長(zhǎng)期不同施肥對(duì)棕壤AM真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

李冬冬，羅培宇*，韓曉日，楊勁峰，蔡芳芳，劉天馳

（1 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866；2 土壤肥料資源高效利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng) 110866）

叢枝菌根 (Arbuscular mycorrhizal，AM) 真菌廣泛存在于農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，它能夠與絕大多數(shù)陸生植物根系形成菌根[1]。許多研究表明，AM真菌能改善根際土壤環(huán)境[2–3]，活化土壤中的礦質(zhì)養(yǎng)分[4]，促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分的吸收；并且還具有增強(qiáng)植物抗病性、抗逆性，增加農(nóng)作物產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)的功能[5–7]。然而AM真菌生長(zhǎng)會(huì)受到許多因素的影響，其中土壤類(lèi)型是影響AM真菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素之一[8–9]。張美慶等[10]研究發(fā)現(xiàn)，球囊霉屬適應(yīng)性最強(qiáng)，在潮土、紅壤、棕壤、石灰土、水稻土出現(xiàn)率最高，摩西球囊霉屬在所有土類(lèi)中均有發(fā)現(xiàn)，無(wú)梗囊霉屬在赤紅壤、磚紅壤和水稻土中出現(xiàn)較多；硬囊霉屬在赤紅壤和磚紅壤中居多；巨孢囊霉科的2屬在棕壤和水稻土中出現(xiàn)較多。除此之外，耕作制度、施肥等常見(jiàn)的農(nóng)田管理措施也對(duì)AM真菌的數(shù)量和多樣性有顯著影響[7,11]。在大多數(shù)條件下，耕作會(huì)降低AM真菌生物量、減少AM真菌多樣性[12–13]；輪作中不同作物會(huì)對(duì)土壤中AM真菌的群落組成和數(shù)量有不同的影響[14]。而施肥對(duì)AM真菌的影響研究結(jié)果并不一致，研究表明長(zhǎng)期定位施肥顯著改變了AM真菌的孢子密度和群落[15]；有研究表明，不同形態(tài)磷肥的施入對(duì)其群落組成和生物量沒(méi)有影響[16]，而Muchane等[17]研究表明，可溶性磷肥的施入可以增加AM真菌的定殖；Souza等[18]認(rèn)為，施用有機(jī)肥有利于提高AM真菌的多樣性，改變其群落組成；而Joner研究表明施用有機(jī)肥會(huì)對(duì)AM真菌產(chǎn)生消極影響[19]，這可能是由于土壤類(lèi)型、施肥結(jié)構(gòu)和耕作制度不同引起的。

目前，關(guān)于棕壤長(zhǎng)期輪作施肥對(duì)AM真菌群落結(jié)構(gòu)的影響研究較少。本試驗(yàn)在38年棕壤長(zhǎng)期輪作施肥的基礎(chǔ)上，分析影響AM真菌群落結(jié)構(gòu)的因素，以期為今后對(duì)土壤AM真菌進(jìn)行調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤來(lái)源及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試土壤樣品采自沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)棕壤肥料長(zhǎng)期定位試驗(yàn)地 (北緯 40°48′，東經(jīng) 123°33′)。該試驗(yàn)地始于1979年，到2016年已有38年的歷史，采用玉米—玉米—大豆輪作，2016年種植玉米。該試驗(yàn)地的基本概況如羅培宇等[20]所述。本試驗(yàn)選取其中6個(gè)施肥處理：1) 不施肥 (CK)；2) 單施化學(xué)氮肥 (N)；3) 施用化學(xué)氮磷肥 (NP)；4) 施用化學(xué)氮磷鉀肥(NPK)；5) 單施有機(jī)肥 (M)；6) 有機(jī)肥和化學(xué)氮磷肥配施 (MNP)，所有肥料作為基肥在播種前一次性施入土壤。有機(jī)肥為豬廄肥，平均含有機(jī)質(zhì)119.6 g/kg，全N 5.6 g/kg、P2O58.3 g/kg、K2O 10.9 g/kg。化學(xué)氮、磷、鉀肥分別為尿素、過(guò)磷酸鈣和硫酸鉀。肥料具體施用量見(jiàn)表1。

1.2 樣品采集

土壤樣品在2016年4月23日播種前采集，各處理選取12個(gè)點(diǎn)，采樣深度為0—20 cm，每3個(gè)點(diǎn)充分混勻，剔除礫石、植物根系等雜物，過(guò)1 mm篩，一部分用于測(cè)定可溶性有機(jī)碳、銨態(tài)氮及提取土壤總DNA；另一部分風(fēng)干后用于測(cè)定土壤pH、有機(jī)碳、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、速效鉀、有效磷、孢子密度。

1.3 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤可溶性有機(jī)碳用K2SO4浸提法測(cè)定，即稱(chēng)取鮮土10 g加入50 mL 0.5 mol/L K2SO4溶液振蕩1 h，然后在4000 × g離心力下離心10 min，上清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液用Vario EL II型TOC儀進(jìn)行測(cè)定[21]。銨態(tài)氮含量用0.01 mol/L CaCl2浸提法，采用連續(xù)流動(dòng)分析儀 (AutoAnalyzer3，德國(guó)Seal公司) 上機(jī)測(cè)定。全氮、有機(jī)碳采用元素分析儀測(cè)定。pH、全磷、全鉀、有效磷、速效鉀、堿解氮根據(jù)土壤農(nóng)化分析方法測(cè)定[22]。AM真菌孢子密度采用濕篩傾析—蔗糖離心法，從20 g風(fēng)干土中篩取孢子并進(jìn)行孢子密度統(tǒng)計(jì)[23]。

表 1 各處理的肥料施用量Table 1 Application rates of the long-term fertilizer treatments

1.4 土壤DNA提取

土壤DNA采用Powersoil?DNA isolation kit試劑盒 (MO BIO, Laboratories Inc, German) 進(jìn)行提取，提取完的DNA置于–20℃冰箱待用。

1.5 目的片段的擴(kuò)增

AM真菌的目的序列擴(kuò)增采用巢式PCR，第一輪反應(yīng)體系為 10 × PCR Buffer (不含 Mg2+) 5 μL，dNTP 4 μL (2.5 mmol/L)，MgCl23 μL (2.5 mmol/L)，NS1 (10 mmol/L) 1.5 μL，NS41 (10 mmol/L) 1.5 μL，Taq 酶 (2 U/μL) 1 μL，DNA 模板 1 μL，加 ddH2O 至50 μL。第二輪反應(yīng)體系與第一輪相同。為了提高DGGE的分辨率，筆者在第二輪PCR上游引物前加了個(gè)GC夾 (CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCGCCGCCCCCGCCCG)。由于AM1和NS31不能擴(kuò)增原囊霉科 (Archaeosporaceae) 和類(lèi)球囊霉科 (Paraglomaceae) 的AM真菌，因此添加了另一對(duì)引物ARCH1311和NS8來(lái)擴(kuò)增原囊霉科和類(lèi)球囊霉科。本試驗(yàn)所用的聚丙烯酰胺凝膠的濃度為6%，變性劑范圍30%～50%，電泳緩沖液1 × TAE，電泳電壓60 V，時(shí)間為16 h。PCR具體條件如表2所示。

1.6 DGGE割膠回收測(cè)序

從DGGE圖譜中切取清晰、具有代表性的條帶，用聚丙烯酰胺凝膠DNA回收試劑盒 (北京康維)進(jìn)行目的基因的回收?；厥蘸蟮腄NA用AM真菌的特異性引物NS31和AM1進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，然后交由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行克隆測(cè)序。

表 2 AM真菌目的序列PCR反應(yīng)條件Table 2 PCR conditions of AM fungi

1.7 數(shù)據(jù)分析及處理

圖表制作采用Microsoft Office Excel 2010，方差分析采用SPSS 19.0 (最小顯著差數(shù)法，LSD)；冗余分析 (redundancy analysis, RDA) 及典型對(duì)應(yīng)分析(canonical correlation analysis, CCA) 采用 CANOCO 4.5軟件；DGGE圖譜分析采用Quantity one 4.6軟件；DNA序列比對(duì)在Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST程序中進(jìn)行相似性搜索，查找與目的條帶親緣關(guān)系最近的序列。 ∑

Shannon指數(shù) (H) 計(jì)算公式：H =，其中Pi為第i個(gè)條帶的光密度值占其所在泳道全部條帶光密度值的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)期定位施肥對(duì)棕壤理化性質(zhì)的影響

長(zhǎng)期施肥顯著改變了棕壤的理化性質(zhì) (表3)。M處理的pH最高，為6.51；N處理的pH最低，為4.61；與CK相比，施用有機(jī)肥處理土壤pH升高，而單施化肥處理土壤pH降低，說(shuō)明施用有機(jī)肥可在一定程度上降低土壤酸度，提高土壤pH。施肥顯著提高了土壤有機(jī)碳 (TOC)、全氮 (TN)、NH+4-N、可溶性有機(jī)碳 (DOC) 含量，而與單施化肥處理相比，施用有機(jī)肥處理顯著提高了土壤TOC、TN、全磷(TP)、有效磷 (AP)、堿解氮 (AHN) 的含量。

2.2 長(zhǎng)期施肥下AM真菌群落多樣性分析

各處理的DGGE圖譜如圖1所示，不同施肥處理的條帶數(shù)量、亮度、位置都有所不同。從供試土壤中共分離出23條條帶，其中band 1、band 4、band 8、band 9等 (圖中白色標(biāo)記) 經(jīng)測(cè)序不屬于AM真菌 (本研究中相關(guān)的Shannon-Wiener指數(shù)、聚類(lèi)分析、典型對(duì)應(yīng)分析均根據(jù)DGGE圖譜中AM真菌條帶處理分析得出)。其中N和NPK處理的條帶數(shù)最多，band 10、band 15、band 16是所有處理共有的條帶，說(shuō)明施肥未對(duì)這幾種AM真菌生長(zhǎng)造成影響；band 7、band 12和band 2、band 11分別是N和NPK處理特有的條帶，說(shuō)明單施氮肥、氮磷鉀配施促進(jìn)了該AM真菌的生長(zhǎng)；而band 18是有機(jī)肥區(qū)特有條帶，該種AM真菌可能是由有機(jī)肥帶入土壤中的或者是被土著激發(fā)的。圖1還顯示，施用有機(jī)肥處理和單施化肥處理的條帶位置、亮度顯著不同，說(shuō)明棕壤AM真菌群落結(jié)構(gòu)會(huì)受到施入肥料種類(lèi)的影響。

Shannon指數(shù) (H) 也稱(chēng)多樣性指數(shù)，在生態(tài)學(xué)中，它常被用來(lái)預(yù)測(cè)物種的多樣性水平。由表4和圖1可知，單施化肥處理的H指數(shù)高于CK和施用有機(jī)肥處理，而施用有機(jī)肥區(qū)的多樣性低于CK，尤其是單施有機(jī)肥處理的多樣性最低，這說(shuō)明單施化肥可使土壤AM真菌多樣性提高，而施用有機(jī)肥反而會(huì)對(duì)原有土著AM真菌有抑制生長(zhǎng)的趨勢(shì)。在本研究中，條帶數(shù)變化與多樣性變化趨勢(shì)基本一致；而各處理間的均勻度無(wú)顯著差異，均勻度指數(shù)為0.976～0.993，說(shuō)明施肥對(duì)AM真菌的均勻度影響不大。

表 3 供試土壤的理化性質(zhì)Table 3 Physical and chemical properties of test soils

圖 1 不同施肥處理土壤AM真菌的DGGE圖譜Fig. 1 DGGE banding patterns of soil AM fungi in different treatments

表 4 不同施肥處理下AM真菌多樣性指數(shù)Table 4 Diversity indices of AM fungi in different fertilization treatments

如圖2所示，長(zhǎng)期施肥顯著改變了土壤中的AM真菌孢子密度。施用有機(jī)肥處理的孢子密度顯著高于單施化肥處理和不施肥處理。其中MNP處理的孢子密度最高，每克土為33.3個(gè)，而CK處理的孢子密度最低，每克土為10.7個(gè)；單施化肥處理的孢子密度則介于兩者之間，每克土為18.6～21.8個(gè)。這表明施肥有利于孢子的產(chǎn)生，而施用有機(jī)肥土壤中的AM真菌孢子密度增加的幅度則更大。

圖 2 不同施肥處理下的孢子密度Fig. 2 Spore densities of different fertilization treatments

對(duì)AM真菌的H指數(shù)、均勻度及孢子密度和土壤理化性質(zhì)進(jìn)行了冗余分析 (圖3)，第一和第二排序軸解釋了99.91%的變量 (P ＜ 0.05，通過(guò)蒙特卡羅檢驗(yàn))。其結(jié)果表明，長(zhǎng)期輪作施肥條件下，pH、AP、AHN、全鉀(TK)與AM真菌多樣性指數(shù)和均勻度均呈負(fù)相關(guān)，其中pH與AM真菌多樣性呈顯著負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為0.89，而AP、AHN、TK與AM真菌多樣性的相關(guān)系數(shù)分別為0.45、0.33、0.12，相關(guān)性較小；AM真菌孢子密度與TK、AHN、AP呈顯著正相關(guān)而與土壤pH相關(guān)性較小，與TK、AHN、AP、pH的相關(guān)系數(shù)分別為0.92、0.91、0.89、0.37，而其余理化性質(zhì)均與它們無(wú)相關(guān)性。另外，從圖中可以看出AM真菌多樣性與其孢子密度無(wú)相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)僅為0.0025。

圖 3 AM真菌與土壤理化性質(zhì)的冗余分析Fig. 3 Redundancy analysis depicting the relationship among soil physicochemical properties and AM fungi

2.3 AM真菌群落結(jié)構(gòu)分析及其影響因素

對(duì)DGGE圖譜中優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行割膠回收，經(jīng)克隆測(cè)序后共獲得23個(gè)序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST程序中進(jìn)行序列比對(duì)，尋找與其親緣關(guān)系最為接近的序列 (圖4)，結(jié)果表明band 3、band 5分別與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中Uncultured Glomus(LN616600.1)、(EF041057.1) 同源性都達(dá)到了100%，band 2、band 6、band 7、band 10、band 11、band 12、band 13、band 14、band 15、band 16、band 18與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的未培養(yǎng)的球囊霉門(mén)(Uncultured Glomeromycota) 相似度較高。

圖 4 不同處理AM真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree of AM fungi with different treatments

圖1 和圖4表明，38年長(zhǎng)期定位施肥對(duì)AM真菌的種群分布產(chǎn)生了很大的影響，一些只出現(xiàn)在化肥處理，如band 3[Uncultured Glomus (LN616600.1)、band 5[Uncultured Glomus (EF0410-57.1)]，說(shuō)明施用化肥可以使它們富集；另一些只出現(xiàn)在有機(jī)肥處理，如band 18[Uncultured Glomeromycota (KF871054.1)]是由豬廄肥帶入到土壤中，以上說(shuō)明不同施肥種類(lèi)對(duì)AM真菌產(chǎn)生的影響是不同的。

本研究成功分離了AM真菌和一些非AM真菌。AM1和NS31是被大量使用的群落研究的引物，能夠特異擴(kuò)增真菌，但是有研究顯示該引物對(duì)仍有缺陷。首先，引物不能擴(kuò)增原囊霉科和類(lèi)球囊霉科的AM真菌[24]，因此本研究利用引物ARCH1311和NS8進(jìn)行原囊霉科和類(lèi)球囊霉科AM真菌的擴(kuò)增，結(jié)果并沒(méi)有擴(kuò)增出原囊霉科和類(lèi)球囊霉科，說(shuō)明本地土壤中不存在這兩科的AM真菌；另外，本研究中也擴(kuò)增出了一些非AM真菌，說(shuō)明選擇的引物對(duì)特異性有欠缺，這與前人研究結(jié)果相同[25–26]，但我們未將非AM真菌列入結(jié)果分析過(guò)程，因此其不會(huì)對(duì)研究結(jié)果造成影響。

對(duì)DGGE圖譜的聚類(lèi)分析表明 (圖5)，長(zhǎng)期施肥將棕壤AM真菌分為了不施肥處理與施肥處理兩大類(lèi)群，其中施肥處理又分為了單施化肥處理和施用有機(jī)肥處理兩大類(lèi)群，它們的群落結(jié)構(gòu)相似度分別為42%和47%，說(shuō)明不同施肥使棕壤AM真菌種類(lèi)產(chǎn)生了顯著的變化。其中相似度最高的是M和MNP處理，其相似度達(dá)到81%，這表明施用有機(jī)肥能顯著改變棕壤AM真菌群落結(jié)構(gòu)；而N與NP、NPK的相似度分別為61%、57%，說(shuō)明化肥配合施用也會(huì)對(duì)AM真菌的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

圖 5 不同施肥處理中AM真菌 UPGMA聚類(lèi)圖譜Fig. 5 UPGMA dendrogram of AM fungi in different fertilization treatments

由圖6可知，影響棕壤AM真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素為AP、AK、TOC、NH4+-N。其中band 10、band 15、band 16并不受這些土壤因素的影響，在各施肥處理下均有分布；band 18與AP、AK、TOC為顯著正相關(guān)，band 5、band 6、band 7、band 12、band 14與呈顯著正相關(guān)，而其余均與土壤因素呈顯著負(fù)相關(guān)。第一和第二排序軸解釋了60.4%的變量 (P ＜ 0.05，通過(guò)蒙特卡羅檢驗(yàn))。

圖 6 AM真菌核糖核酸型與土壤因子的典型對(duì)應(yīng)分析Fig. 6 Results of the canonical correlation analysis of AM fungi ribotypes and soil factors

3 討論與結(jié)論

在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，AM真菌的生長(zhǎng)會(huì)受到很多非生物因素的影響，其中包括土壤類(lèi)型、pH、土壤養(yǎng)分等，同時(shí)也會(huì)受到施肥數(shù)量、種類(lèi)的影響。目前關(guān)于施肥對(duì)AM真菌的影響已經(jīng)有很多報(bào)道，但關(guān)于長(zhǎng)期輪作施肥對(duì)棕壤AM真菌的影響研究報(bào)道較少。

在本研究中，不同施肥處理的AM真菌多樣性指數(shù)、均勻度、條帶數(shù)均有一定的區(qū)別，其中單施化肥處理比不施肥、施有機(jī)肥處理的種群多樣性要高，這說(shuō)明長(zhǎng)期施用化肥、有機(jī)肥會(huì)不同程度地影響AM真菌的群落多樣性。冗余分析結(jié)果顯示，pH、AP、AHN、TK對(duì)AM真菌的均勻度、多樣性指數(shù)影響最大。Harley等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在礦質(zhì)養(yǎng)分中，土壤磷素密切影響AM真菌的生長(zhǎng)，速效磷過(guò)低或過(guò)高都會(huì)抑制AM真菌生長(zhǎng)發(fā)育。由表3可知，在有機(jī)肥區(qū)土壤中磷的含量顯著高于化肥區(qū)，因此該處理下AM真菌的多樣性較低，這與張海波等[28]和Harley等[27]研究結(jié)果一致，其原因可能由于高磷條件下導(dǎo)致植物根系細(xì)胞膜通透性降低和根系分泌物發(fā)生變化，對(duì)土壤中AM真菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致土壤中的AM真菌多樣性減少[29]；而另一些研究表明AM真菌多樣性與有效磷存在正相關(guān)關(guān)系[30–31]，這表明AM真菌對(duì)施肥條件具有選擇性，這為深入認(rèn)識(shí)AM真菌多樣性與施肥的關(guān)系，對(duì)AM真菌功能基因 (如控制磷循環(huán)的基因) 的研究可能會(huì)大有裨益。

有研究報(bào)道，土壤pH是影響AM真菌多樣性的重要土壤因子之一，其通過(guò)影響孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)來(lái)影響產(chǎn)孢量，進(jìn)而影響AM真菌多樣性，一般偏酸的土壤更有利于AM真菌產(chǎn)孢[12]。但是在本研究中土壤pH并不是通過(guò)影響AM真菌產(chǎn)孢而對(duì)其多樣性產(chǎn)生影響。這可能由于土壤類(lèi)型和耕作制度等不同造成的，需要進(jìn)一步研究。

長(zhǎng)期施肥顯著改變了土壤中的孢子密度，土壤養(yǎng)分可以直接或間接影響真菌產(chǎn)孢。然而關(guān)于土壤理化性質(zhì)對(duì)孢子密度的影響研究結(jié)果不盡相同。韓濤等[32]研究發(fā)現(xiàn)孢子密度與土壤理化性質(zhì)并沒(méi)有明顯的相關(guān)性，而吳勇[33]研究表明孢子密度與土壤pH和有效磷呈正相關(guān)，胡文武等[34]的研究則表明與土壤有效磷呈負(fù)相關(guān)。這可能與土壤類(lèi)型、作物種類(lèi)、施肥方式、氣候類(lèi)型不同等有關(guān)。在本研究中發(fā)現(xiàn)土壤AP、AHN、TK與AM真菌孢子密度呈顯著正相關(guān)，這可能是由棕壤長(zhǎng)期輪作施肥造成的。

本研究通過(guò)CCA分析發(fā)現(xiàn)，土壤AM真菌種群結(jié)構(gòu)受到AP、AK、TOC、的影響。長(zhǎng)期不同施肥顯著改變了這些土壤化學(xué)性質(zhì)，進(jìn)而影響了AM真菌種群結(jié)構(gòu)，其中土壤磷水平對(duì)其分布影響較大，這是由于不同種類(lèi)的AM真菌對(duì)磷的響應(yīng)機(jī)制不同[35]；土壤中的TOC、NH+4-N對(duì)其分布也有一定的影響，這是由于微生物生長(zhǎng)離不開(kāi)碳源和氮源，而AM真菌對(duì)不同類(lèi)型碳源、數(shù)量在一定程度上產(chǎn)生選擇性，從而導(dǎo)致了不同的分布特征[36]，而氮源對(duì)其影響鮮有報(bào)道，需要進(jìn)一步研究；另外，在速效鉀對(duì)AM真菌的影響機(jī)制方面仍需進(jìn)一步探究。通過(guò)聚類(lèi)分析和CCA分析可以看出，長(zhǎng)期定位施肥是通過(guò)改變土壤的理化性質(zhì)而改變了AM真菌生長(zhǎng)的環(huán)境，使其產(chǎn)生了不同的群落結(jié)構(gòu)，最終將棕壤AM真菌分為了施肥處理與不施肥處理代表的兩大類(lèi)群，這也表明AM真菌對(duì)施肥條件具有選擇性[37]。雖然AM真菌多樣性指數(shù)與pH、AP、AHN、TK有關(guān)，但是其種群結(jié)構(gòu)卻與AP、AK、TOC、等有關(guān)，因此下一步結(jié)合作物根系內(nèi)侵染的AM真菌，找出其中的優(yōu)勢(shì)菌群，從而通過(guò)改變相關(guān)的土壤理化性質(zhì)來(lái)調(diào)控優(yōu)勢(shì)菌群，這將對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。

本研究使用DGGE技術(shù)來(lái)分析AM真菌的群落結(jié)構(gòu)，但此技術(shù)存在自身的局限性。雖然本研究通過(guò)DGGE技術(shù)成功分離了AM真菌和一些非AM真菌，并依據(jù)DGGE圖譜去掉非AM真菌條帶校正后得到AM真菌多樣性指數(shù)數(shù)據(jù)，但其與實(shí)際值之間可能還存在差距；另外，DGGE不能全面分析土壤中全部微生物群落，只能對(duì)微生物群落中數(shù)量大于1%的優(yōu)勢(shì)種群進(jìn)行分析[38]，而本研究中6個(gè)處理所獲得AM真菌條帶僅為14條，通過(guò)割膠測(cè)序僅獲得7個(gè)OTU。因此采用DGGE分析可能低估了土壤中的AM真菌多樣性，這些都可能是由于PCR引物特異性與覆蓋度不足造成[39]。因此在以后的研究中應(yīng)對(duì)AM真菌的引物進(jìn)行優(yōu)化以提高其特異性，或采用Illumina Miseq、第三代測(cè)序 (Pac Bio)、生物標(biāo)記物等方法來(lái)最大程度地保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

長(zhǎng)期輪作施肥顯著改變了棕壤的理化性質(zhì)，從而對(duì)AM真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。棕壤AM真菌多樣性與土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān)，而與孢子密度無(wú)相關(guān)性，引起AM真菌種群變化的主要因素為AP、AK、TOC、。由于土壤中存在的AM真菌是其定殖到作物根系內(nèi)的前提，而何種AM真菌是定殖到作物體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)種類(lèi)則需要進(jìn)一步研究。

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