免疫親和固相萃取-超高效合相色譜-串聯質譜法同時測定牛奶中6種玉米赤霉醇類化合物殘留

章璐幸, 孫潔胤, 王延輝, 吳惠芳, 俞松林

(浙江醫(yī)藥高等專科學校, 寧波,315100)

霉菌毒素對食物的污染已引起了人們的廣泛關注。玉米赤霉烯酮(ZON)是一種由鐮刀菌素產生的非甾體類霉菌毒素[1,2]在自然界中主要污染玉米、小麥、大麥、高粱、小米等作物[1]。當奶牛食用了被玉米赤霉烯酮污染的飼料后,易在體內代謝生成α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)和β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL),進而轉移到牛乳中[3]。另外,在奶牛飼養(yǎng)過程中為了讓其增重,不法商販將α-玉米赤霉醇(α-ZAL)用作生長促進劑[4],同時α-ZAL在體內會代謝生成β-玉米赤霉醇(β-ZAL)和ZON[5]。研究表明,玉米赤霉醇類化合物(α-ZAL、β-ZAL、α-ZOL、β-ZOL、ZON和玉米赤霉酮(ZAN))具有弱雌激素效應,當其通過食物鏈進入人體后,可引起人體機能紊亂,甚至影響生育[6]。歐盟規(guī)定玉米赤霉醇等激素類藥物禁止用于畜禽養(yǎng)殖中[7];我國農業(yè)部于2002年規(guī)定玉米赤霉醇在食品動物中不得檢出[8]。

目前對動物源食品中玉米赤霉醇類化合物殘留的主要檢測方法有酶聯免疫吸附法[9]、膠體金免疫層析法[10]、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[11]、高效液相色譜法(HPLC)和超高效液相色譜法(UPLC)及其聯合各種檢測器如紫外(UV)[12]、熒光(FL)[13,14]、質譜(MS)等。酶聯免疫吸附法和膠體金免疫層析法可能存在假陽性結果[6]; GC-MS需將樣品衍生化,操作較為繁瑣；HPLC、HPLC(UPLC)-MS/MS因其成熟穩(wěn)定的技術應用較多[15,16]，但有機溶劑消耗量較大。超高效合相色譜(UPC2)是基于超臨界流體色譜的技術體系[17],該體系以超臨界CO2為主要組成,可以和任意有機溶劑混合組成流動相,依靠流動相的溶劑化能力進行分離分析。與液相色譜相比，UPC2具有黏度低、分子擴散快、分離效率高、綠色環(huán)保的優(yōu)勢[18]。

進行痕量檢測時要盡可能地降低背景干擾,因此對樣品前處理的要求相對較高。常見的前處理方法有液液萃取法(LLE)[1]、固相萃取法(SPE)[19]等。但LLE需要使用大量的有機溶劑,操作繁瑣,費時費力;SPE因其具有有機溶劑使用量小、吸附容量大、分離快速等特點,已成為最常用的萃取手段之一。目前常用于測定玉米赤霉醇類化合物的SPE柱有混合型陰離子交換柱(MAX柱)[20]和親水親脂平衡柱(HLB柱)[21,22]等,但因其不能選擇性的吸附目標分子,在痕量藥物測定過程中可能會引入干擾物。免疫親和柱(IAC)是基于抗原抗體免疫反應原理制成的[23,24],具有較強的專屬性,較好的凈化富集效率,在真菌毒素殘留檢測方面應用較多[25]。Kong等[13]用IAC結合HPLC-FLD和HPLC-MS/MS對國內100多種食品和藥用植物中痕量玉米赤霉醇和玉米赤霉烯酮進行了檢測。孫雪等[2]采用復合免疫親和柱凈化,結合高效液相色譜-串聯質譜,建立了動物源食品中6種黃曲霉毒素和6種玉米赤霉醇類殘留量的測定方法。

本文采用免疫親和固相萃取結合UPC2-MS/MS,建立了同時測定牛奶中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮殘留的檢測方法,為測定乳制品中殘留的玉米赤霉醇類藥物提供方便環(huán)保、快速準確的新途徑,同時也為評價乳制品品質提供了數據參考,為保障我國食品安全提供新思路與新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

ACQUITY UPC2超高效合相色譜儀,包括合相色譜管理器、四元溶劑管理器、柱溫箱管理器、樣品管理器、Xevo TQD三重四極桿質譜檢測器、溶劑補償泵(美國Waters公司); 高速離心機(德國Eppendorf公司);超純水系統(tǒng)(美國PALL公司);十萬分之一分析天平(美國梅特勒公司);渦旋儀(其林貝爾儀器制造有限公司);氮吹儀(上海泉島公司)。

IAC-SEP免疫親和柱(500 ng/1 mL,北京中檢維康技術有限公司);甲醇和乙腈(美國Tedia公司);其他試劑均為分析純。α-ZAL、β-ZAL、α-ZOL、β-ZOL、ZAN和ZON標準品(純度>98%)購自澳大利亞政府國家計量研究所。6種具有代表性品牌的牛奶購自本地超市。

1.2 標準溶液的配制

精密稱取適量6種標準品,用甲醇溶解并稀釋成100 μg/mL的標準儲備液,置于-20 ℃冰箱避光保存。

精密移取上述標準儲備液各1 mL,置于100 mL容量瓶中,用甲醇稀釋,配制成質量濃度為1 μg/mL的混合標準溶液,置于-20 ℃冰箱避光保存。

1.3 樣品前處理

精密吸取牛奶20 mL,置于50 mL離心管中,加入20 mL去離子水,渦旋混勻,然后以8 000 r/min離心10 min,精密移取下層清液30 mL,置于干凈燒杯中,為樣品溶液,備用。

于-3 ℃冰箱中取出免疫親和柱,置于室溫,將柱內保護液放干,然后連接在20 mL玻璃注射器下,精密量取20 mL上述樣品溶液,注入玻璃注射器,以1滴/s的流速緩慢通過免疫親和柱,直至部分空氣通過,再以1～2滴/s的流速用20 mL去離子水淋洗柱子,棄去全部淋洗液,并使部分空氣通過,最后用2.0 mL 0.1%(v/v)乙酸甲醇溶液洗脫,收集洗脫液,用氮氣吹干(50 ℃),用0.5 mL甲醇復溶,過0.22 μm有機濾膜。

1.4 分析條件

色譜柱:ACQUITY UPC2Torus 2-PIC柱(50 mm×3.0 mm, 1.7 μm);柱溫:25 ℃;流動相:(A)超臨界CO2和(B)0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液;流速:1 mL/min。梯度洗脫條件:0～1 min, 0%B; 1～2 min, 5%B～10%B; 2～4 min, 10%B～15%B; 4～6 min, 15%B～0%B; 6～7 min, 0%B。背壓:17.2 MPa;進樣量:2 μL。離子源:ESI-;離子源溫度:150 ℃;毛細管電壓:2.0 kV;錐孔電壓:50 V;脫溶劑氣溫度:450 ℃;脫溶劑氣體流速:800 L/h;錐孔氣體流速:50 L/h;補償溶劑:含0.2%(v/v)氨水的甲醇溶液;流速:0.2 mL/min;在選擇離子監(jiān)測模式下6種玉米赤霉醇類化合物的質譜參數見表1。

表 1 6種玉米赤霉醇類化合物的質譜參數

* Quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱的優(yōu)化

6種玉米赤霉醇類化合物中α-ZAL和β-ZAL、α-ZOL和β-ZOL是兩組同分異構體,這給色譜分離帶來了一定難度。本實驗考察了3種不同填料的ACQUITY UPC2色譜柱(BEH柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、HSS C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)和Torus 2-PIC柱(50 mm×3.0 mm, 1.7 μm))對6種玉米赤霉醇類化合物分離效果的影響(見圖1)。HSS C18色譜柱的填料為全多孔硅膠基質,與常規(guī)C18柱選擇性相近;BEH色譜柱的填料為亞乙基橋雜化顆粒;Torus 2-PIC色譜柱的填料為二氨甲基吡啶鍵合改進的亞乙基橋雜化顆粒,具有較強的選擇性。如圖1所示,采用BEH柱和HSS C18柱時,6種玉米赤霉醇類化合物無法分離;采用Torus 2-PIC柱時,6種玉米赤霉醇類化合物可達到基線分離。因此實驗選用Torus 2-PIC色譜柱。

圖 1 采用不同色譜柱時6種玉米赤霉醇類化合物的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the six zeranols using different columns1. ZAN; 2. ZON; 3. α-ZAL; 4. α-ZOL; 5. β-ZAL; 6. β-ZOL.

2.1.2共溶劑的優(yōu)化

在合相色譜上,共溶劑有兩個作用,一是提高CO2的溶解力,二是可作為強洗脫溶劑,通過調節(jié)共溶劑的種類和比例可改變化合物的保留行為和峰形。為了獲得較好的色譜峰峰形和響應強度,考察了幾種合相色譜上常用的共溶劑:甲醇、異丙醇、甲醇-乙腈(1∶1, v/v)和乙腈。結果表明，采用甲醇時,目標化合物的分離效果良好;其余幾種共溶劑不能完全分離6種玉米赤霉醇類化合物。

在向合相色譜系統(tǒng)中加入添加劑可改善色譜峰峰形及分離度。因此在共溶劑甲醇中添加體積分數為0.05%、0.1%、0.2%的甲酸,考察目標化合物的分離情況。當甲酸的體積分數為0.1%時,目標化合物的色譜峰峰形最尖銳;當甲酸的體積分數為0.2%時,目標化合物的離子響應減弱,可能是過高的酸度導致了離子化效果的抑制。因此實驗選擇0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液作為共溶劑。

2.1.3系統(tǒng)背壓的優(yōu)化

通過背壓的調節(jié)可以改變超臨界流體的密度,從而影響目標化合物的保留時間。實驗考察了不同背壓(10.0、13.8、17.2、20.7 MPa)對分離效果的影響。隨著背壓的升高,CO2密度增大,流動相的洗脫能力增強,各化合物保留時間逐漸縮短。當背壓為17.2 MPa時,目標物的保留時間和分離度均較好;當背壓升至20.7 MPa時,整個系統(tǒng)壓力偏大,且目標化合物的分離度有所減弱。因此實驗選擇17.2 MPa作為系統(tǒng)背壓。

2.1.4柱溫的優(yōu)化

與液相色譜相比,柱溫對合相色譜在保留行為上的影響是相反的,柱溫的升高可使化合物的保留時間延長。這是因為升高溫度會使流動相的密度減弱,洗脫能力降低,從而保留時間延長。實驗考察了不同柱溫(20、25、30、35 ℃)對目標化合物分離效果的影響。當柱溫升高時,6種玉米赤霉醇類化合物的峰形展寬,保留時間延長,響應強度降低。綜合考慮分離度和保留時間等因素,實驗選擇25 ℃作為色譜柱柱溫。

2.1.5補償溶劑的影響

不同的補償溶劑對化合物的離子化效果會產生明顯影響。實驗通過比較無補償溶劑和不同補償溶劑(甲醇、含0.1%(v/v)氨水的甲醇、含0.2%(v/v)氨水的甲醇)對分離效果的影響。在0.2 mL/min的流速下,觀察目標物的響應值。結果表明,有補償溶劑時目標化合物的響應值明顯高于無補償溶劑時目標化合物的響應值,且含0.2%(v/v)氨水的甲醇作為補償溶劑時目標化合物的響應值最大。

在優(yōu)化后的色譜條件下6種玉米赤霉醇類化合物的提取離子色譜圖見圖2。

圖 2 6種玉米赤霉醇類化合物的提取離子色譜圖Fig. 2 Extracted ion chromatograms of the six zeranols1. ZAN; 2. ZON; 3. α-ZAL; 4. α-ZOL; 5. β-ZAL; 6. β-ZOL.

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1提取凈化方法的選擇

實驗考察了不同的提取凈化方法對目標化合物回收率的影響。采用農業(yè)部1025號公告[26]中提到的方法,用18%(v/v)硫酸溶液對牛奶中玉米赤霉醇類化合物進行沉淀蛋白質,再用正己烷和乙腈分離提取,最后用NaOH反萃取后過免疫固相萃取柱,玉米赤霉醇類化合物的提取回收率較低,為58.3%～72.4%;采用乙腈直接沉淀蛋白質的方法對目標化合物進行處理,提取回收率反而更低,為39.8%～65.4%。考慮免疫親和柱中的固定相主要以蛋白質的形式(抗體)存在,其狀態(tài)最佳時的pH范圍在7.4左右,且有機溶劑的含量需保持在20%以下。因此以上兩種方法待凈化溶液的pH及有機溶劑的含量對免疫親和柱中的抗體產生了影響,降低了其富集目標化合物的能力。另外在沉淀蛋白質的同時可能將目標物包裹著一起沉淀,導致提取回收率降低。最后決定對牛奶樣品不沉淀蛋白直接過免疫親和柱。已有文獻[27]表明,牛奶樣品如果直接過柱,其中含有的脂肪會掩蓋抗體,導致回收率偏低,且不經稀釋的牛奶樣品過于黏稠,會發(fā)生柱子堵塞等問題,因此將牛奶和水按體積比1∶1稀釋,經8 000 r/min離心后,移取下清液直接過柱,目標化合物的回收率為72.3%～102.1%,因此實驗選擇此方法作為提取凈化方法。

2.2.2上樣量的優(yōu)化

由于牛奶中玉米赤霉醇類化合物的含量極低,因此有必要將殘留物富集濃縮,以達到檢測器靈敏度的要求。實驗比較了不同質量濃度(0.5、1.0、5.0 ng/mL)的上樣液在不同上樣體積(5、10、20 mL)的條件下對目標化合物回收率的影響。當上樣體積為20 mL時,6種目標化合物在3個濃度水平下的提取回收率均能達到75%以上。因此實驗選擇20 mL作為上樣體積。

2.2.3淋洗溶劑的優(yōu)化

為了盡可能減少干擾物對系統(tǒng)基質和目標物的影響,實驗分別選擇去離子水、甲醇、乙腈為清洗溶劑,在用量均為20 mL的條件下進行提取回收試驗,添加水平為1.0 ng/mL。結果表明,去離子水對6種玉米赤霉醇類化合物的回收率幾乎無影響,均在75%以上,而當乙腈和甲醇作為清洗劑時,目標化合物的回收率下降到20%以下。因此實驗選擇去離子水為清洗劑,用量為20 mL。

2.2.4洗脫溶劑的優(yōu)化

在固相萃取過程中,將目標物最大限度的洗脫下來是整個固相萃取的關鍵。實驗考察了甲醇、乙腈、1%(v/v)乙酸甲醇、1%(v/v)乙酸乙腈4種洗脫溶劑對目標化合物(添加水平為1.0 ng/mL)提取回收率的影響。結果表明,用乙腈洗脫時,目標化合物的回收率為33.3%～53.4%,且有輕微基線噪聲變大的現象;用1%(v/v)乙酸乙腈洗脫時,回收率為45.1%～87.4%,基線噪聲明顯增大;當用甲醇洗脫時,α-ZOL的回收率為55.6%;當用1%(v/v)乙酸甲醇洗脫時,α-ZOL的回收率提高至75.3%,其余5種目標物的回收率均在82.0%以上。因此實驗選擇1%(v/v)乙酸甲醇溶液作為洗脫溶劑。

2.3 方法學考察

2.3.1線性范圍、檢出限和定量限

在1.4節(jié)條件下,對質量濃度為1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL的6種玉米赤霉醇類混合標準溶液進行測定,以峰面積為縱坐標(y)、對應的質量濃度(x, ng/mL)為橫坐標繪制標準曲線(見表2)。結果表明,各化合物在其線性范圍內呈現較好的線性關系,相關系數(r2)均≥0.995 7。以定量離子信噪比(S/N)≥3計算方法的檢出限,為0.25～2.04 ng/mL,以S/N≥10計算方法的定量限,為0.51～5.10 ng/mL,可以看出,本方法的靈敏度整體上高于文獻[28,29]報道的采用HPLC測定玉米赤霉醇類殘留的方法(檢出限為1～45 ng/mL,定量限為3.5～100 ng/mL),但略低于采用HPLC-MS/MS測定玉米赤霉醇類殘留的方法(檢出限為0.01～0.10 ng/mL,定量限為0.04～1.0 ng/mL)[1-3,5]。

表 2 6種玉米赤霉醇類化合物的線性范圍、線性方程、

y: peak area;x: mass concentration, ng/mL.

2.3.2基質效應(ME)的考察

取空白牛奶樣品,按1.3節(jié)描述處理后,用1 mL系列混合標準溶液(1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL)溶解殘渣,渦旋混勻,過0.22 μm濾膜,供測定。

將基質混合標準曲線和溶劑混合標準曲線的斜率分別記為K1和K2,根據公式(1)計算基質效應：

ME=(K1/K2-1)×100%

(1)

結果表明,牛奶基質中玉米赤霉醇類化合物的基質效應為-5%～7%,可以忽略不計,因此可用混合標準溶液做標準曲線,采用外標法定量。

2.3.3回收率

精密移取50、100、500 μL 1 μg/mL混合標準溶液,分別置于100 mL量瓶中,用空白牛奶稀釋至刻度,即為加標水平為0.5、1.0、5.0 ng/mL的加標牛奶溶液,每個水平做3份平行樣品,進行加標回收試驗,具體結果見表3。由表3可知,牛奶基質中6種目標化合物的平均回收率為75.9%～106.5%,相對標準偏差為3.2%～12.3%,表明本法在樣品前處理及測定中有較好的回收率和精密度,適用于牛奶基質中玉米赤霉醇類化合物殘留的檢測。

表 3 6種玉米赤霉醇類化合物的加標回收率和相對

表 4 6種玉米赤霉醇類化合物的日內和日間精密度

2.3.4日內和日間精密度

按2.3.3節(jié)描述配制加標牛奶溶液,每個水平做5份平行樣品,按1.3節(jié)方法制備樣品溶液,連續(xù)測定3天,得到日內和日間精密度,結果見表4。由表4可知,6種玉米赤霉醇類化合物的日內精密度為3.3%～11.2%(n=5),日間精密度為4.8%～11.4%(n=3)。

2.3.5實際樣品測定

在本地超市購買了6份國內不同牛奶企業(yè)生產的牛奶,對其進行測定,結果表明,其中一份樣品含有玉米赤霉烯酮0.085 ng/mL,其余均未檢出。陽性樣品的色譜圖見圖3。

圖 3 陽性樣品的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of a positive sample

3 結論

建立了一種免疫親和固相萃取結合UPC2-MS/MS同時測定牛奶中6種玉米赤霉醇類化合物殘留的分析方法。該法專屬性好,基質效應小,與傳統(tǒng)固相萃取法相比前處理操作簡單，快速,無有機溶劑的使用。

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