EDTA和有機(jī)酸對(duì)毛竹修復(fù)重金屬污染土壤的強(qiáng)化作用

葉朝軍，吳家勝，鐘 斌，陳俊任，郭 佳，徐美貞，柳 丹,

（1.溫州科技職業(yè)學(xué)院 科技產(chǎn)業(yè)開發(fā)處，浙江 溫州325006；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；3.浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省土壤污染生物修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州311300；4.東陽(yáng)市畫水鎮(zhèn)人民政府，浙江 東陽(yáng) 321000；5.浙江誠(chéng)邦園林股份有限公司，浙江 杭州310008）

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展及人類的活動(dòng)加劇，重金屬污染已經(jīng)嚴(yán)重危害到人類的健康［1－2］。目前，植物修復(fù)因其綠色環(huán)保受到廣泛的關(guān)注，但由于受到土壤中重金屬生物有效性的影響，植物修復(fù)效率低下［3－4］。利用螯合劑來(lái)活化土壤中的重金屬，促進(jìn)植物對(duì)重金屬的吸收，是提高植物修復(fù)效率的方法之一［5］，其中，乙二胺四乙酸（EDTA）是使用最廣泛的一種螯合劑，能夠顯著提高鉛（Pb），銅（Cu），鎘（Cd）等重金屬的活性［6－8］。CHIGBO等［9］在銅污染的土壤中施加EDTA強(qiáng)化植物修復(fù)后顯著提高了土壤中銅的有效態(tài)含量，同時(shí)顯著促進(jìn)了植物對(duì)銅的吸收積累。有研究表明：EDTA的生物降解性差，可能會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定污染［10］。草酸、檸檬酸等生物降解性較好的小分子有機(jī)酸也被廣泛用于植物修復(fù)中［11］。DUQUèNE等［12］研究發(fā)現(xiàn)，使用5 mmol·kg－1檸檬酸、檸檬酸銨、草酸等有機(jī)酸顯著增加了土壤溶液中重金屬的質(zhì)量濃度。相對(duì)于其他超積累植物或者重金屬富集植物，毛竹Phyllostachys edulis擁有巨大的生物量，并且已被證明作為植物修復(fù)材料的可能性［13－14］。本研究采用鍍鋅廠重金屬污染土壤和毛竹苗進(jìn)行土柱淋洗試驗(yàn)，研究施加螯合劑EDTA和有機(jī)酸后毛竹葉片葉綠素?zé)晒馓匦裕裰亟饘儋|(zhì)量分?jǐn)?shù)變化，土壤溶液重金屬質(zhì)量分?jǐn)?shù)及EDTA質(zhì)量濃度的動(dòng)態(tài)變化，為螯合劑強(qiáng)化重金屬污染土壤植物修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤來(lái)自浙江省杭州市富陽(yáng)區(qū)云納熱鍍鋅廠附近農(nóng)田（29°53′17″N， 119°53′24″E）， 采集 0～20，20～40，40～60 cm等3個(gè)土層的重金屬污染土壤，風(fēng)干過(guò)5 mm篩，其土壤基本理化性質(zhì)見(jiàn)表1。供試植株：由種子培養(yǎng)生長(zhǎng)在基質(zhì)中的毛竹幼苗，選擇長(zhǎng)勢(shì)相似且無(wú)病蟲害的幼苗，用蒸餾水去除附著的基質(zhì)，在含有1/2 Yoshida營(yíng)養(yǎng)液（pH 5.8）的黑色塑料盆中預(yù)培養(yǎng)。營(yíng)養(yǎng)液隔5 d更新1次，保持24 h通氣。

表1 土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of soil

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

將不同土層的土壤裝入土柱中，并且在5，20，40，60 cm土層處裝入土壤溶液收集器［15］。栽植毛竹苗3株·土柱－1，并且控制土柱土壤含水率，整個(gè)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)周期為2個(gè)月，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前10 d，一次性分別添加人工螯合劑和有機(jī)酸。所添加的人工螯合劑為質(zhì)量摩爾濃度1.5 mmol·kg－1（E1.5）和3.0 mmol·kg－1（E3.0）的 EDTA-Na2； 有機(jī)酸根據(jù)毛竹苗根系分泌物配制， 為 m（草酸）∶m（檸檬酸）∶m（乳酸）=5∶1∶1 的混合物［16］， 質(zhì)量摩爾濃度為 15.0 mmol·kg－1（S15）和 30.0 mmol·kg－1（S30）， 以不添加螯合劑和有機(jī)酸為對(duì)照（ck），共5個(gè)處理，重復(fù)3個(gè)·處理－1，并隨機(jī)排放。整個(gè)試驗(yàn)在浙江農(nóng)林大學(xué)溫室大棚內(nèi)完成。為避免pH值不同所引起的活化差異，所添加的EDTA和有機(jī)酸的pH值均調(diào)節(jié)成供試土壤pH值［17］。

1.3 土壤溶液的收集

在添加螯合劑前1 d，收集土柱各土層的土壤溶液，作為初始溶液，然后一次性加入EDTA和有機(jī)酸，并在第1，3，5，7，9天收集土壤溶液［18］，共6次。收集到的土壤溶液取10 mL酸化，利用ICPOES測(cè)定土壤液中重金屬質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其余冷凍保存冰箱備用。

1.4 植物葉綠素?zé)晒獾臏y(cè)定

在試驗(yàn)結(jié)束前2 d，選擇晴朗天氣，利用便攜式葉綠素?zé)晒鈨x在9:00－12:00測(cè)定每株毛竹第3片葉片葉綠素?zé)晒馓卣?。Fo為初始熒光；Fm為最大熒光產(chǎn)量；Fv/Fm為PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量；Fv/Fo為PSⅡ潛在光化學(xué)效率。

1.5 毛竹重金屬質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

收獲的毛竹用20.0 mmol·L-1EDTA-Na2浸泡20 min，去除附著的重金屬，將毛竹分為根莖葉3部分，粉碎，稱取0.1 g的樣品，用硝酸/高氯酸消煮定容至50 mL并過(guò)濾，用ICP-OES測(cè)定重金屬質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.6 土壤溶液中EDTA質(zhì)量濃度的測(cè)定

EDTA質(zhì)量濃度測(cè)定參考郭曉方等［19］、鄭睿行等［20］方法：取1.0 mL樣品至管中，加1.0 mL氯化鐵溶液（2.5 mmol·L-1）和1.0 mL抗壞血酸（含4.0 mg抗壞血酸），稀釋至5.0 mL，水定容搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，立即液相色譜法測(cè)定。液相色譜為日本LC-20AT，分析柱：C18 Inertsil ODS-SP色譜柱（4.6 mm × 250 mm， 5 μm）， 島津； 保護(hù)柱： Inertsil ODS-SP（5 μm， 4.0 mm × 10 mm）， 島津； 流動(dòng)相：水-甲醇（80+20）含有 0.02 mol·L-1四丁基溴化銨， 0.03 mol·L-1乙酸鈉緩沖液（磷酸調(diào) pH 4）； 流速： 0.8 mL·min-1， 檢測(cè)波長(zhǎng)： 258 nm。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013和SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SigmaPlot 12.5軟件作圖。采用方差分析和最小差異顯著法（LSD）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果分析

2.1 EDTA及有機(jī)酸對(duì)毛竹葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h3>

由表2可知：施加EDTA和有機(jī)酸后，F(xiàn)o略微上升，與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異；而Fm，F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo不同程度地下降，且添加3.0 mmol·kg-1EDTA和有機(jī)酸后，F(xiàn)m，F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo顯著降低，在30.0 mmol·kg-1有機(jī)酸下Fm，F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo下降幅度最大，分別降低了11.7%，5.3%和19.2%。可見(jiàn)，30.0 mmol·kg-1的有機(jī)酸處理對(duì)毛竹葉片葉綠素?zé)晒馓匦砸种菩Ч顬轱@著。

表2 添加EDTA和有機(jī)酸后毛竹葉片葉綠素?zé)晒庾兓疶able 2 Changes of chlorophy fluorescence parameter of moso bamboo leaves after adding EDTA and organic acids

2.2 EDTA及有機(jī)酸強(qiáng)化毛竹吸收重金屬

從圖1可以看出：添加EDTA后毛竹對(duì)3種重金屬的吸收顯著增加，且隨著EDTA質(zhì)量摩爾濃度增加而增加；添加有機(jī)酸后，毛竹對(duì)重金屬的吸收無(wú)顯著差異。毛竹從土壤吸收的重金屬主要集中在根部，其次在莖，最少在葉，并且毛竹對(duì)鎘的轉(zhuǎn)運(yùn)效率最高，對(duì)銅的轉(zhuǎn)運(yùn)效率最低。

2.3 EDTA及有機(jī)酸對(duì)重金屬在不同土層內(nèi)遷移的影響

圖1 EDTA和有機(jī)酸對(duì)毛竹吸收重金屬的影響Figure 1 Effect of EDTA and organic acids on moso bamboo accumulated heavy metal

2.3.1 EDTA及有機(jī)酸對(duì)銅在不同土層內(nèi)遷移的影響 由圖2所示：在對(duì)照處理中，土壤溶液中銅質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著采集時(shí)間的增加始終在低于0.1 mg·kg-1的范圍內(nèi)波動(dòng)。在土壤中添加螯合劑后，土壤溶液中銅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加。在EDTA處理中，3.0 mmol·kg-1EDTA對(duì)銅的活化作用較強(qiáng)，在添加EDTA后第1天各土層土壤溶液中銅質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升，且5 cm土層處土壤溶液中銅質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化最大，與對(duì)照相比分別增加了1 215和1 639倍。隨著時(shí)間的推移，5 cm表層土層土壤溶液中銅質(zhì)量分?jǐn)?shù)先升高，在第3天的時(shí)候達(dá)到最大，然后再隨時(shí)間的增加而降低；在20 cm及更深的土層中，土壤液中的銅不斷累積。添加有機(jī)酸后，只有表層土壤表現(xiàn)出明顯的活化作用。在5 cm土層中，15.0 mmol·kg-1有機(jī)酸處理后，土壤溶液中銅質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著時(shí)間增加逐漸減少，15.0 mmol·kg-1有機(jī)酸處理后，土壤溶液中銅質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著時(shí)間增加先增加后減少，在20 cm處，僅在添加有機(jī)酸的第1天銅質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加。在整個(gè)土柱試驗(yàn)中，土壤溶液中銅主要集中在表層土壤。

圖2 各土層土壤溶液中銅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Figure 2 Change of Cu contents in soil solution of different soil layers

2.3.2 EDTA及有機(jī)酸對(duì)鋅在不同土層內(nèi)遷移的影響 由圖3可知：對(duì)照土壤溶液中鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著采集時(shí)間無(wú)顯著變化，添加EDTA螯合劑后，土壤溶液中鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加，且相比添加有機(jī)酸作用更加明顯。在EDTA處理中，高質(zhì)量濃度EDTA對(duì)鋅的活化作用較強(qiáng)，在添加1.5和3.0 mmol·kg-1EDTA后第1天各土層土壤溶液中鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升。隨著時(shí)間的增加，5和60 cm土層處鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降低，在20和40 cm土層，土壤溶液中的鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著時(shí)間的增加而增大。添加有機(jī)酸后，在5和20 cm土層土壤溶液中鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加。

圖3 各土層土壤溶液中鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Figure 3 Change of Zn contents in soil solution of different soil layers

2.3.3 EDTA及有機(jī)酸對(duì)鎘在不同土層內(nèi)遷移的影響 由圖4可見(jiàn)：對(duì)照土壤溶液中鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終在很低的范圍內(nèi)波動(dòng)。在土壤中添加螯合劑EDTA后，各土層土壤溶液中鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加，對(duì)鎘的活化作用顯著強(qiáng)于有機(jī)酸處理。在添加EDTA后第1天各土層土壤溶液中鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升，且5 cm土層土壤溶液中鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化最大，相比對(duì)照分別增加了353和1 012倍。隨時(shí)間的增加，各土層土壤溶液中鎘與鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)一致。添加有機(jī)酸對(duì)各土層土壤鎘都有活化作用，且表層土壤最顯著，隨時(shí)間的增加鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷降低。在整個(gè)淋洗柱中，土壤溶液中鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨土壤深度的增加而減少。

2.4 土壤溶液中EDTA質(zhì)量濃度的變化

由圖5所知：添加1.5和3.0 mmol·kg－1EDTA后，土壤溶液中EDTA主要集中在5 cm土層。隨著時(shí)間的增加，5 cm土層處EDTA質(zhì)量濃度顯著降低，5 d后達(dá)到穩(wěn)定，分別為110.9～122.9 mg·L－1和257.8～263.3 mg·L－1； 20 cm 土層 EDTA 質(zhì)量濃度為 47.7～55.6 mg·L－1和 84.4～124.5 mg·L－1， 無(wú)顯著變化；40 cm土層EDTA施加第1天達(dá)到最高，分別為22.3和50.7 mg·L－1，之后顯著下降達(dá)到穩(wěn)定；60 cm土層 EDTA 質(zhì)量濃度相對(duì)較小， 分別為 2.9～6.2 mg·L－1和 7.3～10.7 mg·L－1， 差異不顯著。

3 討論

葉綠素?zé)晒馐欠从持参锕夂仙淼囊粋€(gè)指標(biāo)［21］。本研究中，添加3.0 mg·L－1EDTA和有機(jī)酸后毛竹葉片最大熒光Fm，PSⅡ最大光化學(xué)效率Fv/Fm和PSⅡ潛在光化學(xué)效率Fv/Fo顯著降低，表明螯合劑的添加降低了植物的光合生物素，使植物的光合系統(tǒng)遭到破壞。EDTA處理后的毛竹葉片熒光參數(shù)降低，主要原因可能是EDTA活化了土壤中的重金屬，提高了重金屬的生物有效質(zhì)量分?jǐn)?shù)，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的重金屬損害了毛竹的生長(zhǎng)，對(duì)毛竹細(xì)胞內(nèi)葉綠體、線粒體及細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了毒害作用［13,22］。同樣添加有機(jī)酸后也降低了毛竹葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，可能有機(jī)酸分解后改變了土壤的基本理化性質(zhì)，從而改變了毛竹苗的生長(zhǎng)狀況。

圖4 各土層土壤溶液中鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Figure 4 Change of Cd contents in soil solution of different soil layers

圖5 各土層土壤溶液中EDTA質(zhì)量濃度的變化Figure 5 Change of EDTA contents in soil solution of different soil layers

螯合劑可以活化土壤中難溶態(tài)重金屬，改善其生物有效性［7,27］，提高植物對(duì)土壤中重金屬的吸收效率［23－24］。EDTA是一種普遍使用的螯合劑，添加EDTA顯著提高了毛竹對(duì)土壤中鋅、銅和鎘的吸收，作用效果顯著高于有機(jī)酸。這與CAY等［25］研究EDTA強(qiáng)化蜀葵Althaea rosea修復(fù)重金屬污染土壤得出的結(jié)果相似。添加有機(jī)酸并沒(méi)有明顯促進(jìn)毛竹對(duì)重金屬的吸收，可能是由于添加的有機(jī)酸分解后改變了土壤的基本理化性質(zhì)，抑制了毛竹吸收重金屬，這與吳龍華等［26］的研究結(jié)果類似。本研究中，EDTA淋洗顯著增加了0～20 cm土層土壤中可溶性銅、鋅和鎘的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，由于EDTA活化效果強(qiáng)，土壤溶液中銅、鋅和鎘的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)比較高。添加EDTA增強(qiáng)了重金屬的遷移性，導(dǎo)致20和40 cm處土壤溶液中銅、鋅和鎘的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著時(shí)間的增加而增加。YLIVAINIO等［28］研究表明：在石灰性土壤中添加EDTA可持續(xù)提高鎘、鉛和鎳在土壤中的溶解性。在本研究中，添加有機(jī)酸初期對(duì)土壤中銅和鋅的活化效果比較明顯，隨著時(shí)間的推移，活化效果消失甚至產(chǎn)生了鈍化效果?？赡苁怯捎谟袡C(jī)酸在土壤中很快被土壤微生物分解，對(duì)重金屬的活化效果消失，而且可能改變了土壤的pH值，從而產(chǎn)生鈍化效果。吳龍華等［26］研究表明：施加3.0 mmol·kg－1，pH 6.3的草酸、檸檬酸或蘋果酸對(duì)土壤銅含量及其形態(tài)分配無(wú)顯著影響。添加有機(jī)酸后，土壤溶液中銅和鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)在40和60 cm土層處變化不顯著，說(shuō)明添加有機(jī)酸后銅和鋅在土壤中的縱向遷移能力弱；而有機(jī)酸處理對(duì)鎘具有一定的活化和遷移能力。在整個(gè)土柱試驗(yàn)中，EDTA處理對(duì)重金屬的活化和遷移效果始終強(qiáng)于有機(jī)酸。李艷麗等［29］采用土柱模擬淋洗試驗(yàn)，研究了EDTA，檸檬酸和草酸3種淋洗劑對(duì)污染土壤中鎘縱向遷移的影響，結(jié)果表明：EDTA對(duì)鎘的遷移能力強(qiáng)于檸檬酸和草酸。

EDTA添加到土壤后會(huì)長(zhǎng)時(shí)間殘留，并遷移到更深的土壤中，從而對(duì)環(huán)境造成一定的風(fēng)險(xiǎn)［30－31］。有研究表明：可根據(jù)土壤類型，通過(guò)控制EDTA的施用量及施用時(shí)間來(lái)控制EDTA在強(qiáng)化修復(fù)重金屬污染土壤中的殘留和遷移［19］。相比EDTA，有機(jī)酸在自然界中很容易被生物降解，因此它的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)更?。?2－33］。本研究中，EDTA主要集中在表層土壤，但第1天在40 cm土壤溶液中檢測(cè)到相對(duì)較高的質(zhì)量濃度，說(shuō)明EDTA在土壤中遷移能力強(qiáng)。在第5天到第9天EDTA質(zhì)量濃度相對(duì)穩(wěn)定且相對(duì)較高，也說(shuō)明EDTA很難被分解。

4 結(jié)論

乙二胺四乙酸（EDTA）和有機(jī)酸處理抑制了毛竹的葉綠素?zé)晒馓匦裕?0.0 mmol·kg－1有機(jī)酸處理的抑制程度最大，3.0 mmol·kg－1EDTA處理其次，15.0 mmol·kg－1有機(jī)酸處理最小。在整個(gè)土柱試驗(yàn)中，EDTA處理顯著提高了土壤溶液中重金屬質(zhì)量分?jǐn)?shù)，加重了重金屬向下遷移的風(fēng)險(xiǎn)；有機(jī)酸處理對(duì)重金屬的活化效果及在土壤中的遷移能力不明顯。添加EDTA促進(jìn)了毛竹對(duì)銅、鋅、鎘的吸收，而有機(jī)酸則無(wú)促進(jìn)作用。添加1.5和3.0 mmol·kg－1EDTA后，土壤溶液中EDTA質(zhì)量濃度主要集中在5 cm土層，且短期內(nèi)很難被分解。

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