土壤微生物多樣性研究方法及其在土傳病害防治中的應(yīng)用展望

周登博 井濤 陳宇豐 馮仁軍 起登鳳 張妙宜 謝江輝

摘 要 土壤質(zhì)量是影響植物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子，土壤微生物是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)，土壤微生物種群多樣性及優(yōu)勢(shì)菌屬的變化，可以在一定程度上反映出土壤質(zhì)量隨環(huán)境的變化過(guò)程。因此，系統(tǒng)研究土壤微生物的多樣性，不僅是防控植物土傳病害的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，還是改良土壤質(zhì)量的重要內(nèi)容。本文綜述了土壤微生物多樣性的主要研究方法，包括傳統(tǒng)生物化學(xué)、現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)以及高通量測(cè)序方法等，闡述了各種方法的應(yīng)用原理、優(yōu)缺點(diǎn)。從土壤微生態(tài)平衡的角度，對(duì)土壤微生物多樣性研究在土傳病害防控中的應(yīng)用進(jìn)行展望，提出新的研究?jī)?nèi)容與思路，以便更好地應(yīng)用于土傳病害微生態(tài)調(diào)控。

關(guān)鍵詞 土壤 ；微生物多樣性 ；生物化學(xué)技術(shù) ；分子生物學(xué)技術(shù)

中圖分類(lèi)號(hào) S154 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.02.016

Abstract Soil quality is a key factor affecting the growth of a plant， and soil microbes are a key index for evaluation of the soil quality. The change of microbial population diversity and dominant species can reflect to some extent the change of soil quality with the environment. So， systematic research on the diversity of soil microbes is a key step of the control of soil borne diseases and an important subject to improve the soil quality. The main research methods for soil microbial diversity were reviewed， including traditional biochemistry， modern molecular biology techniques and high throughput sequencing method， and the principles， advantages and disadvantages of each method were described. From the aspect of the ecological balance of soil microbes， a prospect was made for the application of soil microbial diversity in the control of soil-borne diseases， and some new ideas for research were put forward in order to conduct micro ecological control of soil-borne diseases.

Keywords soils ； microbial diversity ； biochemical technology ； molecular biology

土壤中生活著數(shù)量龐大的微生物種群，這些種群包括細(xì)菌、真菌、放線菌等，直接參與土壤的生物生化過(guò)程，調(diào)節(jié)土壤生態(tài)系統(tǒng)中碳、氮、磷、鉀、鈣等重要元素的物質(zhì)循環(huán)[1]，同時(shí)還承擔(dān)有機(jī)養(yǎng)分的分解轉(zhuǎn)化、土壤環(huán)境污染物凈化等多種生態(tài)功能[2]，在生態(tài)系統(tǒng)中起著舉足輕重的作用。由于土壤微生物對(duì)環(huán)境變化非常敏感，已成為評(píng)價(jià)土壤養(yǎng)分及生態(tài)質(zhì)量變化最具潛力的生物指標(biāo)之一[3]。近年來(lái)，通過(guò)研究香蕉枯萎病的發(fā)生、擴(kuò)展、蔓延、防控，發(fā)現(xiàn)對(duì)于土傳真菌性病害，可通過(guò)微生物制劑及菌肥、有機(jī)肥、輪作等措施，改良土壤微生物群體結(jié)構(gòu)，有效抑制土傳病害病原菌的繁殖，達(dá)到控制病害的目的。然而，有關(guān)土壤微生物群落多樣性的研究往往費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且不能全面、準(zhǔn)確地反映土壤微生物狀況。一方面是由于用于種類(lèi)測(cè)定的方法和技術(shù)體系尚不成熟，如常規(guī)的分離培養(yǎng)反映的只是1%可以被分離培養(yǎng)的微生物；另一方面是由于土壤微生物對(duì)環(huán)境變化的敏感性，微生物群落會(huì)隨著土壤環(huán)境的時(shí)空變化而變化[4]，給研究帶來(lái)諸多困擾。本文簡(jiǎn)要介紹了目前國(guó)內(nèi)外土壤微生物多樣性的研究方法，對(duì)其原理、優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行闡述，并將改良土壤微生物的理念和技術(shù)帶入土傳真菌病害防控工作中，以期更好地應(yīng)用于實(shí)踐生產(chǎn)。

1 土壤微生物多樣性概述

土壤微生物種類(lèi)多，組成復(fù)雜[5]，與土壤物質(zhì)循環(huán)及能量轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[6]，在生物地球化學(xué)循環(huán)（biogeochemical cycles，BGC）過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[7-8]，并對(duì)土壤中有機(jī)、無(wú)機(jī)養(yǎng)分的轉(zhuǎn)換產(chǎn)生重要的影響[9]。土壤微生物的多樣性主要包括遺傳多樣性、物種多樣性、結(jié)構(gòu)多樣性和功能多樣性等。其中遺傳多樣性是指在基因水平上，土壤微生物不同種群遺傳信息和遺傳物質(zhì)的差異；物種多樣性是指土壤微生態(tài)系統(tǒng)中物種的豐富度和均一度，其中包括可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)2類(lèi)，是反映多樣性最直觀的形式；結(jié)構(gòu)多樣性是指土壤微生物在細(xì)胞組分變化上的多樣性，可直接導(dǎo)致土壤中微生物代謝水平的差異；功能多樣性是指土壤中特定的微生物種群所執(zhí)行的功能差異，如對(duì)植物生長(zhǎng)促生作用、營(yíng)養(yǎng)的分解、轉(zhuǎn)化與傳遞等[10-11]。這四種多樣性從不同角度分析了土壤微生物的微生態(tài)情況，可根據(jù)研究目的，選擇1～2種角度并結(jié)合環(huán)境因子進(jìn)行分析。土壤微生物研究范圍主要有土壤真菌、細(xì)菌、古細(xì)菌等。一般指受到人為或者自然干擾下，微生物的群落結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢(shì)種群消長(zhǎng)、生理代謝、遺傳變異與種群演替等規(guī)律。應(yīng)用在土傳病害研究中，主要指受到病原菌侵染后土壤微生物系統(tǒng)呈現(xiàn)出的一系列變化。土壤微生物系統(tǒng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的系統(tǒng)，是通過(guò)自身遺傳維持相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)功能， 通過(guò)種群、代謝等變異應(yīng)對(duì)外界干擾，共同構(gòu)成土壤微生物系統(tǒng)對(duì)環(huán)境變化或干擾的抵抗力（resistance）和恢復(fù)力（resilience），維護(hù)土壤微生態(tài)系統(tǒng)的相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)[12-13]。通常來(lái)說(shuō)，一個(gè)具有多樣性與活性的微生物群落土壤往往具有較為豐富的土壤養(yǎng)分，這種土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，即可維護(hù)土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，也有利于提高土壤生態(tài)系統(tǒng)的緩沖能力。

2 土壤微生物多樣性的研究方法

目前，土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)研究大多停留在特征定性描述階段，其定量表征研究處于剛剛起步發(fā)展階段。隨著土壤微生物多樣性研究的日益深入，研究方法也在不斷改進(jìn)。主要包括傳統(tǒng)的微生物平板培養(yǎng)法、土壤微生物生物量測(cè)定法、群落水平生理代謝分析法、磷脂脂肪酸PLFA分析法、基于核酸PCR擴(kuò)增基礎(chǔ)上的變性梯度凝膠電泳（DGGE）、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）以及近些年發(fā)展起來(lái)的高通量和高分辨率的宏基因組學(xué)、環(huán)境轉(zhuǎn)錄組學(xué)等。因每一種方法均有優(yōu)缺點(diǎn)，加之土壤微生物的復(fù)雜性，采用單一方法往往不能夠全面、準(zhǔn)確地描述多樣性狀況[9-10]，對(duì)此，應(yīng)盡可能結(jié)合多種方法展開(kāi)研究。

2.1 傳統(tǒng)生物平板培養(yǎng)法

傳統(tǒng)的土壤微生物群落多樣性研究方法主要為平板培養(yǎng)法，是對(duì)土壤微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)后，通過(guò)微生物的生理生化特征或特定的表現(xiàn)型進(jìn)行分析鑒定。但該方法限于人為限定的培養(yǎng)條件，無(wú)法全面地估算微生物群落多樣性，也難以定量描述土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。據(jù)估計(jì)，每克土壤約有4×103～4×104種細(xì)菌[14]，而全球僅細(xì)菌種類(lèi)就達(dá)20萬(wàn)～50萬(wàn)種[15-16]，且其中相當(dāng)大一部分在實(shí)驗(yàn)條件下難以培養(yǎng)[17]；有學(xué)者認(rèn)為傳統(tǒng)的培養(yǎng)法僅能分離1%～10%土壤微生物[18]，甚至認(rèn)為只能分離0.1%～1%土壤微生物[19-20]。此外，平板培養(yǎng)本身就是一個(gè)對(duì)微生物重新選擇的過(guò)程，其結(jié)果并不能全面反映原始土壤微生物群落結(jié)構(gòu)?？梢?jiàn)，傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)難以客觀、正確地反映包括土壤中微生物種別、種群大小、動(dòng)態(tài)變化等許多重要參數(shù)，只有與其他先進(jìn)方法結(jié)合起來(lái)，才能較為客觀而全面地反映微生物多樣性的真實(shí)信息，如Torsvik等[21]發(fā)現(xiàn)熒光顯微計(jì)數(shù)精度就比傳統(tǒng)培養(yǎng)法計(jì)數(shù)高100～1 000倍。

2.2 土壤微生物生物量測(cè)定法

土壤微生物生物量是指土壤中體積小于5×103 μm3的生物總量，主要包括微生物碳、氮、磷[6，22]。土壤微生物生物量作為植物生長(zhǎng)可利用的養(yǎng)分儲(chǔ)存庫(kù)，能敏感、及時(shí)地反映或預(yù)警土壤的變化，曾被用作綜合評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量及土壤微生物活性強(qiáng)度的重要指標(biāo)。有研究表明，施用無(wú)機(jī)氮的同時(shí)加施高C/N比的秸稈，可提高土壤中無(wú)機(jī)態(tài)氮被同化的水平，并通過(guò)土壤微生物生物量的固定，降低無(wú)機(jī)態(tài)氮淋失和揮發(fā)損失，進(jìn)而提高氮肥的利用效率[23]。此外，土壤微生物生物量的變化還受植物生長(zhǎng)狀況、溫度和濕度等環(huán)境因素的影響[24-28]。

土壤微生物生物量測(cè)定法主要包括直接鏡檢法、ATP分析法、底物誘導(dǎo)呼吸法、熏蒸培養(yǎng)法、熏蒸提取法。直接鏡檢法雖然較為原始，但作為最直接的土壤微生物量測(cè)定法，得到了廣泛應(yīng)用。其主要缺陷為一是技術(shù)難度大，易產(chǎn)生較大誤差；二是操作復(fù)雜，要對(duì)不同種類(lèi)微生物的個(gè)體大小進(jìn)行測(cè)定，因此不適宜大批量樣品的測(cè)定。ATP分析法的基本原理為：微生物的細(xì)胞受到外來(lái)物質(zhì)破壞后，用合適的溶劑提取，采用熒光素-熒光素酶法測(cè)定提取液的ATP含量，最后換算成土壤微生物量。其缺點(diǎn)表現(xiàn)為：一，目前常用的三氯乙酸法[29]，ATP的提取率較低；二，土壤質(zhì)地差異越大，微生物ATP含量有可能也隨之變大，需要重新測(cè)定土壤微生物量和ATP之間的轉(zhuǎn)換系數(shù)[30]；三，土壤磷素狀況影響ATP測(cè)定的結(jié)果；四，費(fèi)用昂貴、程序復(fù)雜，影響了方法的普及[29]。底物誘導(dǎo)呼吸法是基于由葡萄糖誘發(fā)的土壤最大呼吸率與土壤微生物量間的良好線性關(guān)系，通過(guò)底物（葡萄糖）誘導(dǎo)活的微生物呼吸放出CO2的量來(lái)間接測(cè)定微生物量。但是該方法容易受土壤含水量及酸堿度的影響。1976年，Jenkinso等[31]提出了熏蒸培養(yǎng)法，該法是根據(jù)被殺死的土壤微生物細(xì)胞因礦化作用而釋放CO2的量激增來(lái)測(cè)定土壤微生物量，操作簡(jiǎn)單，誤差小，適于常規(guī)分析。但該法存在一些弊端，如培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)、不適用于強(qiáng)酸性土壤等。1985年，在熏蒸培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上提出了熏蒸浸提法，利用不同的浸提劑，通過(guò)氧化滴定法來(lái)測(cè)定土壤浸提液中可溶性有機(jī)碳含量，并依據(jù)與微生物量之間存在較穩(wěn)定的比例關(guān)系，計(jì)算微生物量，該方法克服了熏蒸培養(yǎng)法及其它幾種方法的局限，成為目前應(yīng)用比較多的微生物量測(cè)定方法。

2.3 群落水平生理代謝分析法

群落水平生理代謝分析法是利用微生物對(duì)單一碳源吸收利用能力差異來(lái)區(qū)分不同微生物群落的方法，已經(jīng)發(fā)展了幾十年。早在1980年美國(guó)BIOLOG公司就生產(chǎn)出了BIOLOG微平板用于識(shí)別單一微生物群體。BIOLOG微平板主要有GN板、GP板、ECO板等，分別應(yīng)用于革蘭氏陰性好氧菌、革蘭氏陽(yáng)性好氧菌、微生物群落的特性分析。這幾類(lèi)板的研究對(duì)象主要為生長(zhǎng)速度相對(duì)較快的好氧型微生物類(lèi)群[32]。在微生物生態(tài)研究中應(yīng)用最多的為ECO板[33]。BIOLOG微平板的基本原理為，將不同碳源和四哇鹽染料裝于平板內(nèi)的小孔，微生物在利用碳源時(shí)會(huì)產(chǎn)生自由電子，自由電子與染料反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，因利用碳源的種類(lèi)和程度不同，顏色也有深淺之分，由此表征微生物群落結(jié)構(gòu)的差異[34]。GN板、GP板、ECO板分別為95、95、31種碳源，并含有1個(gè)空白對(duì)照孔（不加碳源）。每個(gè)平板3次重復(fù)，原始數(shù)據(jù)為各孔吸光度。該法需要每隔12或24 h讀數(shù)1次，連續(xù)讀數(shù)7 d。3次重復(fù)的數(shù)據(jù)可以直接進(jìn)行顯著性分析。該法具有測(cè)定速度快，重復(fù)性高，系統(tǒng)性好等優(yōu)點(diǎn)。

作為微生物群落水平上的生理特性分析法，目前BIOLOG微平板法已擴(kuò)展到估算諸如碳源利用模式等微生物群落功能多樣性的研究[35-37]、不同土壤及植物根際土壤微生物群落差異性的研究[38-39]、植物內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性的研究[40]，以及轉(zhuǎn)基因植物或外源微生物對(duì)植物根際土壤微生物群落的影響[41-43]。但該方法也有其不足之處，一是BIOLOG微平板法所描述的只是土壤中生長(zhǎng)代謝快或富營(yíng)養(yǎng)型等少部分細(xì)菌群落的活性，不能全面反映微生物群落信息[33，44]，其測(cè)定的土壤微生物種類(lèi)數(shù)量遠(yuǎn)低于實(shí)際數(shù)量，甚至不到16S rDNA方法測(cè)定的微生物數(shù)量的1%；二是BIOLOG微平板中的碳源底物不能代表真實(shí)土壤中的碳源，因此它不能準(zhǔn)確代表原生態(tài)系統(tǒng)中微生物的真實(shí)代謝多樣性[44]；此外，BIOLOG微平板的測(cè)定結(jié)果還會(huì)受到微孔板的類(lèi)型、土壤稀釋液濃度以及稀釋液中干擾物質(zhì)的影響等。為全面可靠獲得土壤微生物群落信息，可將BIOLOG微平板法與其它技術(shù)方法相結(jié)合起來(lái)使用。

2.4 磷脂脂肪酸（PLFA）分析法

磷脂約占細(xì)胞干重的5%，幾乎是所有生物細(xì)胞膜的重要組成成分[45]。由于磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid）只存在于活體細(xì)胞膜中，且不同的磷脂脂肪酸含量相對(duì)恒定，因此它適用于評(píng)價(jià)微生物群落的多樣性及監(jiān)測(cè)微生物群落的動(dòng)態(tài)變化[46]?；玖鞒虨椋眠m當(dāng)?shù)奶崛┫葘⑼寥乐辛字舅崽崛〕鰜?lái)，經(jīng)甲基化后用氣相色譜或氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)，得到PLFA圖譜，統(tǒng)計(jì)分析，即可判斷出土壤微生物群落的多樣性[47]。

目前，PLFA分析法被廣泛應(yīng)用到土壤微生物群落多樣性和生物量的研究，如植被[48]、氣候與季節(jié)[49-50]、肥料[23，51]、耕作方式[52]、土地利用方式[24，44]、有機(jī)污染物[53-54]、重金屬污染[55]等。但PLFA分析法也存在不足之處。一是因不明確土壤中所有微生物的特征脂肪酸，PLFA方法不能用來(lái)分析土壤中部分單個(gè)菌株或種水平上的微生物；二是由于該法是利用標(biāo)記過(guò)的脂肪酸來(lái)分析土壤微生物群落多樣性，標(biāo)記若有變動(dòng)，將造成群落估算出現(xiàn)偏差；三是在不同環(huán)境條件下，細(xì)菌和真菌均能產(chǎn)生不同類(lèi)型的磷脂脂肪酸，環(huán)境的改變有可能引起脂肪酸類(lèi)型的改變[56]；四是耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，在實(shí)際應(yīng)用中往往會(huì)受到一定的限制[57]。

2.5 分子生物學(xué)方法

近年來(lái)，基于微生物群落總基因組DNA提取方法的改進(jìn)，利用微生物DNA進(jìn)行數(shù)量及種類(lèi)分析的技術(shù)得到長(zhǎng)足發(fā)展，如克隆文庫(kù)法、DNA雜交法、G+C含量法、基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的圖譜分析法等。以PCR圖譜為基礎(chǔ)的分析法能夠快速、批量比較多個(gè)樣品間的微生物組成及變化。該方法主要包括：變性/溫度梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）、限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性/擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析（RFLP/ARDRA）、末端標(biāo)記限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA/長(zhǎng)引物隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA/基于高重復(fù)序列的PCR分析（RAPD/ERIC-PCR/rep-PCR）、（自動(dòng)）核糖體基因間隔區(qū)分析（RISA/ARISA）。其中末端限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性是20世紀(jì)末應(yīng)用于環(huán)境微生物方面的新方法，是一項(xiàng)綜合運(yùn)用PCR、DNA限制性酶切、熒光標(biāo)記以及DNA序列自動(dòng)分析的微生物群落分析方法，是通過(guò)測(cè)定特定核酸片段長(zhǎng)度多態(tài)性來(lái)分析比較微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能[58]。具體操作如下：首先，獲得所測(cè)樣品的總DNA，以總DNA為模版，采用5端含有熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)（常用的熒光引物有TET、HEX、6-FAM等），將擴(kuò)增產(chǎn)物用合適的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行消化，由于不同菌種的酶切位點(diǎn)不同，因此會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)度不一的多種限制性酶切片段。采用DNA自動(dòng)測(cè)序儀檢測(cè)消化產(chǎn)物，獲得峰值圖。由于一種菌的末端帶熒光標(biāo)記片段（T-RF）長(zhǎng)度是唯一的，且不同長(zhǎng)度的T-RF片段均可被檢測(cè)到，所以峰值圖中每一個(gè)峰至少代表了一種菌[59-60]。測(cè)定結(jié)果是以峰的高度和面積表示微生物的種類(lèi)和數(shù)量，以此反映待測(cè)微生物群落的組成及時(shí)空變化[61]。T-RFLP方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）高通量。用于微生物的時(shí)空演替研究時(shí)，可以在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量精確、可重復(fù)的數(shù)據(jù)；（2）由于用于片段分析的軟件已經(jīng)提前設(shè)定好，可以快速標(biāo)準(zhǔn)化的統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)輸出為表格形式，避免指紋圖譜再數(shù)字化的程序；（3）通過(guò)與已知數(shù)據(jù)庫(kù)中的T-RF片段比對(duì)，既能定性定量分析，又可直接鑒定到種；（4）精確度、分辨度高[51]；（5） 操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短，工作量大為減少。因此，T-RFLP技術(shù)已被廣泛用于分析各種環(huán)境（如土壤、水樣、腸道等）微生物的群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化[10，62-65]。

然而該方法在實(shí)際應(yīng)用中需要注意以下幾個(gè)問(wèn)題：（1）樣品中微生物總DNA的提取和限制性?xún)?nèi)切酶的選擇至關(guān)重要，試驗(yàn)前需根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?，?duì)不同待測(cè)樣品的提取方法進(jìn)行優(yōu)化，以獲得較高純度的總DNA；（2）限制性?xún)?nèi)切酶的篩選是影響分析結(jié)果的關(guān)鍵因素，需綜合幾種酶切結(jié)果對(duì)多個(gè)圖譜進(jìn)行分析，提高檢出效率。前期對(duì)常用幾種酶進(jìn)行篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，MSPI內(nèi)切酶更合適于土壤微生物總DNA的酶切；（3） T-RFLP技術(shù)在檢測(cè)片段時(shí)只檢測(cè)含有熒光的比較端，但一個(gè)T-RF可能對(duì)應(yīng)著2個(gè)以上菌種，導(dǎo)致檢測(cè)的群落多樣性較低。盡管T-RFLP技術(shù)還有些不足，但仍是目前研究微生物群落結(jié)構(gòu)最常用的分析方法之一[58]。

2.6 高通量測(cè)序技術(shù)

高通量測(cè)序又稱(chēng)為“深度測(cè)序”或“下一代測(cè)序”技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)一次性讀取幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA 分子序列，可對(duì)樣本進(jìn)行全面細(xì)致分析。目前高通量測(cè)序平臺(tái)主要有：454 Life Sciences公司的焦磯酸測(cè)序平臺(tái)、Illumina Solexa的MiSeq和HiSeq測(cè)序平臺(tái)以及Helicos Heliscope TM和Pacific Biosciences推出的單分子測(cè)序技術(shù)。對(duì)于土壤微生物多樣性分析，以454焦磯酸測(cè)序平臺(tái)和Illumina Solexa 的MiSeq測(cè)序平臺(tái)應(yīng)用最多。

454 Life Sciences公司檢測(cè)原理就是依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA測(cè)序。即在PCR反應(yīng)過(guò)程中通過(guò) DNA 聚合酶、雙磷酸酶、熒光素酶的協(xié)同配合，實(shí)現(xiàn)每延伸一個(gè)堿基釋放一次光信號(hào)[66]，測(cè)序平臺(tái)通過(guò)對(duì)光信號(hào)獲取和相關(guān)計(jì)算，得到待測(cè)DNA的堿基序列，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)測(cè)定 DNA 序列的目的。優(yōu)點(diǎn)是讀取片段長(zhǎng)，可以對(duì)樣本的基因組進(jìn)行全面測(cè)序，通量較高。缺點(diǎn)是連續(xù)單堿基重復(fù)區(qū)的判斷準(zhǔn)確度不太高，價(jià)位偏高。

Illumina 公司的MiSeq測(cè)序平臺(tái)是基于Illumina Solexa技術(shù)的第二代高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)，現(xiàn)已成為環(huán)境微生物研究的主要測(cè)序技術(shù)，原理與454 Life Sciences公司的基本一致，不同的是激發(fā)熒光信號(hào)的方式不是通過(guò)焦磷酸氧化熒光素，而是直接在 dNTP 上連接熒光基團(tuán)和阻斷基團(tuán)[61]，也就是將小片段DNA連接在固相上，通過(guò)橋式PCR擴(kuò)增成單分子簇，達(dá)到所需模板量后，將帶有特異熒光堿基（dNTP）加入反應(yīng)體系，進(jìn)而激發(fā)dNTP上熒光基因。該方法的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)通量高、價(jià)格低；缺點(diǎn)是片段相對(duì)較短，序列質(zhì)量不穩(wěn)定，有閱讀偏差，目前已成為土壤微生物研究的主要手段。

3 土壤微生物多樣性研究在土傳病害防治中的應(yīng)用與展望

近幾十年來(lái)，中國(guó)農(nóng)業(yè)迎來(lái)了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，作物產(chǎn)量和質(zhì)量顯著提高，這歸功于農(nóng)業(yè)科技的進(jìn)步，但化肥農(nóng)藥的過(guò)量施用，帶來(lái)了耕地質(zhì)量下降，土傳病害頻發(fā)問(wèn)題。在香蕉枯萎病田間調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，土壤有機(jī)質(zhì)豐富、pH值偏中性的土壤，枯萎病發(fā)生較輕，反之，枯萎病發(fā)生嚴(yán)重。通過(guò)對(duì)健康和發(fā)病土壤微生物進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)健康土壤微生物多樣性更豐富，特別是有益菌如芽孢桿菌、鏈霉菌相對(duì)數(shù)量較多，病原真菌的數(shù)量相對(duì)較少[67-68]。將環(huán)境因子與香蕉園土壤微生物做關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，一些特定的營(yíng)養(yǎng)元素如硼、鋅、磷等與枯萎病的發(fā)生有一定的相關(guān)性，但不同類(lèi)型的土壤營(yíng)養(yǎng)元素相關(guān)性卻不同。田間調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，用殺真菌的藥劑進(jìn)行枯萎病防治效果較差，用殺細(xì)菌藥劑處理后，枯萎病的發(fā)生明顯降低。這可能是由于枯萎病病原菌大量繁殖的同時(shí)引發(fā)特定種類(lèi)細(xì)菌數(shù)量的增加，使用殺細(xì)菌藥劑在一定程度上降低細(xì)菌數(shù)量，與細(xì)菌數(shù)量有正相關(guān)關(guān)系病原真菌數(shù)量也將隨之降低。除枯萎病外，其他土傳病害中土壤微生物種類(lèi)及多樣性與病害發(fā)生為何種關(guān)系，有待進(jìn)一步探究。

可將中醫(yī)綜合調(diào)理理論應(yīng)用于土傳病害防治，即從土壤、植物微生態(tài)系統(tǒng)平衡角度，構(gòu)建有益微生物與病原菌之間的和諧平衡系統(tǒng)，同時(shí)增強(qiáng)植物本身的抗病性（免疫力）。但何為平衡的土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)？如何構(gòu)建健康的土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)？不同作物種類(lèi)、氣候條件、土壤類(lèi)型，土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)會(huì)有顯著不同，同時(shí)也會(huì)有一定的規(guī)律，即相同點(diǎn)。如何通過(guò)大量調(diào)查分析，總結(jié)出相同點(diǎn)與不同點(diǎn)，然后根據(jù)不同作物和土壤進(jìn)行“號(hào)脈”、“抓藥”，有的放矢的對(duì)病害進(jìn)行生態(tài)防控，已成為土傳病害防控亟要解決的首要問(wèn)題。

土壤微生物群體龐大，由于研究目的、土壤環(huán)境、研究對(duì)象不同，會(huì)導(dǎo)致研究結(jié)果不同。要想更全面了解土壤微生物的多樣性，需將上述幾種研究方法結(jié)合起來(lái)使用。如：張秋芳等[69]為了解烤煙施肥技術(shù)對(duì)土壤微生物群落多樣性的影響，應(yīng)用磷脂脂肪酸（PLFA）法，結(jié)合聚類(lèi)分析，揭示土壤微生物群落功能的動(dòng)態(tài)變化。張重義等[70]采用末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）技術(shù)和傳統(tǒng)平板培養(yǎng)的方法，研究地黃連作下根際土壤細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化。張志紅等[67]采用 Biolog Eco 微平板和傳統(tǒng)平板培養(yǎng)的方法，研究不同肥料對(duì)土壤微生物功能多樣性影響。周登博[68]采用Biolog 和T-RFLP 的方法，探索了拮抗菌餅肥發(fā)酵液與土壤消毒劑對(duì)香蕉枯萎病的防控效果及對(duì)土壤微生物的影響?？傊?，不管采用何種研究方法，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法因可通過(guò)肉眼可見(jiàn)方式認(rèn)識(shí)微生物資源的豐富性，成為土壤微生物研究不可或缺的方法之一，同時(shí)現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展也為揭示土壤微生物奧秘的提供了新途徑。然而土壤微生物環(huán)境的復(fù)雜性決定了目前并不能準(zhǔn)確了解土壤中到底存在多少微生物？尤其是特定微生物種群的具體數(shù)量。當(dāng)前土壤微生物研究也只是局限在植物、微生物、土壤之間的互作，將物理、生化因素作為系統(tǒng)研究較少。因此，土壤微生物研究方法還需不斷改進(jìn)和創(chuàng)新。而土壤微生物種群的多樣性是土壤性狀最重要的組成部分之一，因此，在大力倡導(dǎo)化肥農(nóng)藥減施增效的大背景下，通過(guò)正確合理措施，如施用微生物菌肥、菌劑、有機(jī)肥替代部分化肥，調(diào)節(jié)和改善土壤的微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)和多樣性，必定將成為未來(lái)有機(jī)農(nóng)業(yè)的重要發(fā)展方向之一。

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