不同濃度補腎通絡(luò)方對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠OPG/RANKL系統(tǒng)mRNA的影響

楊帆，袁芳，侯秀娟，朱躍蘭*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是臨床上常見的一種漸進性、退行性的關(guān)節(jié)疾病，發(fā)病年齡逐漸呈現(xiàn)年輕化的趨勢，越來越受到人們的關(guān)注[1]。OA的有關(guān)發(fā)病機理尚不是十分清楚，目前對OA的認(rèn)識主要是關(guān)節(jié)表面軟骨組織發(fā)生破壞,又進一步加重軟骨細(xì)胞膠原蛋白降解且抑制軟骨細(xì)胞合成因子的表達(dá)，二者相互作用使得OA病變進行性加重，是關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)糜爛、潰瘍、缺失等一系列改變的重要原因[2]。近年來，越來越多的研究認(rèn)為OA的發(fā)病并不局限于關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨組織中，與之相關(guān)的滑膜、韌帶、軟骨下骨等乃至機體免疫功能紊亂均可以成為OA發(fā)病的主要因素[3-4]。本研究是通過對大鼠KOA模型采用不同濃度中藥進行干預(yù)，分析其對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中成骨/破骨細(xì)胞系統(tǒng)的影響情況，從分子生物學(xué)水平觀察OPG/RANKL系統(tǒng)中mRNA的表達(dá)情況，闡述補腎通絡(luò)方對大鼠KOA模型膝關(guān)節(jié)骨重建的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康清潔級Wistar大鼠36只，雄性，體質(zhì)量180～220 g。由北京斯貝福生物科技股份有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0002。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心的普通環(huán)境中，自然光線照射，室溫20～22℃，濕度46%～60%，水瓶給水，自由進食，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 主要藥品、試劑和儀器

美洛昔康片(7.5 mg/片，上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20090789)；補腎通絡(luò)方(組方：骨碎補9 g、桑寄生15 g、川牛膝12 g、雞血藤15 g、白芍12 g、穿山龍15 g、川芎10 g，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院顆粒藥房提供的配方顆粒)；木瓜蛋白酶粉劑(25 g/瓶，北京索萊寶科技有限公司提供);UltraPure Agarose、SuperScript III RT反轉(zhuǎn)錄kit(ABI-invitrogen)。

低溫高速離心機5810R(Eppendorf AG公司)；核酸濃度測定儀(THERMO)；ABI 7900 Q-PCR儀(Applied biosystems)；電泳儀和凝膠成像儀(Biorad)。

1.3 引物設(shè)計

Real-time PCR檢測目的基因引物，以下引物均由北京Invitrogen公司合成，見表1。

表1 引物序列

2 實驗方法

2.1 實驗動物模型制備

參照文獻[5]，配制4 %木瓜蛋白酶溶液，每次于大鼠雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.2 ml/肢，分別于造模的第1、4、7天進行注射，方法與劑量相同，共3次。正常組大鼠不注射任何溶液。

2.2 實驗動物分組及給藥

購進后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,制備KOA模型。模型制備成功后按照隨機數(shù)字表法將36只Wistar大鼠隨機分為6組，分別為正常組、模型組、西藥組、中藥低劑量組、中藥中劑量組和中藥高劑量組，每組6只。

造模成功后第2天即可開始給藥，正常組及模型組大鼠均給予蒸餾水灌胃10 ml/kg。根據(jù)大鼠與人的體表面積比值進行換算[6]，西藥組大鼠給予0.781 3 mg/kg的美洛昔康混懸液灌胃，中藥低、中、高劑量組分別予0.52 g/kg、1.04 g/kg、2.08 g/kg的補腎通絡(luò)顆粒制成的混懸液灌胃。每天灌胃給藥1次，連續(xù)4周。

2.3 HE染色方法

取大鼠膝關(guān)節(jié)股骨髁，切片常規(guī)脫蠟，蘇木精染色4 min，1 %鹽酸酒精分化液分色10 s，伊紅染色3 min，脫水透明封片。觀察軟骨組織結(jié)構(gòu)、軟骨細(xì)胞與軟骨下骨的變化。

2.4 RT-PCR測定方法

參考相關(guān)資料[7]，取膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)股骨內(nèi)外側(cè)髁及脛骨平臺退變區(qū)的軟骨約10 mg置于Trizol液1 ml中勻漿，加入氯仿200 μl混勻，1 400 r/min 離心15 min，取上清加入等體積異丙醇，12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入75 %乙醇混勻，10 000 r/min離心5 min，棄上清，用50 μl無菌DEPC處理過的三蒸水溶解沉淀以完成總RNA的提取。之后進行擴增條帶：95 ℃預(yù)變性2 min，將PCR反應(yīng)溶液置于Real-time PCR儀上進入40個PCR反應(yīng)(94 ℃變性20 s；65 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸5 min)。PCR產(chǎn)物與100 bp DNA Ladder在2 %瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶，擴增產(chǎn)物在1.5 %瓊脂糖凝膠上電泳，紫外投射儀下觀察擴增產(chǎn)物特異條帶。為建立PCR產(chǎn)物的溶解曲線，擴增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72 ℃緩慢加熱到99 ℃(每5 s升高1 ℃)。

2.5 觀察指標(biāo)

1)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)觀察：HE染色對軟骨進行Mankin’s評分；2)mRNA含量測定：用RT-PCR法檢測膝關(guān)節(jié)軟骨中OPG、RANKL的mRNA表達(dá)。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

3 實驗結(jié)果

3.1 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨病理評分

大鼠在造模后無傷口感染等情況發(fā)生，8 h后基本可進行正常的膝關(guān)節(jié)活動，各組大鼠的活動步態(tài)無肉眼可見的明顯差別。根據(jù)表2對膝關(guān)節(jié)軟骨進行Mankin’s評分[8]。結(jié)果見表3。

表2 OA軟骨退行性改變組織學(xué)分級(Mankin’s評分)

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s評分比較

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01；不同濃度中藥組間比較，△P<0.01

3.2 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中OPG、RANKL的mRNA表達(dá)

軟骨中OPG、RANKL的相對定量，以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法分析，可知其表達(dá)情況。對各組的2-△△Ct值統(tǒng)計學(xué)分析見表4、圖1。

表4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中OPG、RANKLmRNA表達(dá)及二者比值情況比較

注：與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

圖1 軟骨中OPG、RANKL的mRNA擴增與溶解曲線

軟骨中OPG的mRNA含量情況是在模型組中最低(P<0.05)，正常組中最高(P<0.05)，中藥中劑量組含量接近高劑量組，而在低劑量組中表達(dá)最少，且中劑量組與高劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。RANKL的mRNA表達(dá)情況是模型組最高(P<0.05)，正常組最低(P<0.05)，不同濃度的中藥對其影響不同，其中高劑量組表達(dá)在各濃度中最小，但不同濃度中藥且之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。其二者的比值變化趨勢與OPG相類似，以模型組最小，正常組最大，隨著中藥濃度的升高，其比值逐漸增加，且中劑量組與高劑量組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

4 討論

既往研究證實[9-12]，骨骼的形態(tài)生長與重建是由一組對立統(tǒng)一系統(tǒng)調(diào)控，即成骨細(xì)胞(OB)介導(dǎo)的骨基質(zhì)合成過程和破骨細(xì)胞(OC)介導(dǎo)的骨吸收過程。OPG、RANKL和RANK形成的局部調(diào)節(jié)體系，在骨生長、發(fā)育及骨構(gòu)塑、重建中起著十分重要的作用。各種骨吸收刺激因子作用于OB和骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSC)，使其表達(dá)RANKL，并且與OC前體細(xì)胞及OC表面的RANK結(jié)合，促進OC分化、成熟和激活，介導(dǎo)骨質(zhì)吸收；而OB和MSC可以分泌OPG，其與RANK競爭性結(jié)合RANKL，阻止RANKL與RANK之間的結(jié)合，抑制OC分化成熟，防止骨質(zhì)被過分吸收。由此可見，OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)可以影響OC的功能，OPG的增加可以抑制破骨細(xì)胞的分化，是一種骨保護素；而RANKL的增加則會促進其增殖分化。特別是OPG/RANKL的比值變化可以直接影響破骨細(xì)胞的增殖分化[13-15]，若其比值降低，不論是單純OPG下降或RANKL升高，抑或是OPG增加均不如RANKL增加明顯，都會促進破骨細(xì)胞的增殖分化，骨質(zhì)代謝也會受到進一步的影響，導(dǎo)致骨破壞的發(fā)生。

補腎通絡(luò)方主要是由骨碎補、桑寄生、川牛膝、雞血藤、白芍、穿山龍、川芎等藥物組成。在治療骨關(guān)節(jié)炎方面,朱躍蘭主任將補益肝腎與通經(jīng)活絡(luò)配合使用，由于“骨痹”的發(fā)病多以臟腑內(nèi)傷、肝腎虧虛、氣血失調(diào)為本病之本；外感風(fēng)寒濕熱或內(nèi)生血瘀痰濁為本病之標(biāo)，因此，治療痹癥不宜單純地專事通散，而應(yīng)在補益肝腎、調(diào)補氣血的基礎(chǔ)上，予以通散之劑。本病常見于中老年人，系年邁體弱、正氣耗損、氣血不足，若復(fù)感外邪，氣郁痰滯血瘀阻礙于經(jīng)絡(luò)而發(fā)病，主要涉及肝、脾、腎三臟[16-17]。《類證治裁·痹證》有云：“諸痹……良由營衛(wèi)先虛，腠理不密，風(fēng)寒濕乘虛內(nèi)襲。正氣為邪阻，不能宣行，因而滯留，氣血凝滯，久而成痹?！北砻髌洳C為正虛邪留，氣血凝澀不通，虛實夾雜，以肝腎虧虛為根本，痰瘀阻絡(luò)為標(biāo)實。因此治療上以補益肝腎同時配合活血通絡(luò)之品，肝腎得補、筋骨得養(yǎng)，深入骨髓經(jīng)隧之風(fēng)濕外邪得以祛除。即所謂的“通補兼施”之法，通補二法結(jié)合，在處方選藥中靈活運用，使虧虛之肝腎得以補益,同時瘀滯之氣血得以通調(diào)。相關(guān)實驗研究表明[18-20]，本方具有一定的抑制KOA模型大鼠血清中炎性細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)膝關(guān)節(jié)軟骨含水量等作用，進而改善KOA的炎癥疼痛、腫脹、活動受限等表現(xiàn)，在臨床上收效頗豐。

本研究表明，應(yīng)用補腎通絡(luò)方進行灌胃給藥干預(yù)后，通過對膝關(guān)節(jié)病理形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的破壞程度最為嚴(yán)重，提示模型復(fù)制成功，通過不同濃度中藥灌胃干預(yù)后其病理學(xué)評分逐漸趨于正常組，提示藥物的有效性，其中西藥組與中藥低劑量組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義,可見藥物治療后能夠改善膝關(guān)節(jié)軟骨受損的嚴(yán)重程度。通過比較膝關(guān)節(jié)軟骨OPG/RANKL系統(tǒng)mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示OPG mRNA表達(dá)模型組最低(P<0.05)，正常組最高(P<0.05)，中藥中劑量組含量接近高劑量組，而在低劑量組表達(dá)最少，且中劑量組與高劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。RANKL mRNA表達(dá)情況是模型組最高(P<0.05)，正常組最低(P<0.05)，不同濃度的中藥對其影響不同，其中高劑量組表達(dá)在各濃度中最小，但不同濃度中藥組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗研究結(jié)果提示,模型組破骨細(xì)胞分化成熟程度最嚴(yán)重，加速骨質(zhì)破壞，加重KOA病情嚴(yán)重程度，隨著中藥濃度的增加，對疾病的改善作用也逐漸加大，低劑量組作用最弱；對于OPG的表達(dá)水平是中劑量組與高劑量組的作用相當(dāng)，無明顯差異；對于RANKL的表達(dá)水平則是不同濃度中藥組之間影響不明顯，可能與實驗動物數(shù)量較少，統(tǒng)計學(xué)樣本量不夠大有關(guān)，可以在今后的實驗研究中做進一步的改進與完善。

綜上所述，補腎通絡(luò)方能夠提高KOA模型大鼠軟骨中OPG的mRNA表達(dá)水平，降低RANKL水平，具有雙向調(diào)節(jié)OPG/RANKL軸系統(tǒng)的作用。既可以促進成骨，又可以抑制或延緩破骨，維持KOA大鼠模型中OB/OC活動的平衡，改善骨質(zhì)代謝水平，緩解KOA病情進一步進展，為補腎通絡(luò)方更好地應(yīng)用于臨床提供有利的科學(xué)基礎(chǔ)。

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