大鯢黏液糖蛋白的抗氧化及防紫外作用

董渭雪， 陳德經(jīng)，2*， 辛 茜， 楊 慧

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院， 陜西 漢中 723000;2.陜西理工大學 陜西省資源生物重點實驗室， 陜西 漢中 723000)

大鯢(Andrias davidianus )屬大型兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科，又叫“娃娃魚”，國家二級保護兩棲野生動物。大鯢皮膚腺體主要有兩種:液腺和顆粒腺，皮膚腺體中的黏液腺體細胞釋放的物質(zhì)與水結(jié)合后形成黏液[1]。糖蛋白是一種長度較短，由帶有分支的寡糖和多肽鏈通過共價結(jié)合而形成的物質(zhì)[2]，在自然界中，糖蛋白廣泛存在于動物、植物和一些微生物中，是生命活動的重要物質(zhì)，細胞的識別及體內(nèi)功能多為糖蛋白介導，以不同的形態(tài)存在于生物體內(nèi)發(fā)揮著作用，且糖蛋白是細胞膜、血漿、激素、細胞間基質(zhì)的重要組成部分[3]。有文獻報道，從大鯢黏液中分離得到的糖蛋白具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗炎、降血糖、降血脂、抗氧化、防衰老等功效。徐偉良[4]通過對大鯢黏液組分分析發(fā)現(xiàn)其主要成分包括糖、脂肪、蛋白質(zhì)，其中黏液蛋白中含有甘露糖、葡萄糖醛、半乳糖醛酸、N-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖和半乳糖共6種單糖組分，共檢測出17種氨基酸，且氨基酸總含量為61.86%。大氣中臭氧層每遞減1%，皮膚癌的發(fā)病率就會上升3%，造成日光性皮炎甚至皮膚癌患者明顯增加[5]。有科學家對從藻膽中分離出的蛋白進行體外抗紫外輻射活性實驗，發(fā)現(xiàn)其對UVA輻射損傷的小鼠纖維細胞具有修復作用[6]。唐倩[7]通過測定不同紫外輻照時間對胞外多糖抗輻射率的影響得出多糖是一種生物活性物質(zhì)，具有清除自由基和抗氧化的作用，可以有效地改善和提高機體的免疫能力以及許多方面的生理功能。

本文旨在研究大鯢黏液糖蛋白對DPPH·自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除作用，以及檢測大鯢黏液糖蛋白保護大腸桿菌抵抗紫外線影響的能力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

大鯢黏液凍干粉(自制);NaOH、無水乙醇(天津市耀華化學試劑有限責任公司);抗壞血酸(成都市科龍化工試劑廠);DPPH·(北京索萊寶科技有限公司);三羥甲基氨基甲烷(上海源葉生物科技有限公司);正丁醇(天津市天力化學試劑有限公司);氯仿(天津市外環(huán)化工有限公司);胰蛋白胨、酵母浸提物、瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司)，以上試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

SB-3200DTD超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司);LC-800低速離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司);RE52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);AL204萬分之一電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司);UV-1550紫外可見分光光度計(島津公司);SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司);LGJ-10B凍干機(北京四環(huán)科學儀器廠有限公司);THZ-82恒溫震蕩培養(yǎng)箱(金壇市科析儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鯢黏液糖蛋白的提取

堿提：稱取50.000 g大鯢黏液凍干粉，以0.4 mol/L的NaOH溶液，料液比為1∶20，溶解黏液，在45 ℃下水浴提取2 h，提取液以4000 r/min離心15 min，回收上清液200 mL。

醇沉：上清液中加入無水乙醇，至終濃度為76%，用稀HCl調(diào)節(jié)溶液pH至7.0左右，置于4 ℃冰箱中靜置醇沉8 h。離心去除上清液，將糖蛋白沉淀用無水乙醇洗滌3次后，真空干燥得大鯢黏液糖蛋白粗品[4]。Sevage法脫蛋白：按體積比3∶1將Sevage溶液(氯仿∶正丁醇=3∶1)與粗多糖溶液一起加入分液漏斗中，劇烈搖晃15 min，溶液以4000 r/min離心15 min，棄去中間層的變性蛋白與下層的溶液，上述做法重復3次，得到較高純度的糖蛋白溶液。最后對糖蛋白溶液進行真空冷凍干燥48 h。并利用以下公式計算得率：

(1)

1.3.2大鯢黏液糖蛋白的抗氧化活性檢測

1.3.2.1 清除DPPH·自由基的檢測方法

用蒸餾水配制濃度為0、0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 mg/mL大鯢黏液糖蛋白溶液，將梯度稀釋的樣品溶液各取3 mL，分別加入到3 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液中，充分混勻，然后避光靜置30 min，其中空白組為蒸餾水，陽性對照為抗壞血酸。最后使用紫外分光光度計在波長516 nm處測定樣品的吸光值，每一個樣品做3組平行樣。按照下式計算不同濃度待測物的DPPH自由基清除率[8]:

(2)

式中A0為空白組的吸光度,A為樣品溶液的吸光度。

1.3.2.2 清除超氧陰離子自由基(O2-·)的檢測方法

用蒸餾水配濃度為0、0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 mg/mL大鯢黏液糖蛋白溶液，將梯度稀釋的樣品溶液各取1 mL于試管中，然后加入4.5 mL Tris-HCl緩沖液和0.1 mL濃度為3 mmol/L的鄰苯三酚溶液，于25 ℃條件下反應5 min，最后加入1 mL濃度為8 mmol/L的HCl溶液使得反應終止，其中空白組為蒸餾水，陽性對照為抗壞血酸，使用紫外分光光度計在波長298 nm處測定樣品的吸光值，每一個樣品做3組平行樣[1]。按照(2)式計算不同濃度待測物的超氧陰離子自由基清除率。

1.3.2.3 清除羥基自由基(·OH)的檢測方法

用蒸餾水配制大鯢黏液糖蛋白，濃度分別為0.00、0.20、0.60、1.00、1.40、1.80 mg/mL，將梯度稀釋的樣品溶液各取2 mL于試管中，分別加入2 mL濃度為6 mmol/L的FeSO4溶液、2 mL濃度為6 mmol/L的水楊酸乙醇溶液，最后加入2 mL濃度為8 mmol/L的H2O2溶液使得反應啟動，于37 ℃下水浴加熱30 min后，取出試管使反應終止，其中空白組為蒸餾水，陽性對照為抗壞血酸，使用紫外分光光度計在波長510 nm處測定樣品的吸光值，每一個樣品做3組平行樣[9]。按照(2)式計算不同濃度待測物的羥基自由基清除率。

1.3.3 大鯢黏液糖蛋白的抗紫外性試驗

稱取0.200 g黏液糖蛋白，用蒸餾水定容至50 mL，將一組溶液放在平皿中在紫外燈下進行長時間照射(0、10、20、30、40、50、60 min)，另一組溶液在紫外燈下進行短時間照射(0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 s)，然后在280 nm測定兩組溶液的吸光度，繪制吸光值變化曲線。

1.3.4 大腸桿菌評價大鯢黏液糖蛋白抗紫外作用

1.3.4.1 菌種的選育

大腸桿菌有清楚的遺傳背景，具有成本低、易于培養(yǎng)、繁殖速度快等優(yōu)點，所以本實驗選用腸桿菌科代表菌種大腸埃希氏菌作為接受紫外輻射的細菌載體，用來評價大鯢黏液糖蛋白抗紫外作用。

1.3.4.2 制備培養(yǎng)基

使用LB固體培養(yǎng)基，依照標準配方稱取胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、瓊脂粉20 g，量取900 mL蒸餾水將上述試劑依次加入，并且對溶液進行加熱使其完全溶解，使用濃度為1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7，然后加入蒸餾水至培養(yǎng)基體積為1000 mL，高溫高壓滅菌20 min后倒平板，最后將培養(yǎng)基置于無菌操作臺冷卻至室溫。

另外試驗中還使用到了LB液體培養(yǎng)基，依照標準配方分別稱取胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，將上述試劑依次加入900 mL蒸餾水，并且對培養(yǎng)基進行加熱使其完全溶解，使用濃度為1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基pH至7，加入蒸餾水至培養(yǎng)基體積為1000 mL，以每個試管4 mL的量將制備好的液體培養(yǎng)基倒入，高溫高壓滅菌20 min。最后將所有試管密封放置于無菌操作臺。

1.3.4.3 大腸桿菌菌懸液的制備

從冰箱中取出保存的大腸桿菌凍干粉，活化后，將菌懸液接種于預先配置好的LB液體培養(yǎng)基里，放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至OD值為0.8。

1.3.4.4 測定大腸桿菌紫外照射存活率

將試管中的菌懸液進行梯度稀釋10、100、1000倍，每3個梯度為一組，共10組。將試管放在距離紫外燈30 cm處，對每一組試管進行時長為0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 s的紫外燈照射，然后進行涂布平板，最后將所有平皿放入生化培養(yǎng)箱進行35 ℃、24 h恒溫培養(yǎng)，24 h后利用平板計數(shù)法計數(shù)。細菌紫外照射存活率公式：

(3)

1.3.4.5 測定加入黏液糖蛋白后的大腸桿菌紫外照射存活率

重復實驗步驟1.3.4.1、1.3.4.2、1.3.4.3，將試管拿出震蕩培養(yǎng)箱之后，在菌懸液各取1 mL，加入7 mL濃度分別為0.9 mg/mL、1.8 mg/mL的黏液糖蛋白溶液中，然后重復步驟1.3.4.4[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1大鯢黏液糖蛋白的提取結(jié)果

提取出1.66 g大鯢黏液糖蛋白，根據(jù)式(1)計算大鯢黏液糖蛋白得率為3.32%。

2.2 大鯢黏液糖蛋白抗氧化能力測定

2.2.1 清除DPPH·自由基檢測結(jié)果

測定大鯢黏液糖蛋白和抗壞血酸對DPPH·自由基的清除作用結(jié)果如表1所示，可知大鯢黏液糖蛋白對DPPH·有清除作用，并且蛋白的抗氧化能力隨濃度的增大而增大，且在濃度為0.14 mg/mL后上升趨勢趨于平緩，但是抗氧化效果沒有抗壞血酸的抗氧化效果強。

表1 DPPH·自由基的清除率

2.2.2 清除超氧陰離子自由基(O2-·)的檢測結(jié)果

測定大鯢黏液糖蛋白和抗壞血酸對超氧陰離子自由基(O2-·)的清除作用結(jié)果如表2所示，可知大鯢黏液糖蛋白對超氧陰離子自由基有清除作用，并且蛋白的抗氧化能力在大鯢黏液糖蛋白濃度小于0.14 mg/mL時呈一定的量效關(guān)系，且在濃度低于0.02 mg/mL時上升趨勢較為平緩，從表中可明顯看出濃度從0.14 mg/mL后清除率出現(xiàn)下降，猜測是因為濃度變大導致溶液吸光度變大，從而清除率減小，但是抗氧化效果沒有抗壞血酸的抗氧化效果強。

表2 超氧陰離子自由基(O2-·)的清除率

2.2.3 清除羥基自由基(·OH)的檢測結(jié)果

測定大鯢黏液糖蛋白和抗壞血酸對羥基自由基(·OH)的清除作用結(jié)果如表3所示，可知大鯢黏液糖蛋白對羥基自由基有清除作用，并且蛋白的抗氧化能力隨濃度的增高而增高，且濃度大于0.2 mg/mL后上升趨勢明顯增大，但是抗氧化效果沒有抗壞血酸的抗氧化效果強。

表3 羥基自由基(·OH)的清除率

2.3 大鯢黏液糖蛋白的抗紫外性實驗結(jié)果

測定長時間紫外照射下大鯢黏液糖蛋白的抗紫外作用結(jié)果如圖1所示，大鯢黏液糖蛋白在紫外燈下照射10 min內(nèi)其吸光度上升較快；在往后的50 min內(nèi)上升趨勢較為平緩。大鯢黏液糖蛋白的吸光度隨著紫外燈照射時長的增加而增大，說明大鯢黏液糖蛋白能夠吸收紫外線，因此具有抗紫外能力，保護載體不受紫外線傷害。

測定短時間紫外照射下大鯢黏液糖蛋白的抗紫外作用結(jié)果如圖2所示，大鯢黏液糖蛋白經(jīng)紫外燈照射后吸光度整體呈上升趨勢，在10～30 s吸光度上升趨勢緩慢，30～90 s吸光度快速上升。對比圖1可知，該上升趨勢會繼續(xù)維持。

圖1 長時間紫外照射大鯢黏液糖蛋白吸光度 圖2 短時間紫外照射大鯢黏液糖蛋白吸光度

2.4 保護大腸桿菌抵御紫外效果實驗結(jié)果

圖3 紫外照射大腸桿菌的存活率

測定大鯢黏液糖蛋白保護大腸桿菌抵御紫外效果實驗結(jié)果如圖3所示，空白組在10 s時存活率為95.61%，存活率小幅度下降，在10～30 s存活率從95.61%直線下降到25.98%，出現(xiàn)了大幅度的下降，在30～90 s存活率仍在下降但趨勢趨于平緩，90 s時存活率降至0.98%；樣品濃度為0.9 mg/mL時，照射時長20 s以內(nèi)細菌存活率小幅度下降，照射時長20～40 s細菌存活率出現(xiàn)大幅度下降，照射時長40 s后細菌存活率下降趨勢又趨于平緩；樣品濃度為1.8 mg/mL時，30 s之前存活率小幅度下降，但都高于90%，30～60 s細菌存活率大幅度下降，60 s后下降趨勢又趨于平緩。對比3組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的存活率最終接近于0是必然趨勢，而樣品組的大腸桿菌存活率均大于空白組，證明大鯢黏液糖蛋白有抗紫外作用，一定程度上減緩了大腸桿菌的死亡時間；樣品濃度為1.8 mg/mL時的細菌存活率大于樣品濃度為0.9 mg/mL時的細菌存活率，證明大鯢黏液糖蛋白的抗紫外作用與濃度呈正相關(guān)的量效關(guān)系。并且本實驗也進一步驗證了2.3中“大鯢黏液糖蛋白能夠吸收紫外線，因此具有抗紫外能力，保護載體不受紫外線傷害”這一結(jié)論。

3 結(jié) 論

(1)本實驗采用堿提法從大鯢黏液凍干粉中提取大鯢黏液糖蛋白，提取率為3.32%。

(2)通過對大鯢黏液糖蛋白抗氧化活性的檢測結(jié)果分析可得，大鯢黏液糖蛋白具有還原力，對DPPH·自由基、超氧陰離子自由基以及羥基自由基具有清除作用，且抗氧化活性均低于VC。

(3)大腸桿菌的存活率最終接近于0是必然趨勢，而大鯢黏液糖蛋白有抗紫外作用，一定程度上減緩了大腸桿菌的死亡時間，且大鯢黏液糖蛋白的抗紫外作用與濃度呈正相關(guān)的量效關(guān)系。

[ 參 考 文 獻 ]

[1] 徐偉良,陳德經(jīng),魏泓，等.大鯢皮膚黏液的抗氧化性及安全性評價研究[J].陜西理工學院學報(自然科學版),2015,31(2):56-61.

[2] 郭慧,鄧文星,張映.糖蛋白的研究進展[J].生物技術(shù)通報,2009,10(3):16-19.

[3] 陳德經(jīng),徐偉良,蘇文，等.大鯢皮膚粘液多糖的提取及單糖組成分析[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2015,27(3):1700-1705.

[4] 徐偉良.大鯢皮膚粘液糖蛋白的提取純化及抗肺癌活性研究[D].漢中：陜西理工大學,2014.

[5] 陳光勇,陳旭冰,劉光明.紫外線和防曬化妝品[J].山東化工,2006,35(4):17-20.

[6] 葉翠芳,楊珂,張美英，等.藻膽蛋白的提取純化及其體外抗紫外活性[J].暨南大學學報(自然科學與醫(yī)學版),2013,34(5)：522-526.

[7] 唐倩.具鞘微鞘藻胞外多糖的提取及抗紫外輻射活性研究[D].衡陽：南華大學,2010.

[8] 韋獻雅,殷麗琴,鐘成，等.DPPH法評價抗氧化活性研究進展[J].食品科學,2014,35(9):317-322.

[9] 師超,林江濤,卞科.黃肉甘薯糖蛋白的抗氧化作用研究[J].安徽農(nóng)學通報,2013,9(18):18-35.