甘草苷對H2O2所致SH-EP1細(xì)胞株氧化應(yīng)激損傷中細(xì)胞活力值及細(xì)胞中線粒體凋亡分子、抗氧化分子含量的影響

陳晶晶，李向進(jìn)

(新疆烏魯木齊明園職工醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

細(xì)胞衰老是細(xì)胞增殖、分化能力隨著時(shí)間的推移逐漸退化的過程，其中造成生物體衰老的重要程序是由自由基引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷[1-4]。人體中氧化與抗氧化失衡導(dǎo)致的蛋白增加稱為氧化應(yīng)激,一旦氧化反應(yīng)過度，會(huì)直接導(dǎo)致各個(gè)器官組織氧化應(yīng)激損傷。研究證明，氧化應(yīng)激容易導(dǎo)致糖尿病，可引起動(dòng)脈硬化，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等病癥。在不嚴(yán)重情況下，一般引起情緒焦慮、頭疼、容易疲倦等癥狀。氧化應(yīng)激的形成原因是多方面的，營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏、外部環(huán)境因素、自身感染等都可導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷。甘草苷(Liquiritin)[5-9]存在于豆科植物根部，甜度值極高，約為蔗糖甜度的100～500倍，且內(nèi)含活性成分，具有抗氧化作用，可以保護(hù)細(xì)胞組織、阻止氧化及炎癥因子的損傷。研究表明，甘草苷對動(dòng)脈硬化病癥具有一定的改善作用[10]。本研究探討甘草苷對H2O2所致SH-EP1細(xì)胞株氧化應(yīng)激損傷的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

于ATCC公司購買SH-EP1細(xì)胞株，將接種細(xì)胞板后的細(xì)胞分為3組，即對照組、甘草苷組及H2O2組，每組10例。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理方法

將SH-EP1細(xì)胞株(ATCC公司)復(fù)蘇，利用培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Hyclone公司)及血清常規(guī)進(jìn)行培養(yǎng)、遺傳，待細(xì)胞接種至細(xì)胞板且密度在85%左右時(shí)。對照組不給予血清處理；甘草苷組采用100、200、400 μmol/L濃度的甘草苷與200 μmol/L的H2O2聯(lián)合處理，記為甘草苷1、2、3組；H2O2組采用200 μmol/L濃度的過氧化氫(Sigma公司)處理。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測

于96孔細(xì)胞板中接種的遺傳新生細(xì)胞在不同方式下處理1 d,2 d,3 d,4 d后，于孔內(nèi)加入20 μL CCK-8檢測液(上海碧云天公司)，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)讀取OD值(45 nm處)，即細(xì)胞活力值。

1.2.3 蛋白含量檢測方法

于12孔細(xì)胞板中接種的遺傳新生細(xì)胞在不同方式下處理1 d后，除去培養(yǎng)基，加入蛋白裂解液60 μL，使用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞破碎，采取懸液離心、除去殘?jiān)?，酶?lián)免疫吸附試劑盒測定Bax(南京建成公司)、凋亡抑制蛋白(XIAP)、Bcl-2、Caspase-3、Nrl2、ARE的含量,放射免疫沉淀試劑盒(南京建成公司)測定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GHS-Px)、血紅素氧合酶(H0-1)的含量。

1.3 觀察指標(biāo)

分析比較各組間細(xì)胞活性、SH-EP1細(xì)胞株中線粒體凋亡分子Bcl-2、XIAP、Bax、Caspase-3含量及抗氧化分子SOD、Nrf2、GHS-Px、ARE、HO-1的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組SH-EP1細(xì)胞株細(xì)胞活力值比較

表1表明，經(jīng)過4 d處理后，相同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，H2O2組細(xì)胞活力值與對照組比較相對較低，甘草苷1、2、3組細(xì)胞活力值均高于過氧化氫組，且甘草苷2、3組細(xì)胞活力值高于1組，說明甘草苷濃度越高，細(xì)胞活力值越高，以上結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同期間內(nèi)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組SH-EP1細(xì)胞株中線粒體凋亡分子Bax、XIAP、Bcl-2、Caspase-3含量比較

表2表明，線粒體凋亡分子中，H2O2組Bax、Caspase-3含量相對高于對照組，XIAP、Bcl-2含量較低，甘草苷1、2、3組Bax、Caspase-3與H2O2組比較，含量較低，XIAP、Bcl-2與H2O2組比較，含量較高，且甘草苷組在濃度逐漸增加情況下，Bax、Caspase-3含量逐漸減少，XIAP、Bcl-2含量逐漸增加，以上結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組SH-EP1細(xì)胞株細(xì)胞活力值比較

注：與對照組比較，*P<0.05;與H2O2組比較，#P<0.05;與甘草1組比較，△P<0.05

表2 各組SH-EP1細(xì)胞株中線粒體凋亡分子Bax、XIAP、Bcl-2、Caspase-3含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05;與H2O2組比較，#P<0.05;與甘草1組比較，△P<0.05;與甘草2組比較,#P<0.05

2.3 各組SH-EP1細(xì)胞株中抗氧化分子的含量比較

表3表明，各組抗氧化分子，H2O2組Nrf2、ARE含量高于對照組，GHS-Px、SOD、HO-1含量較低，甘草苷1、2、3組細(xì)胞中抗氧化分子的含量均高于H2O2組，且隨著濃度增加甘草苷組抗氧化分子含量逐漸增加，以上結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組SH-EP1細(xì)胞株中抗氧化分子Nrf2、ARE、SOD、GHS-Px、HO-1的含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05;與H2O2組比較，#P<0.05;與甘草1組比較，△P<0.05;與甘草2組比較,#P<0.05

3 討論

細(xì)胞衰老的主要因素是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元的損傷造成的，近年來在神經(jīng)元的研究中發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激損傷可導(dǎo)致神經(jīng)元丟失、損傷，且神經(jīng)功能減退。因此，氧化應(yīng)激損傷越來越受到關(guān)注。神經(jīng)元含有自身內(nèi)部氧化系統(tǒng)，不會(huì)引起氧化應(yīng)激損傷，如果自身無法承受過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)，就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷[11]。Nrf2、ARE是體內(nèi)重要的氧化系統(tǒng)，當(dāng)Nrf2與ARE在體內(nèi)發(fā)生結(jié)合反應(yīng)后，可增加SOD、GHS-Px及HO-1氧化酶的含量，增加細(xì)胞的抗氧化能力。線粒體凋亡主要是活性氧及過氧化氫等直接作用于細(xì)胞色素C，通過激活Caspase導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。細(xì)胞分子Bax、Bcl-2可調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C，前者促進(jìn)細(xì)胞凋亡，后者抑制細(xì)胞凋亡，且XIAP與Bcl-2聯(lián)合可減慢細(xì)胞凋亡速度。甘草苷在一定程度上可抑制細(xì)胞凋謝，增加細(xì)胞活力值[13-20]。

經(jīng)過4 d處理后，相同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，H2O2組細(xì)胞活力值與對照組比較相對較低，甘草苷1、2、3組細(xì)胞活力值均高于過氧化氫組，說明過氧化氫可降低細(xì)胞株活力值，損傷神經(jīng)元細(xì)胞；且甘草苷2、3組細(xì)胞活力值高于1組，說明甘草苷濃度越高，細(xì)胞活力值越大，一定程度上減輕H2O2對神經(jīng)元造成的損傷；不同時(shí)間內(nèi)，結(jié)果相同。線粒體凋亡分子中，H2O2組Bax、Caspase-3含量與對照組相比較高，XIAP、Bcl-2含量較低，說明H2O2可加快細(xì)胞線粒體凋亡速度；甘草苷1、2、3組Bax、Caspase-3含量與H2O2組相比較低，XIAP、Bcl-2含量較高，且甘草苷組在濃度增加情況下，Bax、Caspase-3含量逐漸減少，XIAP、Bcl-2含量逐漸增加，說明甘草苷可抑制線粒體凋亡。各組抗氧化分子，H2O2組Nrf2、ARE含量高于對照組，GHS-Px、SOD、HO-1含量較低，甘草苷1、2、3組SOD、Nrf2、ARE、GHS-Px、HO-1含量均高于H2O2組，且甘草苷2組抗氧化分子含量高于甘草苷1組，甘草苷3組高于甘草苷2組，說明甘草苷組隨著濃度增加，抗氧化分子含量逐漸增加，可有效增加細(xì)胞的抗氧化能力，減少損傷。

綜上所述，甘草苷可以抑制細(xì)胞凋亡、增加細(xì)胞活力值、提高細(xì)胞的抗氧化能力，對細(xì)胞具有保護(hù)作用。

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