富硒玉米肽對撲熱息痛致小鼠肝損傷的防護(hù)作用

趙娟娟，熊匯竹，劉維維，石 文，何 慧*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，環(huán)境食品學(xué)教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

撲熱息痛（acetaminophen，APAP）是應(yīng)用最廣泛的解熱鎮(zhèn)痛藥，采用治療劑量時是安全的，但是急性或蓄積性地過量使用則會導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷，并有可能進(jìn)一步發(fā)展成肝衰竭[1]。藥物代謝動力學(xué)研究表明，在正常情況下，APAP進(jìn)入體內(nèi)后大部分在肝臟中經(jīng)尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（uridine diphosphatedependent glycosyltransferase，UGT）和磺基轉(zhuǎn)移酶（sulfotransferase，SULT）的作用，分別與葡萄糖醛酸和硫酸結(jié)合后，代謝為無毒化合物——APAP-葡萄糖醛酸酯和APAP-硫酸鹽，繼而由膽汁和腎臟排出；另有少量在細(xì)胞色素P450酶系的參與下，代謝為毒性物質(zhì)N-乙酰-對-苯醌亞胺（N-acetyl-p-benzoquinone imine，NAPQI）[2]。在治療劑量下，NAPQI與谷胱甘肽（glutathione，GSH）結(jié)合，形成半胱氨酸衍生物和硫醇尿酸而解毒。若給予過量的APAP，生成的NAPQI超過體內(nèi)GSH能處理的量時，可造成機(jī)體內(nèi)NAPQI堆積，NAPQI具有親電性和很強(qiáng)的氧化作用，可與肝細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)共價結(jié)合，使生物膜系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化[3-4]，引起肝細(xì)胞壞死[5-7]。此外，APAP致肝損傷的機(jī)制還與氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)有關(guān)。因此，可抑制細(xì)胞色素P450酶活性，減少APAP通過細(xì)胞色素P450酶的代謝[8-9]，增加機(jī)體GSH含量和抗氧化能力，均有緩解或預(yù)防APAP引起的肝損傷的作用[10-12]。水飛薊素是一種有效的抗氧化劑，可通過保護(hù)肝細(xì)胞膜，促進(jìn)肝細(xì)胞的自我修復(fù)及再生等作用發(fā)揮保肝功效，是目前世界上發(fā)現(xiàn)的最具肝臟疾病療效的類黃酮物質(zhì)。

本實驗室先前的研究發(fā)現(xiàn)，富硒玉米肽（seleniumenriched corn peptides，SeCPs）可以提高機(jī)體GSH的供應(yīng)量，且具有抗氧化活性及保護(hù)肝臟的作用[13]，至于SeCPs是否具有拮抗APAP致肝損傷的作用目前鮮有報道，故本研究采用APAP致小鼠肝損傷模型，通過考察SeCPs對代謝APAP各相關(guān)酶指標(biāo)的影響及觀察小鼠肝臟病理學(xué)變化，以期闡明SeCPs對APAP致肝損傷模型鼠的保護(hù)作用，并分析其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料及試劑

昆明種雄性小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，SPF級，購于湖北省疾病預(yù)防控制中心實驗動物中心。許可證號：SCXK（鄂）2011-0012。

富硒玉米通過在玉米植株葉面噴施硒肥得到，硒含量為2.192 mg/kg；SeCPs實驗室自制（分子質(zhì)量小于5 kDa，肽含量為95.05%，有機(jī)硒含量32.37 mg/kg）；堿性蛋白酶（Alcalase 3.0 T，24萬 U/g） 丹麥諾維信公司；亞硒酸鈉（Na2SeO3，純度≥98%） 德國Sigma-Aldrich公司；水飛薊素膠囊 德國馬博士大藥廠；對乙酰氨基酚片 北京曙光藥業(yè)有限責(zé)任公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒南京建成生物工程研究所；細(xì)胞色素P4502E1（cytochrome P4502E1，CYP2E1）、細(xì)胞色素P4501A2（cytochrome P4501A2，CYP1A2）、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）、UGT、SULT試劑盒 上海源葉生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ML20型電子天平、FE20實驗室pH計 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；TDZ5-W臺式低速離心機(jī)湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Microfuge 20R高速冷凍離心機(jī) 貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司；LGJ-12冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；Laborota 4000 eきcient旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 德國Heidolph公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 武漢亨泰達(dá)儀器設(shè)備有限公司；全波長酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；MWCO 5 kDa再生纖維素卷式膜包（有效膜面積0.09 m2） 美國Millipore公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；AFS-822型原子熒光光度計北京吉天儀器有限公司；DM3000熒光顯微鏡 徠卡儀器（德國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米肽的制備

玉米籽粒磨碎得玉米粉，以1∶13（m/V）的比例加入堿醇液（0.1 mol/L NaOH與體積分?jǐn)?shù)95%乙醇的比例1∶1，V/V），于45 ℃下水浴攪拌提取2 h，離心得上清液，調(diào)pH值至6.3左右，靜置并離心，所得沉淀凍干即為玉米蛋白粉。取適量玉米蛋白粉，按1∶35（m/V）的比例加入蒸餾水，在60 ℃，pH 8.0的條件下用堿性蛋白酶（酶與底物比值為0.6%，m/m）在恒溫加熱磁力攪拌器中酶解4 h。將所得酶解液進(jìn)行超濾，取分子質(zhì)量小于5 kDa的產(chǎn)物，濃縮，冷凍干燥，得SeCPs，硒含量為32.37 mg/kg，保存于干燥器中備用。

1.3.2 動物分組及模型的建立

將70 只體質(zhì)量為（20±2）g的昆明種雄性小鼠隨機(jī)分成7 組，每組10 只，分別為正常對照組、APAP模型組、水飛薊素陽性對照組（50 mg/kg mb）、玉米肽組（corn peptides，CPs。400 mg/kg mb）、亞硒酸鈉組（Na2SeO3，28.36 μg/kg mb）、亞硒酸鈉+玉米肽組（Na2SeO3+CPs，28.36 μg/kg mb+400 mg/kg mb）、SeCPs組（SeCPs，400 mg/kg mb），其中玉米肽組、亞硒酸鈉+玉米肽組及富硒玉米肽組的肽含量相同，亞硒酸鈉組、亞硒酸鈉+玉米肽組及SeCPs組的硒含量相同。各組均以小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。室溫25 ℃下適應(yīng)7 d后，開始灌胃，每天灌胃1 次，正常對照組和模型組每日灌胃等劑量生理鹽水，小鼠每兩天稱1 次體質(zhì)量，連續(xù)灌胃14 d。于第15天，小鼠禁食12 h，按上述劑量灌胃1次，2 h后，除正常組外其余組均腹腔注射280 mg/kg mbAPAP的水溶液（于40 ℃水浴加熱），正常組小鼠腹腔注射等劑量的生理鹽水。小鼠再禁食12 h后，眼眶取血，脫臼處死后取肝臟做相關(guān)檢測。

1.3.3 小鼠肝臟指數(shù)的計算

小鼠肝臟指數(shù)的計算按照下式進(jìn)行。

1.3.4 小鼠各項生化指標(biāo)的測定

小鼠血液離心后取上清液，按試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行AST活力的測定。小鼠肝臟用生理鹽水制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的肝勻漿，離心取上清液，按試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行CYP2E1、CYP1A2、GST、UGT質(zhì)量濃度，SULT、GSH-Px活力及GSH含量的測定。

1.3.5 組織病理學(xué)HE染色觀察

切取小鼠肝臟1 cm3左右，立即用體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛溶液固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片，厚度5 μm，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，于熒光顯微鏡下觀察肝組織的變化，并進(jìn)行圖像采集。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，采用Duncan法進(jìn)行顯著性分析處理，實驗結(jié)果以表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SeCPs對小鼠肝臟指數(shù)的影響

肝損傷小鼠因其肝臟腫大，導(dǎo)致肝臟指數(shù)增大，故模型組小鼠的肝臟指數(shù)顯著高于正常對照組（表1），CPs組、SeCPs組及CPs+Na2SeO3組均可以顯著降低小鼠肝臟指數(shù)；水飛薊素陽性對照組及Na2SeO3組小鼠的肝臟指數(shù)雖有所降低，但與模型組相比尚未達(dá)統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 SeCPs對小鼠肝臟指數(shù)的影響（n＝10）Table 1 Effects of SeCPs on liver index of mice (n= 10)

2.2 SeCPs對小鼠血清中AST活力及肝勻漿中CYP2E1、CYP1A2質(zhì)量濃度的影響

AST是指示肝損傷的靈敏指標(biāo)，在肝細(xì)胞受損時，會從細(xì)胞內(nèi)溢出進(jìn)入血液，使血液中AST活力大幅度上升，CYP2E1及CYP1A2參與APAP的代謝并生成肝毒性物質(zhì)，當(dāng)大量APAP攝入時，機(jī)體的自我保護(hù)作用會使得肝臟中CYP2E1和CYP1A2的質(zhì)量濃度下降。

圖1 SeCPs對小鼠血清中AST活力的影響（n＝10）Fig. 1 Effects of SeCPs on serum AST activity in mice (n = 10)

圖2 SeCPs對小鼠肝勻漿中CYP2E1、CYP1A2質(zhì)量濃度的影響（n＝10）Fig. 2 Effects of SeCPs on CYP2E1 and CYP1A2 levels in liver homogenate of mice (n = 10)

如圖1、2所示，與正常對照組相比，模型組小鼠血清中AST活力顯著上升（P＜0.05），肝勻漿中CYP2E1質(zhì)量濃度顯著下降（P＜0.05），CYP1A2質(zhì)量濃度有所降低，但尚未達(dá)到顯著性水平（P＞0.05）；相比于模型組，陽性對照物水飛薊素可顯著性降低血清中AST活力及肝勻漿中CYP2E1和CYP1A2的質(zhì)量濃度；CPs組小鼠血清AST活力及肝勻漿中CYP1A2質(zhì)量濃度明顯降低，效果與水飛薊素相當(dāng)，但CPs對CYP2E1的質(zhì)量濃度沒有顯著影響；Na2SeO3顯著降低了血清中AST活力，使肝勻漿中CYP1A2質(zhì)量濃度雖然有所降低，但未達(dá)顯著水平，而對CYP2E1的質(zhì)量濃度無顯著影響；CPs+Na2SeO3組可明顯降低小鼠血清AST及肝勻漿中CYP2E1和CYP1A2的質(zhì)量濃度，且效果優(yōu)于CPs組及Na2SeO3組，差異顯著（P＜0.05）；SeCPs可大幅度降低AST活力以及CYP2E1、CYP1A2質(zhì)量濃度，且對血清AST活力和肝勻漿中CYP1A2質(zhì)量濃度的降低作用顯著優(yōu)于CPs+Na2SeO3，與其他給藥組相比，SeCPs表現(xiàn)出了最佳的抑制肝毒性物質(zhì)產(chǎn)生的作用。

2.3 SeCPs對小鼠肝勻漿中GST質(zhì)量濃度、GSH-Px活力及GSH含量的影響

圖3 SeCPs對小鼠肝勻漿中GSH-Px活力的影響（n＝10）Fig. 3 Effects of SeCPs on GSH-Px activity in liver homogenate of mice (n = 10)

圖4 SeCPs對小鼠肝勻漿中GST質(zhì)量濃度及GSH含量的影響（n＝10）Fig. 4 Effects of SeCPs on GST and GSH levels in liver homogenate of mice (n = 10)

有毒代謝產(chǎn)物NAPQI與GSH的結(jié)合解毒過程需要GST的催化，而GSH-Px是有效的抗氧化酶，硒是其活性中心。如圖3、4所示，模型組小鼠肝臟中GSH-Px活力及GSH含量較正常對照組顯著性降低，GST質(zhì)量濃度有所降低，但未達(dá)到顯著水平；與模型組相比，CPs顯著提高了GSH含量及GSH-Px活力，部分提高GST質(zhì)量濃度；Na2SeO3僅顯著性提高了GSH-Px活力，效果優(yōu)于CPs，但沒有達(dá)到顯著性水平，這源于硒是GSH-Px的重要組成部分；CPs+Na2SeO3對這3 種物質(zhì)均起到了正向調(diào)節(jié)作用，且對GSH含量的增加顯著性高于Na2SeO3組，對GSH-Px活力的提升作用顯著性優(yōu)于CPs；SeCPs相比于CPs+Na2SeO3對這3 種物質(zhì)的正向調(diào)節(jié)作用進(jìn)一步大幅增加（P＜0.05）。由此可見，單純補(bǔ)充無機(jī)硒或CPs，無法有效提高或只能部分提高機(jī)體排出有毒物質(zhì)NAPQI能力，同時補(bǔ)充CPs和無機(jī)硒，可進(jìn)一步提升機(jī)體的解毒能力，而補(bǔ)充SeCPs，其對機(jī)體解毒能力的提升作用在CPs+Na2SeO3的基礎(chǔ)上又有大幅提升（P＜0.05），提示SeCPs中CPs與有機(jī)硒具有協(xié)同保肝作用。

2.4 SeCPs對小鼠肝勻漿中UGT質(zhì)量濃度及SULT活力的影響

APAP進(jìn)入體內(nèi)后大部分經(jīng)UGT及SULT催化，與葡萄糖醛酸及硫酸結(jié)合，最終以無毒的酯或鹽的形式排出體外，這兩種酶質(zhì)量濃度或活力的變化將會影響APAP在體內(nèi)不同代謝途徑處理量。

圖5 SeCPs對小鼠肝勻漿中UGT質(zhì)量濃度及SULT活力的影響（n＝ 10）Fig. 5 Effects of SeCPs on UGT content and SULT activity in liver homogenate of mice (n = 10)

由圖5可以看出，模型組小鼠肝臟中UGT質(zhì)量濃度及SULT活力較正常對照組均顯著下降；而相比于模型組，CPs可顯著性降低小鼠肝臟中UGT質(zhì)量濃度，Na2SeO3對UGT的質(zhì)量濃度及SULT的活力均無顯著影響，CPs+Na2SeO3可顯著性降低UGT質(zhì)量濃度及SULT活力，但SeCPs對這兩種酶的抑制作用較CPs+Na2SeO3又明顯增大，提示SeCPs等可通過降低UGT質(zhì)量濃度及SULT活力，從而降低APAP在體內(nèi)的代謝。

2.5 SeCPs對小鼠肝組織的病理學(xué)影響

由圖6可知，正常對照組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)完整，小葉輪廓清晰，肝細(xì)胞索呈明顯的放射狀排列，無肝細(xì)胞壞死現(xiàn)象，細(xì)胞形狀規(guī)則，核結(jié)構(gòu)清晰可見；模型組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，有明顯的灶狀壞死現(xiàn)象，肝細(xì)胞索排列呈紊亂狀，且細(xì)胞壞死嚴(yán)重；相比于模型組，水飛薊素組小鼠肝組織病理變化得到顯著改善，表現(xiàn)為肝細(xì)胞壞死現(xiàn)象明顯減少，大部分肝細(xì)胞索仍存在，但仍有部分點狀壞死；Na2SeO3組小鼠肝臟病變?nèi)员容^嚴(yán)重，但灶狀壞死面積有所減小；CPs組小鼠肝臟灶狀壞死面積進(jìn)一步減小，肝細(xì)胞壞死現(xiàn)象也得到緩解；CPs+Na2SeO3組小鼠肝臟病變明顯改善，肝細(xì)胞再生明顯，細(xì)胞索紊亂現(xiàn)象減輕，灶狀壞死范圍明顯減?。籗eCPs組小鼠肝臟的病理變化僅表現(xiàn)為有輕微的點狀壞死及部分肝細(xì)胞壞死，相比于模型組及其他給藥組，其肝臟情況良好。

圖6 小鼠肝組織HE染色（×200）Fig. 6 HE staining of liver slices of mice (× 200)

3 討 論

近年來，隨著藥物品種的不斷增加，藥物性肝損害的發(fā)生率亦相應(yīng)增加。常見的能引起肝損傷的藥物主要有APAP[14-17]、咪唑硫嘌呤、阿霉素、環(huán)保霉素及抗結(jié)核藥物等[18]，而在美國和英國，APAP過量是肝損傷最常見的原因[19]。APAP致肝損傷模型被廣泛用于藥物性肝損傷的機(jī)制研究及藥物保肝作用的評價[20]。很多研究已經(jīng)表明，一些天然活性產(chǎn)物具有防治藥物性肝損傷的功能作用。本實驗采用APAP致小鼠肝損傷的模型研究SeCPs對其的防護(hù)作用。研究結(jié)果顯示，小鼠腹腔注射280 mg/kg mb的APAP后，引起嚴(yán)重的肝損傷，而SeCPs可以通過多種方式拮抗APAP的肝毒性。首先，SeCPs可顯著性降低小鼠肝臟中CYP1A2及CYP2E1的質(zhì)量濃度，而CYP1A2和CYP2E1是代謝APAP產(chǎn)生毒性產(chǎn)物的主要酶系[21]。在嚙齒動物實驗中發(fā)現(xiàn)，CYP2E1和CYP1A2基因敲除小鼠對于APAP肝毒性的耐受明顯高于野生小鼠[22]，提示降低CYP2E1和CYP1A2的表達(dá)水平，可減少有毒代謝產(chǎn)物NAPQI的產(chǎn)生，對于抗APAP的肝毒是有利的。其次，在本研究中，各給藥組相對于模型組其SULT活力顯著降低，SeCPs組更為顯著，各組UGT質(zhì)量濃度測定結(jié)果也與此相似，即APAP經(jīng)UGT、SULT催化代謝這一途徑被抑制。Yao等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠的飼料中摻入表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG），可以降低其肝臟中APAP-葡萄糖醛酸酯的含量，降低幅度達(dá)到42%，即EGCG抑制了APAP致肝損傷大鼠肝微粒體內(nèi)UGT的活性。另外，大鼠進(jìn)食茶多酚后，其盲腸中由微生物產(chǎn)生的能分解APAP-葡萄糖醛酸酯的β-葡萄糖醛酸酶的活性降低[24]。由此推斷，SeCPs可能也發(fā)揮了類似作用，即通過降低腸中分解APAP-葡萄糖醛酸酯相關(guān)酶的活性，減少APAP在肝腸循環(huán)通路中的重吸收，降低了肝臟中APAP的濃度，從而減小其肝臟毒性。早在20世紀(jì)90年代已有研究表明，阿魏酸通過增加APAP致肝損傷小鼠體內(nèi)GST活性及GSH含量，起到保肝作用[25]，表明此為有效防護(hù)APAP致肝損傷的途徑。乙酰紫堇靈能顯著減少小鼠由APAP引起的肝臟GSH耗竭，降低血中APAP的濃度，其對肝臟CYP450總量及GST活力有明顯誘導(dǎo)作用，而對代謝APAP的CYP450同工酶——CYP2E1活力卻有抑制作用，說明乙酰紫堇靈對小鼠APAP肝損傷的防護(hù)作用與其選擇性地調(diào)節(jié)CYP450同工酶，誘導(dǎo)GST，加快機(jī)體對APAP的解毒代謝作用密切相關(guān)[26]。此外，在APAP引起肝損傷的過程中，活性氧產(chǎn)生于線粒體，它會損傷線粒體功能，影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)，并促使細(xì)胞死亡，有研究表明，線粒體的靶向抗氧化劑是治療過量APAP引起肝損傷的有效藥物，將現(xiàn)有的藥物針對性地用于抵抗氧化應(yīng)激及緩解由活性氧引起的其他并發(fā)癥狀，使其有可能用于過量服用APAP病人的治療中[27]。而有毒代謝物NAPQI的形成會使機(jī)體內(nèi)的GSH處于很低的水平，這樣會大幅度抑制GSH-Px的抗氧化解毒作用[28]，因此，增加機(jī)體GST活力及GSH的含量格外重要。本研究中，SeCPs不僅能夠大幅度逆轉(zhuǎn)由過量APAP引起的GST質(zhì)量濃度及GSH含量下降的現(xiàn)象，還可以顯著性提高GSH-Px的活力，且相比于模型組，其提高幅度高達(dá)48.4%，雖然Na2SeO3也可顯著提高小鼠肝臟中GSH-Px的活力，但效果不及SeCPs，其中有機(jī)硒的貢獻(xiàn)功不可沒，說明有機(jī)硒更利于機(jī)體吸收，有更好的生理活性。此外，小鼠肝臟HE染色觀察結(jié)果也顯示，SeCPs可以有效地逆轉(zhuǎn)由APAP引起的肝臟病理變化，佐證了其優(yōu)異的保肝作用。

綜上所述，其一，SeCPs可以降低肝臟中UGT質(zhì)量濃度及SULT的活力，抑制APAP的代謝；其二，SeCPs能有效地降低小鼠肝臟中CYP2E1及CYP1A2的質(zhì)量濃度，減少有毒物質(zhì)的產(chǎn)生；其三，SeCPs可提高GST質(zhì)量濃度及GSH的含量，提高機(jī)體排出有毒代謝物的能力，且其對GSH-Px活力的提升作用又加強(qiáng)了機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力。故SeCPs是通過上述3 個方面的共同作用，有效地保護(hù)肝臟，減弱APAP的肝毒對機(jī)體的侵害。

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