采用基因芯片技術(shù)初步篩選3，4-O-異亞丙基莽草酸治療血管性癡呆作用靶點

施佳晨，夏良育，張旭，張穎，梁耀月，董世芬，賈占紅

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

血管性癡呆(Vascular dementia，VD)是一種認(rèn)知功能下降的臨床綜合征，是由于腦組織血流量減少，局部缺血缺氧引起腦損傷所導(dǎo)致的腦血管疾病。在歐洲和美國，血管性癡呆是僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)最常見的癡呆，而在亞洲及許多發(fā)展中國家，血管性癡呆的發(fā)病率超過了阿爾茨海默病[1]，因此開發(fā)有效的治療血管性癡呆的藥物具有重要意義。

3，4-O-異亞丙基莽草酸(3，4-oxo-isopropylidene-shikimic acid，ISA)是從中藥八角茴香(IlliciumverumHook.f.)中所提取的有效成分莽草酸(Shikimic acid，SA)的化學(xué)合成衍生物[2]。前期研究證實,異亞丙基莽草酸(ISA)具有抗血栓形成[3]、抗炎[4-5]、改善局灶性腦缺血[6-7]和血管性癡呆認(rèn)知功能障礙[8-9]等作用。本研究在此基礎(chǔ)上，采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究ISA對VD作用可能的靶點和通路,為揭示ISA的作用和作用機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物

SPF級CD-1(ICR)小鼠25只，體質(zhì)量19～21 g，雄性，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥品與試劑

ISA(C10H14O5)，分子量214，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)系提供，為無色細(xì)片狀結(jié)晶，純度>98%，溶于適量去離子水中。1%戊巴比妥鈉；Agilent RNA 6000 Nano Kit；Onearray Amino Allyl aRNA Amplification Kit；Amersham Cy5 NHS Ester；Nuclease-Free Water；Pre-hybridization solution；Labeling Reagent and Hybridization Kit；Whole Genome Experssion microarray；Gene Expression Wash Buffe Ⅰ；Gene Expression Wash Buffe Ⅱ；Gene Expression Wash Buffe Ⅲ，以上試劑由華聯(lián)生物科技股份有限公司提供。

1.3 主要設(shè)備

Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)；G2940CA安捷倫2100生化分析儀(美國安捷倫科技公司)；ND1000超微量分光光度儀(賽默飛世爾科技公司)；AlphaImager 2200凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha Innotech公司)；5415R微型離心機(Eppendorf)；9700 PCR儀(Applied Biosystems)；HR-80雜交爐(COCONO)；G2505C 安捷倫微陣列芯片掃描儀(美國安捷倫科技公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模方法

適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，將小鼠隨機分為假手術(shù)組和血管性癡呆模型組。動物采用1%戊巴比妥鈉按照50 mg/kg劑量腹腔注射麻醉，仰位固定，醫(yī)用酒精消毒，無菌手術(shù)。分離單側(cè)頸總動脈，模型組小鼠用1號手術(shù)絲線進(jìn)行永久性結(jié)扎，假手術(shù)組不接扎，縫合肌肉皮膚。

1.4.2 分組與給藥

將血管性癡呆模型組小鼠按體質(zhì)量隨機分為模型組、ISA 143 mg/kg組，另設(shè)假手術(shù)組。術(shù)后恢復(fù)21天，ISA 143 mg/kg組小鼠按照10 ml/kg灌胃給藥，假手術(shù)組和模型組灌胃等體積去離子水，連續(xù)給藥21天。

1.4.3 取材方法

水迷宮實驗結(jié)束后，小鼠頸部皮膚采用醫(yī)用酒精消毒，斷頭，剪開頭部皮膚，打開顱骨，分離硬腦膜，取出全腦，稱重，迅速放入液氮，后轉(zhuǎn)移至-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 總RNA的提取、純化及芯片雜交RNA提取分離

RNA提取分離、探針標(biāo)記與雜交、基因芯片制作檢測等均由華聯(lián)生物科技股份有限公司完成。采用Trizol Reagent進(jìn)行腦部Total RNA的提取，所得的Total RNA經(jīng)吸收光譜分析定量、毛細(xì)管電泳分析后對樣品中的mRNA進(jìn)行放大和熒光染料標(biāo)記。將產(chǎn)物純化后與Phalanx OneArrayTM進(jìn)行雜交反應(yīng)，經(jīng)清洗及訊號偵測后進(jìn)入分析流程。

1.4.5 芯片掃描及數(shù)據(jù)分析

芯片雜交結(jié)果采用Agilent Microarray Scanner進(jìn)行掃描，應(yīng)用GenePixTM4進(jìn)行影像數(shù)據(jù)擷取，再運用Rosetta Resolver?System (Rosetta Biosoftware)進(jìn)行數(shù)據(jù)前處理(含數(shù)據(jù)篩選、校正)與統(tǒng)計計算等過程，根據(jù)|log2(Ratio)|≥1與P-value(Differentially expressed)≤0.05篩選有顯著差異基因，并對差異基因進(jìn)行GO功能富集和Pathway分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 差異基因的篩選結(jié)果

本實驗應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對假手術(shù)組小鼠，血管性癡呆模型小鼠和ISA給藥組小鼠腦中基因進(jìn)行分析，ISA 143 mg/kg組(D)與模型組(M)相比有253個基因差異表達(dá)，其中上調(diào)基因49個，下調(diào)基因204個(表1)；假手術(shù)組(S)與模型組(M)相比有596個基因差異表達(dá)，其中上調(diào)基因342個，下調(diào)基因254個(表2)；ISA 143 mg/kg組(D)與假手術(shù)組(S)相比有490個基因差異表達(dá)，其中上調(diào)基因150個，下調(diào)基因340個。橫坐標(biāo)為差異倍數(shù)(fold change，log2)，縱坐標(biāo)為-log(P值)作圖。紅色虛線代表P值，綠色虛線代表倍數(shù)篩選的閾值，即|Fold change|≥1且P-value<0.05。圖中每一點對應(yīng)檢出的一個基因探針(不含控制探針及flagged探針)，差異探針為藍(lán)色點，見圖1～2。

表1 給藥組和模型組主要差異表達(dá)基因

2.2 GO分析

用基因本體論(gene ontology，GO)分類標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫分析差異表達(dá)基因所涉及的生物學(xué)過程(biological process)、分子功能(molecular function)和細(xì)胞組分(cellular component)[10]。GO分析結(jié)果顯示,血管性癡呆的形成涉及41項生物過程，24項分子功能，19項細(xì)胞組成；ISA治療VD涉及40項生物過程，15項分子功能，34項細(xì)胞組成。2張芯片(假手術(shù)組vs模型組，給藥組vs模型組)共同差異基因的Go Term分析可能包括神經(jīng)突觸可塑性調(diào)節(jié)過程、突觸傳遞(谷氨酸功能)過程、化學(xué)突觸傳遞過程等，結(jié)果見表3。

表2 假手術(shù)組和模型組主要差異表達(dá)基因

圖1 假手術(shù)組/模型組火山圖

圖2 ISA 143 mg/kg組/模型組火山圖

生物過程數(shù)目P值部分基因神經(jīng)突觸可塑性的調(diào)節(jié)60.000 000 544 283Pmch, Grin1, Syp突觸傳遞,谷氨酸功能過程 50.000 228 375 000Grm2, Grin1, Slc17a7化學(xué)突觸傳遞過程90.000 476 754 000Grm2,Pmch,Grin1,Syp,Slc17a7

表4 Pathway功能分析結(jié)果

2.3 信號通路分析

通過比對KEGG等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異基因的途徑分析，2張芯片(假手術(shù)組vs模型組，給藥組vs模型組)共同差異基因的可能相關(guān)途徑見表4。其中影響較大的包括谷氨酸信號通路、可卡因成癮信號通路和5-HT信號通路等。

2.4 基因表達(dá)的分層聚類分析

采用Gene Cluster 3.0 program軟件對空白組、模型組和給藥組11個下調(diào)基因和7個上調(diào)基因的表達(dá)進(jìn)行分層聚類分析。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，并采用層次聚類算法進(jìn)行聚類分析。熱圖用Java Treeview程序生成。結(jié)果(圖3)顯示，給藥組(D)首先與空白組(S)組聚為一類，說明二者在總體基因表達(dá)上有相似的效果。聚類分析以基因為變量顯示了上調(diào)基因和下調(diào)基因的聚類結(jié)果。

圖3 3組基因表達(dá)譜的聚類圖

3 討論

近年來，癡呆已經(jīng)成為老年人的常見病，影響老年人的生活質(zhì)量并威脅其生命。老年期癡呆以阿爾茨海默型老年癡呆和血管性癡呆為主[11]，其中血管性癡呆是指由于各類腦血管病所致腦組織損害而引起的獲得性智能障礙綜合征，以記憶、認(rèn)知功能損傷為主，可能伴有語言、運動、視空間技能及人格障礙等[1]。目前血管性癡呆的發(fā)病機制仍不明確，慢性缺血缺氧和低灌注被認(rèn)為是血管性癡呆的重要原因之一。細(xì)胞凋亡、自噬激活、突觸可塑性損傷理論在血管性癡呆發(fā)病中所發(fā)揮的作用受到越來越多的關(guān)注[12]。但由于疾病分類和診斷標(biāo)準(zhǔn)仍存在不確定性，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對本病尚無有效的治療手段，而中醫(yī)藥在該病的防治上顯示出一定的優(yōu)勢。

項目前期大量動物實驗已經(jīng)證實，異亞丙基莽草酸可抑制血小板聚集和抗血栓形成[8]，具有明顯的抗炎[4-5]、改善局灶性腦缺血[6-7]和血管性癡呆認(rèn)知功能障礙[8-9]等作用。但針對ISA治療VD的機制研究仍較為局限，所提供的信息也較為單一，難以全面的認(rèn)識相關(guān)基因的表達(dá)情況。因此本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在基因水平上對ISA治療VD的作用靶點進(jìn)行初步的篩選。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是近些年來出現(xiàn)的一種高效、快速的檢測方法。該技術(shù)先將大量探針分子固定于支持物上，后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息，是探索生命機制的重要手段[13]。本實驗在前期構(gòu)建血管性癡呆動物模型并進(jìn)行異亞丙基莽草酸周期性給藥的基礎(chǔ)之上，應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測血管性癡呆小鼠和正常小鼠海馬部位基因表達(dá)，結(jié)果顯示差異表達(dá)基因有596個，其中上調(diào)基因254個，下調(diào)基因342個；檢測ISA給藥小鼠與模型小鼠海馬部位基因表達(dá)，結(jié)果顯示差異表達(dá)基因有253個，其中上調(diào)基因49個，下調(diào)基因204個。差異基因所調(diào)控的GO Term主要包括神經(jīng)突觸可塑性調(diào)節(jié)過程、突觸傳遞(谷氨酸功能)過程和化學(xué)突觸傳遞過程。

高級腦功能主要包括學(xué)習(xí)、記憶和情緒等，其物質(zhì)基礎(chǔ)是大腦神經(jīng)回路高度有序的神經(jīng)元活動，而神經(jīng)元之間的突觸聯(lián)結(jié)是神經(jīng)回路的關(guān)鍵功能節(jié)點。突觸分為兩類，一類被稱為化學(xué)突觸，借助化學(xué)信號，即遞質(zhì)，將信息轉(zhuǎn)送到突觸后細(xì)胞；另一類為電突觸，借助于電信號傳遞信息。神經(jīng)突觸可塑性，被認(rèn)為是大腦正常功能活動的分子細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶功能的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)[14]。突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)及傳遞效能可塑性的物質(zhì)基礎(chǔ)是神經(jīng)元和突觸的相關(guān)蛋白、受體及神經(jīng)遞質(zhì)的變化[15]。目前已知突觸可塑性相關(guān)蛋白有很多種，作為突觸傳遞、突觸可塑性等功能的具體執(zhí)行者，在突觸改變過程中起著非常重要的作用[16]。突觸可塑性相關(guān)蛋白表達(dá)減少可能會減弱小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，已有研究表明[16],突觸可塑性相關(guān)蛋白在血管性癡呆發(fā)病中起重要作用。

分析本實驗差異基因GO功能注釋結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)突觸可塑性調(diào)節(jié)過程和化學(xué)突觸傳遞過程均涉及Syn基因，其基因表達(dá)產(chǎn)物突觸素(Synaptophysin，SYN)是一種鈣結(jié)合蛋白，作為突觸終末特異性標(biāo)志物于突觸前囊泡膜上特異性分布，其磷酸化形式可調(diào)節(jié)谷氨酸等的釋放從而發(fā)揮突觸可塑性進(jìn)而引起囊泡轉(zhuǎn)運能力降低[17]。SYN含量的高低可反映突觸功能的強弱及突觸信息傳遞的正常與否[18]。已有研究表明[19]，海馬結(jié)構(gòu)中Syn表達(dá)下降會嚴(yán)重影響學(xué)習(xí)記憶能力，且永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈的VD大鼠海馬結(jié)構(gòu)中SYN蛋白和mRNA表達(dá)下降，使學(xué)習(xí)記憶能力下降，進(jìn)而參與形成血管性癡呆[17]。王晶等研究發(fā)現(xiàn)[18]，ISA給藥后的慢性低灌注大鼠海馬中的Syn蛋白和mRNA表達(dá)增加，突觸可塑性增強，進(jìn)而保護(hù)錐體神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的完整性，改善學(xué)習(xí)記憶能力。

通過整理信號通路分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，谷氨酸信號通路及可卡因成癮信號通路均涉及Dlg4基因，該基因編碼了一種特殊的突觸后致密物(postsynaptic density，PSD)——突觸后致密物-95(PSD-95)。PDS的成分改變是突觸生化變化的基礎(chǔ)，能調(diào)控信號的傳導(dǎo)，例如PSD可以調(diào)控與記憶有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸所引發(fā)的神經(jīng)元信號：當(dāng)谷氨酸從突觸前膜釋放到突觸間隙，可以結(jié)合突觸后的離子通道和代謝型谷氨酸受體，從而加速神經(jīng)元下游信號的傳導(dǎo)[20]，而結(jié)合在突觸后膜的PSD能調(diào)控上述信號的傳導(dǎo)。PSD-95作為支架蛋白與N-甲基D-天(門)冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDAR)及其他谷氨酸鹽受體、細(xì)胞黏附蛋白等相連形成NMDA受體復(fù)合物(NMDA receptor complex，NRC)。PSD-95被認(rèn)為是該信號復(fù)合體的核心，且其蛋白的水平會隨NMDAR的活性而改變[21-22]。

研究表明[22-23]，PSD-95與NMDAR參與海馬CA1區(qū)長時程增強(long-term potentiation，LTP)等突觸可塑性誘導(dǎo)及學(xué)習(xí)和記憶機制。敲除Dlg4基因的小鼠會出現(xiàn)LTP誘導(dǎo)障礙及學(xué)習(xí)記憶能力下降的現(xiàn)象，提示PSD-95可能通過與NMDAR的相互作用，使該受體偶聯(lián)于突觸可塑性通路及學(xué)習(xí)記憶的調(diào)控通路上[22]。然而有研究表明[24]，在病理情況下，抑制PSD-95的表達(dá)或抑制PSD-95與NMDAR的結(jié)合對興奮性毒性和缺血性腦損傷有保護(hù)作用。在本實驗中，ISA給藥組小鼠Dlg4基因的表達(dá)低于VD模型組，推測可能是由于ISA 通過抑制其表達(dá)對小鼠缺血性腦損傷進(jìn)行保護(hù)。

綜上，我們篩選出一些重要基因，通過進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究驗證其可行性，進(jìn)而對深入探究ISA治療VD的具體機制和分子靶點提供科學(xué)依據(jù)，推動VD相關(guān)創(chuàng)新藥物的開發(fā)研究。

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