四環(huán)素基因表達系統(tǒng)的研究進展

尚冰清

（徐州醫(yī)科大學臨床醫(yī)學系院 江蘇 徐州 221006）

基因的表達調(diào)控，涉及到多個因素的互相作用，是一個較為復雜的過程。在基因治療中，如果對目的基因的表達時間和表達水平能進行精準調(diào)控，就能夠有效的降低其副作用的發(fā)生率，提高治療效果，為基因治療提供重要的理論基礎(chǔ)。一般來說，一個理想的可誘導表達系統(tǒng)具有以下特點：特異性、非干擾性、可誘導性、可逆性、劑量依賴性。目前，較為成熟的誘導表達系統(tǒng)有四環(huán)素誘導系統(tǒng)，蛻皮激素誘導表達系統(tǒng)，RU486誘導系統(tǒng)。其中四環(huán)素誘導調(diào)控系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛，本文簡要回顧了其發(fā)展過程和應(yīng)用研究。

1.四環(huán)素調(diào)控的基因表達系統(tǒng)的分子學機制

1.1 Tet調(diào)控系統(tǒng)

1992年，Gossen等最早建立了Tet-off基因調(diào)控系統(tǒng)，該系統(tǒng)是在大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn10中，以Tet阻遏因子(TetR)負性調(diào)控四環(huán)素操縱子為基礎(chǔ)而建立的。含有調(diào)節(jié)質(zhì)粒和反應(yīng)質(zhì)粒兩部分(如圖1.A)。調(diào)節(jié)質(zhì)粒是一個四環(huán)素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子(tTA)，由單純皰疹病毒(HSV)VP16蛋白中含有127個氨基酸的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，AD)與含有207個氨基酸的四環(huán)素阻遏蛋白(TetR)融合而成。反應(yīng)質(zhì)粒包含目的基因和四環(huán)素反應(yīng)元件(Ptet)。Ptet包含7個正向排列的Tet0 序列，含有TATA盒的多克隆位點在其下游，是巨細胞病毒的最小啟動子(minimal CMV promoter，PminCMV)。因為該啟動子缺乏增加子，無四環(huán)素(Tc)或者強力霉素(dox)不存在的情況下，tTA與Ptet特異性結(jié)合，目的基因得以表達。而Tc或dox可特異性結(jié)合tTA，分離tTA與Ptet，阻止下游轉(zhuǎn)錄。

圖1.四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)

在1995年，Gossen等在tTA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了它的反向突變體rtTA，建立了Tet-on調(diào)控系統(tǒng)(如圖1.B)。rtTA與tTA有4個氨基酸發(fā)生了突變，與當有Tc存在時，rtTA才能與Ptet特異性結(jié)合，啟動下游基因的表達。由于活體組織攝取Tc要比清楚快的多，因此在基因轉(zhuǎn)錄方面，Tet-on調(diào)控系統(tǒng)要比Tetoff調(diào)控系統(tǒng)迅速的多。

1.2 Tet調(diào)控系統(tǒng)的優(yōu)點

Tet調(diào)控系統(tǒng)特異性強，且具有較高的誘導效率。特異性的原因尚不明確，猜測是由于四環(huán)素反應(yīng)元件來自原核生物，而原核調(diào)節(jié)蛋白的DNA靶序在真核細胞中是不存在，故其靶序作用很特異。且不影響真核基因組表達。Tet系統(tǒng)在無誘導時，目的基因表達量低甚至無表達，四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)具有低背景表達和高水平誘導兩大特點。此外，相比較于其他系統(tǒng)的誘導因子如激素、熱休克，四環(huán)素作為抗生素，對細胞的毒害性較小。

Tet-off/Tet-on系統(tǒng)能夠有效的控制目的基因表達，尤其是Tet-on系統(tǒng)。但該系統(tǒng)仍不夠完善:rtTA的穩(wěn)定性不能令人滿意，在一些細胞內(nèi)容易降解；更為重要的是基因泄露問題:在非誘導情況下，rtTA與tetO仍具有一定的結(jié)合率，誘導基因表達，致使目的基因的基礎(chǔ)表達水平較高。

2.Tet調(diào)控系統(tǒng)的應(yīng)用

隨著不斷研究和改進，四環(huán)素誘導表達調(diào)控系統(tǒng)可廣泛應(yīng)用于細胞的體外培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因小鼠以及其他動物的誘導性基因表達研究中。誘導性基因表達系統(tǒng)可以在時間上調(diào)控基因的表達，作為基因功能研究重要工具之一。其中的四環(huán)素誘導的基因表達系統(tǒng)，是應(yīng)用最廣泛的一種。在此基礎(chǔ)上相繼建立了雙向啟動子調(diào)控的轉(zhuǎn)基因表達系統(tǒng)、與四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄沉默系統(tǒng)（tTS）以及Cre/loxP系統(tǒng)結(jié)合的誘導性條件性基因敲除系統(tǒng)，它們在研究哺乳動物基因的功能及表達調(diào)控方面發(fā)揮了重要作用[1-2]。

其中，它在基因治療方面的研究得到了廣泛的關(guān)注。

通過tet調(diào)控系統(tǒng)來調(diào)節(jié)GDNF表達來治療帕金森氏病，該系統(tǒng)將會適時決定關(guān)閉基因表達或調(diào)控基因表達來阻止由于細胞異常增殖帶來的不良副作用，如細胞連接錯誤，或釋放出的異常神經(jīng)遞質(zhì)。2009年，Manfredsson等成功驗證了rAAV-TetOff載體在大鼠腦中的有效調(diào)控。相對于病毒載體來說，tet調(diào)控系統(tǒng)僅需較小的誘導劑量，當dox濃度為0.3μg/ml時，GDNF的表達完全消失[3]。然而有研究[4]表明，由于血腦屏障的存在，需要維持較高的血漿 dox濃度而相對較低腦脊液（CSF）來誘導大腦中rtTA2S-M2驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因表達。應(yīng)該避免長期高劑量的dox的毒副作用，因此，在較低dox水平下更活躍的新rtTA變體是可取的。

有研究[5]表明，通過構(gòu)建的以DNA載體介導的能夠高效調(diào)控siRNA沉默基因效應(yīng)的Tet-On基因表達系統(tǒng)，能夠促進其在更多模型系統(tǒng)中進行基因功能研究的應(yīng)用。通過構(gòu)建DNA載體介導的小干擾RNA(siRNA)Tet-on表達載體，pDIRS4.1 siRNA。隨著Dox濃度升高，pDIRS4.1 siRNA載體在人成骨肉瘤細胞中對目的基因的沉默作用有較好的調(diào)控性，且目的基因的表達與Dox具有嚴格的劑量依賴關(guān)系，高濃度Dox時，IL-6表達水平降低約12倍。

此外，有研究[6]表明，通過構(gòu)建攜帶四環(huán)素真核誘導表達系統(tǒng)(Tet-on)調(diào)控的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(hBMP-2)慢病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)，可為骨缺損修復提供可控的成骨活性細胞。構(gòu)建攜帶可調(diào)控系統(tǒng)的感染293T細胞后獲得hBMP-2-GV347慢病毒濃縮液，在DOX誘導下轉(zhuǎn)染后的BMSC細胞增殖能力較普通BMSC強，并在DOX濃度為10μg/ml誘導下穩(wěn)定表達BMP-2蛋白和RNA。

Tet生物功能和催化機制的研究將有助于深入了解與DNA去甲基化途徑相關(guān)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展機制，同時也為研發(fā)全新的抗腫瘤靶向藥物提供參考。

基因治療的目的：是為當前尚無完善的治療方案的疾病提供更為合適的治療方法。目前，國際上已在臨床上試行的基因治療超過300例，包括惡性腫瘤、神經(jīng)性疾病、心血管疾病、感染性疾病和眼病等。迄今為止，已經(jīng)利用腺病毒載體或者逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在I、Ⅱ和Ⅲ期臨床實驗中來治療惡性膠質(zhì)瘤。

四環(huán)素基因調(diào)控系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣的調(diào)控系統(tǒng)，已被用于多種載體中，已經(jīng)被編碼在慢病毒屬、腺病毒屬、腺相關(guān)病毒屬和逆轉(zhuǎn)錄病毒屬，而且可以有效地對基因進行調(diào)控，這增加了Tet系統(tǒng)在不同器官中應(yīng)用的可能性。為增強其安全性，還需繼續(xù)對調(diào)控的嚴密性和特異性進行進一步的改進和發(fā)展。

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