• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      東北油豆角枯萎病病原菌的分離、純化與鑒定

      2018-06-23 08:08:58杜偉玲
      蔬菜 2018年6期
      關(guān)鍵詞:豆角鐮刀致病性

      王 杰,周 萌,杜偉玲

      (哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物中心,黑龍江 哈爾濱 150029)

      油豆角是我國東北地區(qū)(黑龍江、吉林為主)特有的一種優(yōu)質(zhì)食莢菜豆品種,含有較高的蛋白質(zhì)(干質(zhì)量的20%以上),含有人體必須的18種氨基酸、豐富的膳食纖維、多種維生素和礦物質(zhì)。

      油豆角枯萎病俗稱萎蔫病、死秧。一般發(fā)病率在30%~50%,個別重病田病株率高達(dá)90%以上。病原菌通過根部傷口或根毛頂端細(xì)胞侵入,進(jìn)入寄主導(dǎo)管內(nèi)發(fā)育,隨水分的運(yùn)輸迅速擴(kuò)展到植株頂端,堵塞導(dǎo)管,而使病株萎蔫。初花期開始發(fā)病,結(jié)莢盛期植株大量枯死,嚴(yán)重阻礙油豆角生產(chǎn)。

      為了控制枯萎病的危害,首先要研究其發(fā)病的原因。試驗對引起發(fā)病的病原菌進(jìn)行分離和鑒定,以期為有針對性地防治該病害奠定基礎(chǔ)。

      1 材料和方法

      1.1 試驗材料

      PSA培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂粉15 g,加水至1 000 mL,pH值5.0~6.0;致病性鑒定所使用的油豆角品種:將軍一點紅(當(dāng)?shù)刂髟云贩N)。試劑盒:Ezup 柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒。

      1.2 試驗方法

      1.2.1 病原菌的分離

      采用組織分離法:將剪取的油豆角莖基部病組織樣品經(jīng)2.0%(V/V)NaClO表面滅菌0.5~1.0 min,再用滅菌蒸餾水沖洗。用滅菌濾紙將樣品擦干,后用解剖刀將其切成小薄片,置于含有PSA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,28±2 ℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)5~7 d,將從樣本中得到的分離物進(jìn)行單孢分離(稀釋分離法),將單孢分離物轉(zhuǎn)接于新的含有PSA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,28±2 ℃條件下培養(yǎng)7 d備用。

      1.2.2 病原菌的鑒定

      形態(tài)學(xué)觀察:培養(yǎng)7~10 d后觀察菌絲體形態(tài),采用數(shù)碼倒置顯微鏡EVOS觀察其分生孢子的形態(tài)。

      致病性測定:病原菌的接種方法參考Haware和Nene[1]的方法。將玉米粉與蛭石按1∶2(V/V)的比例制成混合物,在1 000 mL規(guī)格的三角瓶中裝入400 mL混合物,121 ℃、0.2 MPa條件下滅菌30 min,滅菌2次。向玉米粉混合物中加入50 mL滅菌蒸餾水,混合均勻后接入病原菌(培養(yǎng)皿直徑為90 mm,且長滿病原菌菌絲),25~28 ℃條件下培養(yǎng)7~10 d,每天搖晃三角瓶使病原菌均勻生長。將接種體與滅菌的營養(yǎng)土按照1∶10(V/V)的比例混合,取0.01 g接種混合土懸浮于1 mL滅菌水中,用血球計數(shù)板計算接種混合土中病原菌的含量,使接種終濃度達(dá)到5.0×106cfu/g。將用0.5%NaClO溶液表面滅菌的油豆角種子播種于裝有上述接種混合土的營養(yǎng)缽中,致病性測定在人工氣候箱中進(jìn)行,30±2 ℃條件下,每日光照12 h,適時澆水。以未接種病菌的滅菌營養(yǎng)土作為對照,定期觀察植株生長情況。根據(jù)柯赫氏法則,從發(fā)病的植株上再次分離病原菌進(jìn)行純培養(yǎng),并觀察其特征。

      分子生物學(xué)鑒定:應(yīng)用Ezup柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒進(jìn)行病原菌基因組DNA提取。PCR擴(kuò)增采用真菌鑒定通用引物ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG,ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC;PCR 反應(yīng)體系:Template(基因組 DNA 20~50 ng/μL)0.5 μL、10×Buffer(加Mg2+)2.5 μL、dNTP(各2.5 mM)1 μL、Taq酶0.2 μL、ITS1(10 μM)0.5 μL、ITS4(10 μM)0.5 μL,加雙蒸水至25 μL。PCR循環(huán)條件:預(yù)變性4 min,94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共計30個循環(huán),然后72 ℃延伸修復(fù)10 min,4 ℃終止反應(yīng);用1%瓊脂糖凝膠電泳,150 V、100 mA電泳20 min;用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化回收目標(biāo)條帶,PCR產(chǎn)物交由上海生工生物工程有限公司直接測序。將測得的rDNA-ITS序列放到NCBI基因序列數(shù)據(jù)庫中,并利用BLAST技術(shù)進(jìn)行分析。

      專化型鑒定:方法同上述致病性鑒定方法,只是把接種對象擴(kuò)大到豇豆、扁豆、豌豆、菜用大豆和蠶豆,其中包括油豆角,每處理接30株苗,以清水處理作為對照。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 病原菌的形態(tài)

      在固體馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)培養(yǎng)基上,菌落呈淡紫色;大型分生孢子鐮刀形,有3~5個隔;小型分生孢子橢圓形,有0~1個隔(圖1)。

      2.2 病原菌的致病性鑒定

      未接種病原菌的植株正常生長(圖2-A左);接種病原菌的植株出現(xiàn)的白化現(xiàn)象后萎蔫(圖2-A右),其莖的維管束變褐色(圖2-B)。試驗共分離到鐮刀菌菌株6株,其中對油豆角(將軍一點紅)有致病性的1株。

      2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

      病原菌的rDNA-ITS序列測定結(jié)果如下:

      將DNA序列放到NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中通過BLAST比對,結(jié)果顯示此序列與近100個尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)分離物或?qū);屯葱赃_(dá)100%,由此可以推斷,病原菌應(yīng)該屬于尖孢鐮刀菌種。

      2.4 ?;丸b定

      以清水為對照,寄主為油豆角,其發(fā)病率為0.00%。另外,從表1可以看出:病原菌強(qiáng)侵染油豆角,弱侵染豇豆,不侵染扁豆、豌豆、菜用大豆和蠶豆。

      3 結(jié)論與討論

      鐮刀菌的鑒定是一項非常復(fù)雜的工作,傳統(tǒng)方法主要采用形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)作為判斷依據(jù),方法容易受多種外界因素的影響而產(chǎn)生很大的不確定性。自從發(fā)現(xiàn)真菌rDNA-ITS區(qū)具有豐富變異的特點,常常將這一可變區(qū)作為真菌菌種和分離物鑒定的可靠依據(jù)之一[2]。劉波等[3]對引起瓜類枯萎病的尖孢鐮刀菌多個菌株的rDNA-ITS區(qū)序列及串珠鐮孢菌多個菌株的rDNA-ITS區(qū)序列進(jìn)行多重比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn):來自不同?;偷木阹DNA-ITS區(qū)序列可能完全相同,而同一?;偷木阹DNA-ITS區(qū)序列也有可能存在一定的差異,說明ITS區(qū)序列無法用于區(qū)分菌株的專化型。另外,余仲東等[4]也認(rèn)為ITS區(qū)序列不適于種下階元劃分。研究中,2株病原菌rDNA-ITS區(qū)序列與近100個尖孢鐮刀菌分離物或?qū);偷耐葱赃_(dá)100%,再次驗證了通過rDNA-ITS區(qū)序列只能鑒定到種而無法鑒定到種以下分類單元(比如?;停┻@一事實。

      表1 尖孢鐮刀菌?;丸b定結(jié)果

      圖1 病原菌形態(tài)及分生孢子

      圖2 油豆角病原菌的致病性鑒定情況

      張吉祥等[5]歸納總結(jié)了DNA分子標(biāo)記(包括RFLP、RAPD、AFLP、ISSR和SCAR等)、毒性基因和轉(zhuǎn)座子等技術(shù)在尖孢鐮刀菌?;图捌渖硇》N鑒別方面的應(yīng)用,指出分子方法盡管具有快速、靈敏、特異性高等諸多優(yōu)點,但也都有各自的局限性,限制了其廣泛應(yīng)用。在生產(chǎn)上,尖孢鐮刀菌?;丸b定大部分還是利用傳統(tǒng)的鑒定方法,主要通過菌株在不同作物上的致病性測定。

      結(jié)合形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和?;偷蔫b定結(jié)果,可初步把病原菌鑒定為尖孢鐮刀菌菜豆?;?。

      [1]HAWARE M P, NENE Y L. Races ofFusarium oxysporum[J]. Plant Disease,1982,66(9):809-810.

      [2]SCHMIDT O, MORETH U. Data band of rDNA-ITS sequences from building-rot fungi for their identification[J]. Wood Science and Technology,2002,36(5):429-433.

      [3]劉波,黃俊生,肖榮鳳.尖孢鐮刀菌生物學(xué)及其生物防治[M].北京:科學(xué)出版社,2013.

      [4]余仲東,劉小勇,曹支敏.松楊柵銹菌的ITS序列和微衛(wèi)星分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(6):31-34.

      [5]張吉祥,凌鍵,謝丙炎.尖孢鐮刀菌專化型及生理小種分子檢測研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2013,29(36):338-342.蔬

      猜你喜歡
      豆角鐮刀致病性
      記憶里的一彎鐮刀
      剝豆角
      詞語對對碰
      氤氳豆角香
      文苑(2018年20期)2018-11-09 01:36:08
      酷蟲學(xué)校再遇鐮刀幫(一)
      夏日豆角飯
      一例高致病性豬藍(lán)耳病的診治
      高致病性藍(lán)耳病的診斷和治療
      高致病性豬藍(lán)耳病的防控
      PCR-RFLP鑒定常見致病性念珠菌
      黄大仙区| 永定县| 资溪县| 皋兰县| 德令哈市| 克拉玛依市| 徐州市| 扶沟县| 马龙县| 潼关县| 康乐县| 宝坻区| 康平县| 鄂托克前旗| 徐闻县| 丰台区| 星座| 特克斯县| 彝良县| 洪雅县| 普宁市| 甘洛县| 仙游县| 丰原市| 万源市| 蓬莱市| 绥芬河市| 甘孜| 贵阳市| 于都县| 海淀区| 天长市| 门源| 平江县| 获嘉县| 肇州县| 米脂县| 平和县| 丰台区| 兴和县| 竹山县|