提取方法對產(chǎn)朊假絲酵母β-葡聚糖性質(zhì)的影響

馬 霞，劉藍(lán)天，沈 麗，邵 麗,*

（1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2.萊博藥妝技術(shù)（上海）股份有限公司，上海 200233）

酵母β-葡聚糖（yeast β-glucan，YG）是一種最具生物活性的葡聚糖，與一般糖類不同的是，酵母β-葡聚糖不是線性分子的結(jié)構(gòu)，而是一種獨特的三重超微螺旋結(jié)構(gòu)，所以其免疫功能和生物活性最強(qiáng)[1]。β-葡萄糖的生物活性又取決于其結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量、純度和構(gòu)象等[2]。有報道稱免疫反應(yīng)與β-葡聚糖及其分子結(jié)構(gòu)大小、分支結(jié)構(gòu)修飾、構(gòu)象和溶解度之間有相關(guān)性[3]。產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）作為美國食品藥品管理局認(rèn)證的可食用酵母，其細(xì)胞壁中也含有β-葡聚糖[4]，且產(chǎn)朊假絲酵母可以利用工業(yè)廢水生產(chǎn)可食用蛋白和β-葡聚糖[5]，有很好的研究價值。

酵母β-葡聚糖的制備過程中，對產(chǎn)朊假絲酵母進(jìn)行破壁是尤其重要的步驟，葡聚糖的提取純度和得率得益于好的破壁效果。朱益波等[6]采用復(fù)合酶解生物法處理啤酒酵母的提取物可減少蛋白質(zhì)的含量，顯著提高產(chǎn)物的純度，同時使提取物的得率提高到13.7%。Williams等[7]采用高壓微射流均質(zhì)法制備的酵母β-葡聚糖，既保持了β-葡聚糖的生理活性，又能產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，且得到的分子質(zhì)量不同于其他方法制備的β-葡聚糖。李紅梅等[8]采用自溶超聲波法提取酵母β-葡聚糖得率是未采用自溶處理的2 倍。β-葡聚糖是大分子的多糖，采用不同的破壁方法，可能會引起多糖鏈不同程度的水解[9-13]，帶來多糖純度、理化性質(zhì)（分子質(zhì)量分布）和生物活性的差異。

研究表明不同分子質(zhì)量的β-葡聚糖具有不同的生理活性[14]。戴宏杰等[15]研究發(fā)現(xiàn)，堿提多糖具有良好的自由基清除能力和保濕性能。Liepins等[16]的研究表明不同純度和不同含水量的β-葡聚糖之間的生理活性差別較大，含水量少者有較高的免疫活性。目前有關(guān)高壓微射流均質(zhì)法、超聲波法以及復(fù)合酶解法等破壁方法提取酵母β-葡聚糖的相關(guān)報道很多，也是主流的提取方法，但關(guān)于不同提取方法獲得的酵母β-葡聚糖的理化性質(zhì)和生理功能之間是否存在差異的相關(guān)研究不多。本研究擬采用高壓微射流均質(zhì)法、超聲波法以及復(fù)合酶解法提取產(chǎn)朊假絲酵母的細(xì)胞壁多糖，并對其多糖的純度、分子質(zhì)量分布以及清除自由基能力和保濕性能進(jìn)行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產(chǎn)朊假絲酵母（CICC 1769） 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；中性蛋白酶、甘露聚糖酶、巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及果糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma-Aldrich公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylradical，DPPH）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT） 上海Adamas-beta公司；DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）培養(yǎng)基（胎牛血清） 美國Gibco公司；二甲基亞砜 北京索來寶科技有限公司；0.5%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 美國Life Technologies公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 日本TAKARA公司；RNA fast200總RNA極速抽提試劑盒 上海飛捷生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Panda Plus高壓均質(zhì)機(jī) 上海杭杰生物科技有限公司；超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；離子色譜儀 沃特世科技（上海）有限公司；八角度激光光散射儀 美國Wyatt公司；傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司；紫外-可見分光光度計上海元析儀器有限公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；熒光倒置相差顯微鏡 日本Olympus有限公司；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母β-葡聚糖的提取

以土豆淀粉廢棄液作為培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母，收集菌體，用去離子水多次洗滌，用5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的NaCl溶液配制10%的菌懸液，在65 ℃下誘導(dǎo)細(xì)胞壁自溶20 h，經(jīng)離心（4 500×g，10 min）、洗滌后，將沉淀溶解在20 mmol/L pH 7.5磷酸鹽緩沖液（phosphate buあered saline，PBS）中配制成20%待提取液，于90 ℃、130 r/min下高溫振蕩提取6 h，多次洗滌后得細(xì)胞壁沉淀（cell wall precipitation，CWP）[17-20]。

1.3.1.1 高壓微射流均質(zhì)法提取

將CWP配成10%的懸浮液200 mL，使用高壓微射流均質(zhì)處理CWP的懸浮液，處理壓力為120 MPa，循環(huán)6 次，沉淀用蒸餾水洗滌3 次。所得沉淀再次用高壓微射流第2次處理，壓力為150 MPa，循環(huán)3 次，沉淀洗滌3 次，再用高壓微射流按第2次處理條件進(jìn)行高壓微射流第3次處理，10 000 r/min離心10 min得到的沉淀，洗滌3 次后用無水乙醇去脂脫水，Sevag法除蛋白質(zhì)后進(jìn)行冷凍干燥，得到酵母β-葡聚糖樣品H-YG。

1.3.1.2 超聲波法提取

將CWP制備成5%的菌懸液，超聲破壁處理，超聲時間60 min，超聲功率800 W，持續(xù)1 s、間隔1 s，探頭直徑為25 mm。得到的超聲波破碎液進(jìn)行干燥濃縮，索氏抽提去除脂質(zhì)，Sevag法除去蛋白質(zhì)后冷凍干燥，得到酵母β-葡聚糖樣品U-YG。

1.3.1.3 復(fù)合酶解法提取

將CWP用無水乙醇脫水后進(jìn)行真空干燥和脫脂處理，干燥后的CWP用去離子水配成料液比為1∶20的溶液，分別加入2%的中性蛋白酶和甘露聚糖酶[21]，pH值調(diào)為7.0，在50 ℃中酶解60 min。冷卻至室溫后，抽濾除去酶顆粒，濾液進(jìn)行高溫滅酶處理，10 000 r/min離心10 min，取沉淀洗滌，溶解后，放入MWCO 14000的透析袋中用去離子水透析24 h，每隔6 h換水一次，再經(jīng)冷凍干燥得到酵母β-葡聚糖樣品E-YG。

1.3.2 酵母β-葡聚糖的理化性質(zhì)測定

1.3.2.1 酵母β-葡聚糖含量和得率的測定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，采用苯酚-硫酸法測定樣品中的酵母β-葡聚糖含量[22]，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：Y＝6.010 3X+0.066 5（R2＝0.998 9）。酵母β-葡聚糖得率r按式（1）計算[23]。

式中：mg為酵母β-葡聚糖的質(zhì)量/g；mj為酵母菌菌體干質(zhì)量/g。

1.3.2.2 蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

采用GB 5009.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》、GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》和GB 5009.3—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》的方法測定蛋白質(zhì)、脂質(zhì)含量及水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 紫外光譜分析

用去離子水將多糖配成0.2 mg/mL的溶液，充分溶解后用紫外-可見分光光度計在190～400 nm波長處對樣品進(jìn)行全掃描。

1.3.4 單糖組成的測定

采用三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）水解多糖樣品，參照文獻(xiàn)[19-20]的單糖組成分析方法并修改，用離子色譜進(jìn)行單糖組成的測定。色譜條件：流動相A：去離子水；流動相B：0.25 mol/L NaOH；流動相C：1 mol/L NaAc；采用梯度洗脫，洗脫程序為：0～30 min流動相A、B、C分別為99.2%、0.8%和0%；30.1～40.0 min流動相A、B、C分別為79.2%、0.8%和20.0%；40.1～60.0 min流動相A、B、C分別為20.0%、80.0%和0%；60.1 min流動相A、B、C分別為99.2%、0.8%和0%。流速為0.45 mL/min；上樣量為25 mL；時間120 min。色譜柱為CarboPac PA20陰離子交換分析柱（150 mm×3 mm），LC30柱溫箱溫度為30 ℃，檢測器為ED50A電化學(xué)檢測器。

1.3.5 分子質(zhì)量的測定

參照文獻(xiàn)[24-26]的方法并修改，采用高效體積排阻色譜與多角度激光光散射聯(lián)用儀對分子質(zhì)量進(jìn)行測定。色譜柱為TSK PWXL 4000和TSK PWXL 6000串聯(lián)，檢測器為示差折光檢測器和DAWN8+型激光檢測器。洗脫程序為等度洗脫，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，流動相為0.15 mol/L的NaNO3和0.05 mol/L的NaH2PO4溶液。用Astra數(shù)據(jù)分析軟件采集并分析光散射的數(shù)據(jù)，計算分子質(zhì)量。

1.3.6 紅外光譜分析

采用KBr壓片法，對多糖樣品在4 000～500 cm?1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.3.7 DPPH自由基清除能力的測定

參照文獻(xiàn)[27]的方法，以VC和BHT作為陽性對照組，在517 nm波長處測定吸光度A，按照公式（2）計算DPPH自由基的清除率。

1.3.8 酵母β-葡聚糖體外保濕性能測定

參照文獻(xiàn)[23]的方法并修改，測定0.1%的酵母β-葡聚糖樣品在0～24 h的體外保濕率，同時以去離子水、甘油、聚乙二醇（polyethylene glycol-400，PEG-400）作為對照。

1.3.9 酵母β-葡聚糖對內(nèi)源性保濕因子生成的影響

1.3.9.1 HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng)

將處于對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞以3×105～4×105個/孔分至6 孔板內(nèi)，補(bǔ)足DMEM培養(yǎng)基至1.5 mL。待細(xì)胞貼壁過夜后，加入低鈣培養(yǎng)基，同時加入10 μg/mL和20 μg/mL的H-YG、U-YG及E-YG。置于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)72 h。

1.3.9.2 細(xì)胞總RNA的提取

細(xì)胞總RNA的提取按照試劑盒說明書的提取步驟進(jìn)行。

1.3.9.3 RNA的逆轉(zhuǎn)錄

反應(yīng)程序：37 ℃，15 min；85 ℃，15 s；4 ℃，60 min。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，配制20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。

1.3.9.4 實時熒光定量PCR

以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，選用β-肌動蛋白（β-actin）作為內(nèi)參基因，以合成的序列對為特異性引物，按照試劑盒說明書進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。PCR程序為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，進(jìn)行40 個循環(huán)。溶解曲線的設(shè)置條件：72 ℃，5 min；95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；95 ℃，15 s。以2?△△Ct法計算分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法制備酵母β-葡聚糖的比較

2.1.1 樣品理化性質(zhì)分析

對3 種提取方法制備的酵母β-葡聚糖的得率和多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)含量以及水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定結(jié)果及樣品的色澤和組織形態(tài)觀察比較如表1所示。

表1 3 種提取方法的樣品理化性質(zhì)測定結(jié)果Table 1 Physicochemical properties of H-YG, U-YG and E-YG

從表1可以看出，H-YG、U-YG和E-YG樣品中多糖含量分別為97.5、96.7、96.2 g/100 g，都明顯高于酶堿法提取的多糖含量（86.81 g/100 g）[28]：其中用高壓微射流均質(zhì)法提取得到的H-YG樣品中多糖的得率最高，為19.6%，高于水提β-葡聚糖法的多糖得率（17.3%）[29-30]；凱氏定氮法測定樣品中蛋白質(zhì)含量的結(jié)果顯示樣品中不含蛋白質(zhì)，樣品純度明顯高于文獻(xiàn)[27]報道的結(jié)果；索氏抽提測得脂肪含量為0.03 g/100 g，說明制備的樣品較純，制備過程不僅綠色可行還能得到純度較高的酵母β-葡聚糖；冷凍干燥后的樣品還含有微量的水分；從色澤和組織形態(tài)上觀察樣品，發(fā)現(xiàn)H-YG呈較淺的米白色絮片狀固體，U-YG為淡黃色的較細(xì)的粉末，E-YG為淺黃色的粉末或片狀固體。所以，不同提取方法制備得到的酵母β-葡聚糖樣品顏色和外觀上存在一定的區(qū)別。綜上所述，用這3 種方法制備產(chǎn)朊假絲酵母菌β-葡聚糖得率和純度都相對較高，有較好的研究價值。

2.1.2 紫外光譜分析

圖1 H-YG、U-YG和E-YG樣品的紫外全掃描光譜圖Fig. 1 UV scanning spectra of H-YG, U-YG and E-YG

在波長190～400 nm范圍內(nèi)對H-YG、U-YG和E-YG樣品進(jìn)行紫外掃描，從圖1中可以看出，H-YG、U-YG和E-YG在280 nm和260 nm處均沒有吸收峰，說明H-YG、U-YG和E-YG中不含有蛋白質(zhì)和核酸等雜質(zhì)。所以，酵母β-葡聚糖H-YG、U-YG和E-YG可廣泛應(yīng)用于純度要求較高的產(chǎn)品中。

2.1.3 單糖組成分析

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)品的單糖組成色譜圖Fig. 2 High performance anion exchange chromatograms of mixed monosaccharide standards

圖3 E-YG樣品的單糖組成色譜圖Fig. 3 High performance anion exchange chromatogram of monosaccharides in E-YG

H-YG、U-YG和E-YG樣品經(jīng)TFA水解后，采用高效離子色譜測定單糖組成。以E-YG樣品的單糖離子色譜圖為例（圖3），對照圖2混合標(biāo)準(zhǔn)品單糖的圖譜，單糖組成離子色譜圖樣品的出峰時間與其一致，均為14.9 min，對應(yīng)葡萄糖，說明這3 種提取純化方法得到的H-YG、U-YG和E-YG樣品中不含其他單糖組分，都是由葡萄糖聚合形成的葡聚糖。

2.1.4 紅外光譜分析

圖4 3 種不同制備方法得到的多糖的紅外光譜圖Fig. 4 Infrared spectra of H-YG, U-YG and E-YG

從圖4中可以看出，3 種方法提取的酵母β-葡聚糖的圖譜大致相同，都含有典型的糖類特征吸收峰，在3 336、3 324、3 329 cm?1處有強(qiáng)的—OH吸收峰；在2 925、2 927、2 925 cm?1處有—CH、—CH2的吸收峰；在1 634、1 649、1 649 cm?1處為多糖的水合振動峰。H-YG、U-YG、E-YG分別在1 035、1 039、1 075 cm?1處有吡喃糖的特征吸收峰。在890 cm?1附近的峰為β型的糖苷鍵特征峰。H-YG、U-YG和E-YG圖譜在890 cm?1附近都有吸收，說明H-YG、U-YG和E-YG葡聚糖樣品糖環(huán)構(gòu)型都是β-D-吡喃葡萄糖環(huán)。3 種樣品在810 cm?1附近均無吸收峰，證明樣品中沒有甘露糖的存在。

2.1.5 酵母β-葡聚糖的分子質(zhì)量

表2 3 種提取方法得到的樣品分子質(zhì)量Table 2 Molecular masses of H-YG, U-YG and E-YG

采用高效體積排阻色譜與多角度激光光散射聯(lián)用儀對3 種方法提取的酵母β-葡聚糖進(jìn)行分子質(zhì)量分布分析，結(jié)果如表2所示。H-YG、U-YG和E-YG的mw分別為1.611×106、4.763×106、2.661×105g/mol，平均分子半徑分別為67.5、33.3、43.7 nm，復(fù)合酶解法提取的β-葡聚糖mw較小，說明復(fù)合酶解法可能在提取的過程中降解了部分葡聚糖的連接鍵。mw/mn是多糖的多分散系數(shù)（d），d值越接近1，說明樣品中分子質(zhì)量分布的越集中。高壓微射流均質(zhì)法和超聲波法提取的樣品H-YG和U-YG的mw較為相近，但從多糖的分散系數(shù)來看，高壓微射流均質(zhì)法制備的酵母β-葡聚糖樣品H-YG的分子質(zhì)量分布窄，而U-YG的分子質(zhì)量分布較寬，H-YG優(yōu)于U-YG。同時，可以看到對3 種方法提取的酵母β-葡聚糖的分子半徑也是不同的，說明多糖的分子構(gòu)象也是存在差異的，進(jìn)而可能會引起功能之間的差異。超聲波法和復(fù)合酶解法提取的樣品U-YG和E-YG的平均分子半徑相差不大。研究表明，大分子質(zhì)量的β-葡聚糖能夠顯著降低血脂、血糖濃度，保護(hù)心血管[30]。綜上分析，H-YG、U-YG和E-YG樣品有應(yīng)用于降血糖、降血脂等保健食品中的潛力。

2.2 酵母β-葡聚糖清除DPPH自由基的能力

圖5 3 種方法提取樣品對DPPH自由基的清除能力Fig. 5 DPPH radical scavenging capacity of H-YG, U-YG and E-YG

以BHT和VC作為陽性對照物，比較H-YG、U-YG和E-YG清除DPPH自由基的能力。由圖5可以看出，H-YG、U-YG和E-YG樣品都具有DPPH自由基清除能力，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加清除率也逐漸增大。結(jié)果表明，產(chǎn)朊假絲酵母的β-葡聚糖都具有DPPH自由基清除能力，有一定的抗氧化活性，不同方法提取得到的樣品之間的抗氧化活性沒有明顯區(qū)別，U-YG樣品的DPPH自由基清除能力相對較強(qiáng)，為45.2%，在此結(jié)果的基礎(chǔ)上，可以通過酵母β-葡聚糖的增溶提高其自由基清除能力，進(jìn)一步提高酵母β-葡聚糖在抗氧化活性方面的應(yīng)用潛力，從而將其廣泛應(yīng)用于抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)。

2.3 酵母β-葡聚糖的保濕能力

2.3.1 酵母β-葡聚糖體外保濕能力

圖6 酵母β-葡聚糖的保濕率Fig. 6 Moisture retention capacity of H-YG, U-YG and E-YG

0.1%的酵母β-葡聚糖樣品H-YG、U-YG、E-YG、去離子水、甘油以及PEG-400在0～24 h范圍內(nèi)的保濕效果如圖6所示。H-YG、U-YG、E-YG、甘油及PEG-400都可以明顯緩解水分的散失，在去離子水中加入這些樣品都可以起到保濕的效果，且都高于彭永健等[23]研究中最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%多糖的保濕率（60%）。PEG-400的保濕效果最強(qiáng)，H-YG和常用的保濕劑甘油在0～8 h的保濕效果相當(dāng)，但H-YG在8～24 h的保濕效果明顯優(yōu)于甘油。從24 h的實驗結(jié)果可知，保濕效果依次為：PEG-400＞H-YG＞甘油＞E-YG＞U-YG＞去離子水。綜上分析，H-YG有較強(qiáng)的保濕鎖水能力，具有作為需要保持一定濕度的生鮮食品的優(yōu)良保濕劑的潛力。

2.3.2 酵母β-葡聚糖促進(jìn)內(nèi)源性天然保濕因子的生成

圖7 H-YG（A）、U-YG（B）和E-YG（C）樣品對HaCaT細(xì)胞分化絲聚蛋白和caspase14表達(dá)的影響Fig. 7 Effects of H-YG (A), U-YG (B) and E-YG (C) on the expression of filaggrin and caspase14 in HaCaT cell differentiation marker

選用人皮膚細(xì)胞HaCaT來研究β-葡聚糖的內(nèi)源保濕性能，絲聚蛋白和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-14（caspase14）在維持表皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)平衡及形成天然保濕因子中起重要作用，可保持角質(zhì)層的含水量，達(dá)到皮膚保濕作用。天然保濕因子的產(chǎn)生又與絲聚蛋白和caspase14的表達(dá)有正相關(guān)的密切關(guān)系。由圖7可知，在低鈣條件下，用樣品H-YG、U-YG和E-YG（10、20 μg/mL）處理細(xì)胞72 h，通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，10 μg/mL和20 μg/mL的H-YG、U-YG及E-YG樣品能夠提高人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞分化絲聚蛋白和caspase14的表達(dá)水平。其中，H-YG樣品在10 μg/mL質(zhì)量濃度即可顯著促進(jìn)HaCaT細(xì)胞分化絲聚蛋白和caspase14的表達(dá)。從圖7可以看出，樣品H-YG、U-YG和E-YG都具有促進(jìn)內(nèi)源性天然保濕因子生成的功能，H-YG樣品的促進(jìn)天然保濕因子表達(dá)生成作用最為明顯，綜上分析，對HaCaT細(xì)胞分化絲聚蛋白和caspase14的促進(jìn)表達(dá)效果依次為：H-YG＞E-YG＞U-YG，高壓微射流均質(zhì)法提取的酵母β-葡聚糖H-YG可從源頭上對細(xì)胞起到較好的保濕效果，在生鮮食品等領(lǐng)域中具有非常好的應(yīng)用前景。

3 結(jié) 論

本實驗比較了高壓微射流均質(zhì)法、超聲波法及復(fù)合酶解生物法提取產(chǎn)朊假絲酵母β-葡聚糖所得H-YG、U-YG和E-YG的理化性質(zhì)、功能特性（抗氧化和保濕性能）等的差異。3 種方法都屬于比較天然綠色的提取方法，單從提取純度上講，3 種方法都適合酵母β-葡聚糖的提取。通過比較分析，發(fā)現(xiàn)這3 種方法提取的β-葡聚糖在提取率、分子質(zhì)量分布、多糖的分散系數(shù)以及平均分子半徑上都存在差異，進(jìn)而表現(xiàn)為H-YG、U-YG和E-YG清除DPPH自由基能力和保濕性能的不同。β-葡聚糖作為長鏈的多糖分子，采用不同的破壁方法可能會引起多糖鏈的不同程度的水解，帶來多糖理化性質(zhì)和生物活性的差異。本實驗為酵母β-葡聚糖的應(yīng)用及后續(xù)進(jìn)一步了解其結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系、研究多糖的初級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)（鏈構(gòu)象）提供了一定的理論依據(jù)。

[1] OLIVEIRA K S M, DI BASTIANI M, CORDEIRO L M C, et al.(1→6)- and (1→3)(1→6)- β-glucans from Lasiodiplodia theobromae MMBJ: structural characterization and pro-inflammatory activity[J].Carbohydrate Polymers, 2015, 133: 539-546. DOI:10.1016/j.carbpol.2015.07.060.

[2] BSZCZYK K, WILCZAK J, HARASYM J, et al. Impact of low and high molecular weight oat beta-glucan on oxidative stress and antioxidant defense in spleen of rats with LPS induced enteritis[J]. Food Hydrocolloids, 2015, 51: 272-280. DOI:10.1016/j.foodhyd.2015.05.025.

[3] NYMAN A A, AACHMANN F L, RISE F, et al. Structural characterization of a branched (1→6)-α-mannan and β-glucans isolated from the fruiting bodies of Cantharellus cibarius[J]. Carbohydrate Polymers, 2016, 146: 197-207. DOI:10.1016/j.carbpol.2016.03.052.

[4] BENITO-ROMAN O, ALONSO E, COCERO M J, et al. β-Glucan recovery from Ganoderma lucidum by means of pressurized hot water and supercritical CO2[J]. Food and Bioproducts Processing, 2016, 98:21-28. DOI:10.1016/j.fbp.2015.12.007.

[5] BZDUCHA-WRBEL A, BAEJAK S, MOLENDA M, et al. Erratum to: biosynthesis of β-(1,3)/(1,6)-glucans of cell wall of the yeast Candida utilis, ATCC 9950 strains in the culture media supplemented with deproteinated potato juice water and glycerol[J]. European Food Research and Technology, 2015, 240(6): 1281-1282. DOI:10.1007/s00217-014-2406-6.

[6] 朱益波, 翟麗君, 朱明, 等. 啤酒廢酵母中β-D-葡聚糖非降解提取工藝[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(20): 121-125.

[7] WILLIAMS R, DIAS D A, JAVASINGHE N, et al. Beta-glucandepleted, glycopeptide-rich extracts from brewer’s and baker’s yeast(Saccharomyces cerevisiae) lower interferon-gamma production by stimulated human blood cells in vitro[J]. Food Chemistry, 2016, 197:761-768. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.11.015.

[8] 李紅梅, 王偉潔, 侯堃, 等. 自溶超聲波耦合法提取啤酒廢酵母中β-1,3-D-葡聚糖[J]. 精細(xì)化工, 2014, 31(1): 45-49. DOI:10.13550/j.jxhg.2014.01.008.

[9] KIM K S, YUN H S. Production of soluble β-glucan from the cell wall of Saccharomyces cerevisiae[J]. Enzyme & Microbial Technology,2006, 39(3): 496-500. DOI:10.1016/j.enzmictec.2005.12.020.

[10] RIEDER A, KNUTSEN S H, BALLANCE S. In vitro, digestion of beta-glucan rich cereal products results in extracts with physicochemical and rheological behavior like pure β-glucan solutions-a basis for increased understanding of in vivo eあects[J]. Food Hydrocolloids, 2017, 67: 74-84. DOI:10.1016/j.foodhyd.2016.12.033.[11] YIN H F, FAN G J, GU Z X. Optimization of culture parameters of selenium-enriched yeast (Saccharomyces cerevisiae) by response surface methodology (RSM)[J]. LWT-Food Science and Technology,2010, 43(4): 666-669. DOI:10.1016/j.lwt.2009.11.010.

[12] 劉松, 董曉芳, 佟建明. 多糖提取和抗氧化活性評價方法的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展[J]. 動物營養(yǎng)學(xué)報, 2016, 28(11): 3391-3399. DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2016.11.004.

[13] ZHU F, DU B, XU B. A critical review on production and industrial applications of β-glucans[J]. Food Hydrocolloids, 2016, 52: 275-288.DOI:10.1016/j.foodhyd.2015.07.003.

[14] ROCA C, CHAGAS B, FARINHA I, et al. Production of yeast chitin-glucan complex from biodiesel industry byproduct[J].Process Biochemistry, 2012, 47(11): 1670-1675. DOI:10.1016/j.procbio.2012.04.004.

[15] 戴宏杰, 孫玉林, 楊梅語, 等. 擬目烏賊生殖腺堿提多糖的抗氧化及吸濕保濕特性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(2): 31-38. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602006.

[16] LIEPINS J, KOVACOVA E, SHVIRKSTS K, et al. Drying enhances immunoactivity of spent brewer’s yeast cell wall β-D-glucans[J].Journal of Biotechnology, 2015, 206: 12-16. DOI:10.1016/j.jbiotec.2015.03.024.

[17] FREIMUND S, SAUTER M, KAPPELI O, et al. A new non-degrading isolation process for 1,3-β-D-glucan of high purity from baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae[J]. Carbohydrate Polymers, 2003, 54(2):159-171. DOI:10.1016/s0144-8617(03)00162-0.

[18] KOYAMA Y, ZHAO R, IKE M, et al. Candida utilis, assimilates oligomeric sugars in rice straw hydrolysate via, the Calcium-Capturing-by-Carbonation (CaCCO) process for glutathione- and cellbiomass production[J]. Bioresource Technology, 2014, 172: 413-417.DOI:10.1016/j.biortech.2014.08.097.

[19] MOKHTARI S, JAFARI S M, KHOMEIRI M. The cell wall compound of Saccharomyces cerevisiae, as a novel wall material for encapsulation of probiotics[J]. Food Research International, 2017, 96:19-26. DOI:10.1016/j.foodres.2017.03.014.

[20] 劉紅芝, 王強(qiáng), 周素梅, 等. 酵母β-葡聚糖的功能活性及其分離提取研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(11): 552-556. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2006.11.138.

[21] 趙月菊, 薛燕芬, 馬延和. β-甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究現(xiàn)狀和展望[J]. 微生物學(xué)報, 2009, 49(9): 1131-1137. DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.2009.09.001.

[22] 宋博, 趙峽, 李國強(qiáng). 1 種南海軟珊瑚多糖的提取、分離及活性評價[J]. 中國海洋藥物, 2016, 35(5): 1-6. DOI:10.13400/j.cnki.cjmd.2016.05.001.

[23] 彭永健, 張安強(qiáng), 馬新, 等. 玉竹多糖超聲提取工藝優(yōu)化及其保濕性研究[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(14): 96-99.

[24] 唐川, 吳迪, 楊焱, 等. 猴頭菌細(xì)胞壁多糖的提取和其結(jié)構(gòu)特征[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2016, 35(8): 871-877. DOI:10.3969/j.issn.1673-1689.2016.08.013.

[25] SHAO L, WU Z, ZHANG H, et al. Partial characterization and immunostimulatory activity of exopolysaccharides from Lactobacillus rhamnosus KF5[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 107(1): 51-56.DOI:10.1016/j.carbpol.2014.02.037.

[26] WANG Y J, MAINA N H, EKHOLM P, et al. Retardation of oxidation by residual phytate in purified cereal β-glucans[J]. Food Hydrocolloids,2017, 66: 161-167. DOI:10.1016/j.foodhyd.2016.11.019.

[27] 楊學(xué)山, 祝霞, 李潁, 等. 葡萄酒泥酵母制備水溶性β-D-葡聚糖工藝優(yōu)化及其純化后抗氧化性分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(14): 24-31.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614005.

[28] 宮艷艷, 徐學(xué)明. 不同提取方法對酵母葡聚糖性質(zhì)的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2008(9): 162-165. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2008.09.035.

[29] 潘妍, 吳昊, 羅晶杰, 等. β-葡聚糖提取分離工藝及其分子量測定研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(20): 49-52.

[30] LIU X Y, WANG Q, CUI S W, et al. A new isolation method of β-D-glucans from spent yeast Saccharomyces cerevisiae[J].Food Hydrocolloids, 2008, 22(2): 239-247. DOI:10.1016/j.foodhyd.2006.11.008.