70%～85%，其中TwSE1與南非醉茄的親緣關(guān)系最高，TwSE2與玉米親緣關(guān)系最高。

不同物種中含有的SE基因拷貝數(shù)不同，植物中多含2個(gè)或2個(gè)以上類型的SE基因[18]，且不同植物SE基因表達(dá)的組織特性也存在差異[12,16]。本研究對(duì)克隆得到的2個(gè)SE基因進(jìn)行不同組織部位表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)它們具有不同的組織表達(dá)模式。TwSE1與TwSE2基因在雷公藤5個(gè)組織部位均有表達(dá)，TwSE1基因在花中表達(dá)量最高，根中表達(dá)量最低；TwSE2基因在花和嫩葉中表達(dá)量最高，老葉中表達(dá)量最低。TwSE1在嫩葉和老葉中表達(dá)量相當(dāng)，但TwSE2在嫩葉中的表達(dá)量是老葉中的表達(dá)量的3.48倍，顯著高于老葉中的表達(dá)量，并且在各組織部位TwSE2的表達(dá)量都低于TwSE1。由此推測(cè)，在三萜物質(zhì)代謝途徑中TwSE1起主要催化作用，TwSE2起次要催化作用，2個(gè)SE基因在雷公藤三萜物質(zhì)生物合成中的具體功能有待進(jìn)一步分析。

茉莉酸甲酯(MeJA)廣泛地存在于植物體中，外源應(yīng)用能夠激發(fā)防御植物基因的表達(dá)，具有提高植物次生代謝水平、增加三萜類次生代謝物累積的作用[19]。在人參根中發(fā)現(xiàn)SE與人參皂苷合成量高度相關(guān)，茉莉酸甲酯可誘導(dǎo)SE基因高表達(dá)同時(shí)增加三萜合成量[19]。由此推測(cè)MeJA能夠能夠激發(fā)雷公藤發(fā)狀根SE基因的表達(dá)，提高三萜類物質(zhì)合成量。本研究用MeJA誘導(dǎo)雷公藤發(fā)狀根，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示TwSE1基因與TwSE2基因在MeJA誘導(dǎo)后表達(dá)量變化都呈現(xiàn)先提高后下降然后再上升的趨勢(shì)；且TwSE1在MeJA誘導(dǎo)后表達(dá)水平顯著提高，TwSE2基因在MeJA誘導(dǎo)后表達(dá)水平較TwSE1提高幅度較小。受MeJA誘導(dǎo)后表達(dá)水平的提高表明雷公藤中2個(gè)SE基因都與三萜類物質(zhì)合成相關(guān)，2個(gè)基因誘導(dǎo)后表達(dá)變化趨勢(shì)一致表明2個(gè)基因可能有著相同的催化功能，但兩基因表達(dá)水平的不一致又表明2個(gè)基因在三萜物質(zhì)合成過(guò)程中催化作用可能不同，可能參與了不同的次生代謝途徑。

本研究首次對(duì)雷公藤TwSE1與TwSE2基因進(jìn)行了克隆與序列及表達(dá)模式的初步探索，研究結(jié)果為研究雷公藤三萜類物質(zhì)生物合成途徑提供了基礎(chǔ)，同時(shí)為進(jìn)一步利用代謝工程和合成生物學(xué)方法合成雷公藤三萜類化合物提供依據(jù)。

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