川芎嗪拼合物對PC12細胞損傷保護作用的研究

毛佩，畢思玲，王鵬龍，向虹俊，徐冰，任麗薇，雷海民，張宇忠

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

缺血性腦卒中是臨床常見疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率及高致死率的特點[1]。 Abtrup等[2]定義了腦缺血半暗帶為可逆性損傷，及時恢復(fù)缺血半暗帶區(qū)血流、抑制腦缺血再灌注損傷是目前有效治療腦卒中的一種可行方法，對半暗帶區(qū)神經(jīng)細胞的保護可能是另一選擇。川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMP)是從川芎中提取的有效成分，臨床上多用于缺血性腦卒中的治療[3-4]。本團隊依據(jù)拼合原理合成大量川芎嗪拼合物，即含有川芎嗪的化合物。經(jīng)過實驗室前期篩選，在一系列川芎嗪拼合化合物中，川芎嗪-香豆酸(TMP-CA)，化學(xué)名稱為4-(3,5,6-三甲氧基吡嗪-2-甲氧基)苯丙烯酸-3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲基酯，英文全稱為(3,5,6-trimethylpyrazin-2-yl) methyl-4-((3,5,6-trimethylpyrazin-2-yl)methoxy)benzoate(結(jié)構(gòu)見圖1所示),本課題簡稱此化合物T-CA,表現(xiàn)出了較好的促增殖、抗氧化活性，有可能對腦缺血引發(fā)的神經(jīng)細胞凋亡起到保護作用，其抗凋亡機制可能通過抑制線粒體通路。本實驗采用氯化鈷(cobal chloride，CoCl2)造模，建立擬缺血損傷的PC12細胞模型[5-6]，采用MTT、熒光染色、免疫細胞化學(xué)、Western Blot等方法，觀察PC12細胞在損傷前后的增殖活性、細胞凋亡狀況以及普通形態(tài)學(xué)改變，并同時選取凋亡調(diào)控指標Bcl-xl/Bad、NF-κB/P65與Caspase-8進行分子生物學(xué)研究，進一步探討T-CA對PC12細胞擬缺血損傷模型的保護作用是否涉及凋亡的死亡受體通路及其機制。

圖1 先導(dǎo)化合物T-CA結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 細胞株

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞克隆株P(guān)C12細胞，購自北京協(xié)和細胞資源中心。

1.2 主要藥品與試劑

川芎嗪拼合物T-CA，化學(xué)名為4-(3,5,6-三甲氧基吡嗪-2-甲氧基)苯丙烯酸-3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲基酯，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)系雷海民教授提供；神經(jīng)生長因子(NGF,美國派普泰克公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(HyClone)、青鏈霉素混合液(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)；澳洲胎牛血清(FBS)、馬血清(HS)(北京百諾威生物科技有限公司)；噻唑藍(MTT,北京索萊寶生物科技有限公司)；Bad、Bcl-xl、NF-κB/P65、Caspase-8抗體(Abcam、Immunoway)。

1.3 方法

1.3.1 PC12細胞培養(yǎng)和處理

PC12細胞疏松貼壁生長，完全培養(yǎng)液含84% RPMI 1640，10%馬血清，5%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液。培養(yǎng)于含5%CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱,當PC12細胞達到對數(shù)生長期時，用無血清RPMI 1640饑餓12～14 h后，收集細胞用于實驗。細胞分為Normal組、Model組、T-CA組以及Positive組。

將饑餓后的PC12細胞用10%胎牛血清模型培養(yǎng)基(含有89% 1640，10% FBS與1%青鏈霉素混合液)制成7×103cell/mL的單細胞懸液體，加入 NGF，種入PLL包被的96孔板內(nèi)，每孔120 μL，濃度為50 ng/mL，培養(yǎng)48 h后，Normal組與Positive組給予模型培養(yǎng)基；T-CA組給予模型培養(yǎng)基稀釋的T-CA，其終濃度為30 μM；Positive組給予模型培養(yǎng)基稀釋的陽性藥依達拉奉，調(diào)節(jié)終濃度(12.5 μM、15 μM、20 μM、25 μM)；每組6個復(fù)孔，每孔60 μL。放在37℃恒溫、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)36 h。給藥36 h后用CoCl2200 μmol/L，12 h進行造模。

1.3.2 MTT比色法

細胞造模12 h后，避光,每孔加入MTT溶液20 μL，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h。將96孔板內(nèi)上清液小心吸棄，每孔加入150 μL DMSO，避光震蕩10 min，待紫藍色甲瓚結(jié)晶充分溶解。在酶標儀上以490 nm波長檢測每孔的OD值。

1.3.3 AO/EB及DAPI熒光染色

將單細胞懸液接種到12孔板，Positive組調(diào)節(jié)成20 μM為終濃度，其余處理同上所述(T-CA組調(diào)節(jié)濃度始終為30 μM)。AO/EB熒光染色：吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗滌2次；加入 5%的AO染液以及5%的EB染液各50 μL；立即用熒光顯微鏡觀察并拍照記錄。DAPI染色：吸棄孔內(nèi)上清液，PBS洗滌2次；加入4%的多聚甲醛，約10 min；PBS洗滌2～3次；加入適量已稀釋好的DAPI染液，避光2 min；PBS洗滌2次，超純水洗滌1次；立即置于熒光顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.3.4 HE染色

把12孔板中培養(yǎng)基廢棄，PBS洗滌1 min×3次；加入冰丙酮(-20℃)，置于-20℃冰箱中10～15 min；吸棄冰丙酮， PBS 洗滌3 min×3次，無菌注射器摳片；蘇木素染色3 min，流水沖洗1 h后鏡下觀察，若顏色過深，用鹽酸-乙醇溶液分色3～4 s，自來水沖洗5～10 min，0.5%伊紅溶液染色2 min，經(jīng)梯度酒精脫水，50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各30 s，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各3 min，中性樹膠封片，樹膠干透后置于鏡下拍照觀察。

1.3.5 免疫細胞化學(xué)染色

細胞爬片后，PBS洗滌3 min×3次。滴加適量3% H2O2(CH3OH)溶液，濕盒中室溫放置30 min。去離子水浸洗1 min×3次，滴加BSA，每片70 μL，室溫放置30 min。甩干片子，滴加一抗(Bad，Bcl-xl)，放入濕盒中4℃過夜，陰性對照使用70 μL PBS。 過夜后拿到室溫30℃復(fù)溫30 min， PBS浸洗3 min×3次。滴加二抗，放入濕盒中37℃ 30 min，PBS浸洗3 min×3次。滴加SABC，放入濕盒中37℃ 30 min， PBS浸洗3 min×3次。DAB顯色10 min，鏡下觀察。自來水沖洗玻片，終止顯色。蘇木素復(fù)染10 s，流水沖洗1 h。經(jīng)梯度酒精脫水，50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各30 s，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5 min，中性樹膠封片，鏡下觀察細胞內(nèi)棕黃色顆粒的表達并拍照。

1.3.6 Western Blot檢測方法

提取PC12細胞總蛋白。SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜60 min。把膜放入5%脫脂奶粉-TBST封閉30 min。加入NF-κB/P65 和Caspase-8抗體，孵育30 min后置于4℃冰箱過夜。取出，TBST洗膜，3 min×5次。加入二抗孵育，室溫1 h，TBST洗膜，3 min×5次。加入ECL顯色3～5 min，顯影2 min，定影。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法檢測PC12細胞增殖及活性

MTT法是實驗中常用于檢測細胞增殖及活性的方法，吸光度值越大，即細胞活性越強。結(jié)果見表1，與Normal組比較，Model組的OD值明顯下降(P<0.01)，可知擬缺血性PC12細胞造模成功；與Model組相比較，T-CA組的OD值顯著升高，具有顯著性差異(P<0.01)，同時Positive組的OD值也明顯升高，具有顯著性差異(P<0.01)，且Positive組(12.5、15、20)3個濃度間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。通過計算得出化合物T-CA的EC50值為13.02 μM，陽性藥依達拉奉的EC50值為8.72 μM(川芎嗪的EC50為64.46 μM)。確定陽性藥依達拉奉的給藥濃度為20 μM。

表1 T-CA及不同濃度陽性藥對分化后擬缺血損傷PC12活性的影響

注：與Normal組比較，**P<0.01；與Model組比較，##P<0.01；與T-CA給藥組比較，△P<0.05;F:29.018,P:0.000

2.2 熒光染色觀察細胞凋亡

2.2.1 AO/EB熒光染色

吖啶橙(AO)可以透過細胞膜嵌入細胞核的DNA，發(fā)出綠色熒光。溴化乙錠(EB)只可穿透結(jié)構(gòu)不完整的細胞膜，發(fā)出橘紅色熒光，并且其亮度比綠色更高。鏡下觀察，可見有4種不同狀態(tài)的細胞：核染色質(zhì)為綠色且結(jié)構(gòu)完整的是正?；罴毎?；核染色質(zhì)為橘紅色且結(jié)構(gòu)完整的是非凋亡的死亡細胞；核染色質(zhì)為綠色但其呈固縮狀的是早期凋亡的細胞；核染色質(zhì)為橘紅色且呈固縮狀的是晚期凋亡的細胞[7-8]。如圖2所示，鏡下查看，經(jīng)AO/EB染色后可見Normal組細胞大部分狀態(tài)較好，結(jié)構(gòu)完整，呈現(xiàn)出綠色熒光，一小部分細胞開始出現(xiàn)凋亡，在細胞團集處發(fā)出橘紅色熒光，其中一些橘紅色細胞核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，是非凋亡的死亡細胞；與Normal組相比較，Model組細胞數(shù)量明顯減少，視野中大部分呈現(xiàn)橘紅色熒光，同時凋亡細胞增多；與Model組相比較，T-CA組和Positive組細胞數(shù)明顯升高，核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常且呈現(xiàn)綠色熒光，少數(shù)細胞聚集區(qū)呈現(xiàn)橘紅色熒光。

圖2 T-CA對分化后擬缺血損傷的PC12凋亡的影響(AO/EB,400×)

2.2.2 DAPI熒光染色

DAPI可穿過胞膜，從而標記并結(jié)合細胞內(nèi)的雙鏈DNA，可產(chǎn)生高于DAPI自身20多倍的熒光，其靈敏度優(yōu)于EB。熒光顯微鏡下觀察可見藍色熒光的細胞，其標記接近100%[9]。鏡下觀察，Normal組細胞胞核為均勻的藍色。而經(jīng)CoCl2造模損傷后，Model組細胞數(shù)明顯減少，同時染色質(zhì)呈固縮狀，可見典型的細胞深染征象；與Model組相比較，T-CA組和Positive組的細胞數(shù)明顯增多，同時細胞核狀態(tài)較好，大多數(shù)呈橢圓狀，見圖3。

圖3 T-CA對分化后擬缺血損傷的PC12凋亡的影響(DAPI,400×)

2.3 HE染色觀察細胞形態(tài)變化

HE染色在實驗研究中常被用于細胞形態(tài)學(xué)的觀察。鏡下查看，Normal組細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞體為多角形，明顯可見NGF分化后產(chǎn)生的神經(jīng)突起，形成網(wǎng)絡(luò)；經(jīng)CoCl2損傷后，Model組細胞結(jié)構(gòu)不完整且數(shù)量明顯下降，大部分細胞胞體變圓或碎裂，細胞表面出現(xiàn)皺縮而體積變小，同時可見神經(jīng)突起變短或消失；與Model組相比，T-CA組和Positive組細胞結(jié)構(gòu)較完整，同時細胞數(shù)明顯增多，神經(jīng)突起生成較長并形成網(wǎng)絡(luò)，與Model細胞無明顯差異。細胞形態(tài)見圖4。

圖4 T-CA對擬缺血損傷后PC12形態(tài)的影響(HE,400×)

2.4 免疫細胞化學(xué)檢測Bad和Bcl-xl的表達情況

本課題通過免疫細胞化學(xué)實驗來進一步研究T-CA減少細胞凋亡的機制，檢測細胞凋亡中相關(guān)蛋白Bad和Bcl-xl的表達情況。結(jié)果顯示，只在細胞漿和胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒的是Bad陽性細胞。與Normal組相比，Model組細胞可見大量的棕黃色顆粒，陽性更強，甚至細胞核也出現(xiàn)深染；與Model組相比， T-CA組和Positive組棕黃色顆粒數(shù)量明顯較減少，著色程度明顯出現(xiàn)減弱，見圖5。

圖5 免疫細胞化學(xué)法檢測T-CA對擬缺血損傷后PC12細胞Bad蛋白表達的影響(400×)

結(jié)果顯示，Bcl-xl陽性蛋白棕黃色顆粒也主要出現(xiàn)在細胞漿與胞膜上， Model組細胞胞膜結(jié)構(gòu)不完整甚至破裂，棕黃色顆粒表達程度減弱且較彌散；與Model組相比，T-CA組和Positive組可見棕黃色顆粒增多，著色加強，見圖6。

圖6 免疫細胞化學(xué)法檢測T-CA對擬缺血損傷后PC12細胞Bcl-xl蛋白表達的影響(400×)

2.5 Western Blot檢測NF-κB/P65與Caspase-8的表達情況

本課題通過Western blot法檢測NF-κB/P65與Caspase-8的蛋白表達水平，進一步研究川芎嗪拼合物T-CA是否涉及影響凋亡的死亡受體通路。結(jié)果顯示，經(jīng)CoCl2造模損傷后，Model組、T-CA組和Positive組細胞的NF-κB/P65的蛋白表達變化并沒有明顯的變化，灰度值分析不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Normal組相比，Model組的Caspase-8表達量明顯增強；與Model組相比，T-CA組的Caspase-8的蛋白表達有所升高；Positive組的Caspase-8的蛋白表達略微減少，灰度值分析不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。NF-κB/P65與Caspase-8的蛋白表達見圖7。

圖7 T-CA對CoCl2損傷的PC12細胞NF-κB/P65、Caspase-8表達的影響

3 討論

缺血性腦卒中屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，其基本病機主要為氣虛血瘀，瘀阻腦絡(luò)，腦脈失養(yǎng)。而血瘀證貫穿病程始終，故治療不離活血化瘀，且常配伍理氣藥以行氣活血。川芎作為臨床常用活血化瘀藥，被譽為“血中氣藥”，因而是最有希望獲取臨床有效抗腦缺血藥物的天然資源。研究表明，靜脈滴注川芎嗪可減少腦梗死體積，有效對抗腦缺血再灌注損傷[10-11]。實驗報道顯示，川芎嗪可穿透血腦屏障,減少缺血再灌注損傷區(qū)神經(jīng)元的凋亡，減輕腦損傷程度,具有顯著的缺血后腦保護作用[12-13]。川芎嗪拼合物T-CA，其結(jié)構(gòu)中含有川芎藥效的核心成分川芎嗪，另一成分香豆酸能增加其代謝活性，因而這一新化合物最能代表川芎的行氣活血作用。

PC12細胞是公認的體外研究神經(jīng)細胞功能及作用評價的常用模型[14]。PC12細胞能表達神經(jīng)生長因子受體,經(jīng)NGF誘導(dǎo)能形成神經(jīng)元樣細胞，廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究。故本實驗采用氯化鈷造模，建立了擬缺血損傷的PC12細胞模型。正常分化的細胞，胞體為多角形，神經(jīng)突起明顯；經(jīng)CoCl2造模后，細胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)變化，細胞膜結(jié)構(gòu)不完整且胞體變圓或碎裂，同時神經(jīng)突起變短或消失；給藥組細胞數(shù)量較多，細胞突起多且較長，較少細胞固縮變小。實驗結(jié)果表明，本實驗成功復(fù)制了擬缺血損傷模型，T-CA和依達拉奉均能改善缺血模型的細胞損傷。

細胞凋亡主要存在三條信號傳導(dǎo)通路，即線粒體通路、死亡受體通路以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，三條通路互相關(guān)聯(lián)[15]。線粒體通路由多種理化因素啟動，如氧化應(yīng)激、細胞內(nèi)Ca2+超載、DNA損傷、缺血缺氧、細胞生長因子缺失等[16]。Bcl-xl/Bad是調(diào)控凋亡的一對正反作用的蛋白因子。Bcl-2亞族起抑制作用，Bad起促進作用。文獻報道，Bcl-xl和Bcl-2可通過維持線粒體膜電位發(fā)揮其抗凋亡作用，同時也可干擾Caspase-3的蛋白表達，促進神經(jīng)保護作用[17]。死亡受體途徑中，死亡因子是腫瘤壞死因子(TNF)、Fas配體及與TNF相關(guān)其他凋亡誘導(dǎo)配體。死亡受體家族主要包括TNF受體、Fas/Apo-1/CD95分子以及死亡受體等。死亡因子與靶細胞上的死亡受體結(jié)合，激活的受體通過與連接蛋白或接頭蛋白結(jié)合，再激活Caspase-8，造成Caspase級聯(lián)效應(yīng)導(dǎo)致細胞凋亡[18]。TNF還可通過激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，磷酸化作用于Caspase-8，最終活化的Caspase觸發(fā)酶級聯(lián)效應(yīng)從而導(dǎo)致細胞凋亡[19]。

凋亡為缺血性腦卒中時神經(jīng)細胞死亡的重要方式，抑制凋亡是防治缺血性腦卒中的有效途徑[20-24]。如前所述，腦缺血半暗帶是可逆性損傷，而通過抑制凋亡從而保護半暗帶區(qū)神經(jīng)細胞，是可以恢復(fù)腦組織功能的。

本課題在前期實驗研究中已證實了T-CA對擬缺血損傷PC12細胞的保護作用。T-CA能通過降低游離鈣水平以及Caspase-9和Caspase-3酶的活性，同時下調(diào)Bax和細胞色素C的蛋白表達以及上調(diào)Bcl-2蛋白表達水平，從而阻斷由線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡通路，抑制凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[25]。由此可見，T-CA的抗凋亡作用主要通過線粒體通路。而本實驗擬進一步更深入地探討T-CA抗凋亡作用的機制，以及對缺血PC12細胞的保護作用是否涉及凋亡的死亡受體通路及其機制。

本實驗選擇了T-CA和陽性藥依達拉奉，觀察T-CA與依達拉奉對于NGF誘導(dǎo)分化后CoCl2損傷的PC12細胞活性的影響,發(fā)現(xiàn)T-CA可以顯著提高擬缺血損傷PC12細胞的存活率，通過AO/EB染色、DAPI染色以及HE染色，結(jié)果顯示給藥組細胞凋亡減少，細胞數(shù)量增多，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，提示T-CA可通過抑制細胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究進一步探討了凋亡中相關(guān)蛋白的表達情況，提示化合物T-CA可通過上調(diào)Bcl-xl蛋白表達以及下調(diào)Bad蛋白表達水平，從而抑制細胞凋亡。另外，T-CA與依達拉奉對NF-κB/P65的表達影響不明顯，使Caspase-8的表達升高或者降低不明顯，同時也顯示，T-CA作用靶點不涉及死亡受體途經(jīng)的凋亡通路，而是抑制了線粒體凋亡途徑。綜上，本研究表明了NGF誘導(dǎo)分化的PC12細胞具有神經(jīng)元樣表征，經(jīng)CoCl2造模損傷可成功建立缺血性神經(jīng)損傷的模型。同時，本研究進一步探討了T-CA對PC12細胞損傷的神經(jīng)保護作用及其機制，證實了T-CA的神經(jīng)保護活性，并提示了其保護作用不涉及凋亡的死亡受體通路，體現(xiàn)了其深入研究價值，開發(fā)了另一種神經(jīng)保護劑，為治療缺血性腦卒中提供了新的思路。

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