半夏瀉心湯全方及其不同組分對幽門螺桿菌感染小鼠的作用及機制分析

吳新輝，周燁鑫，成克用，吳潤秋

(長沙醫(yī)學院，湖南 長沙 410219)

幽門螺旋桿菌(Hp)是定植于胃腸道黏膜的螺旋狀、微需氧革蘭氏陰性桿菌，Hp感染是造成慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等上消化道疾病的重要病因[1-2]。消化道黏膜局部的Hp能夠通過模式識別受體TLR2、TLR4來激活炎癥反應(yīng)，進而造成消化道黏膜損傷。此外，長期Hp感染還會造成原癌基因激活、增加胃癌的發(fā)生風險[3]。因此，根除Hp是預(yù)防和治療多種上消化道疾病的關(guān)鍵。半夏瀉心湯出自張仲景的《傷寒論》，是治療“心下痞”的代表性中藥方劑，被證實能夠在消化性潰瘍的治療中取得積極治療效果[4]。該方劑包含具有清熱解毒作用的組分和具有扶正補益作用的組分，關(guān)于不同組分對幽門螺桿菌的根除作用尚未明確,因此在下列研究中，我們具體分析了半夏瀉心湯全方及不同組分治療幽門螺桿菌感染小鼠的療效及分子機制。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

選擇C57小鼠作為實驗動物，均為雄性，6～8周齡,體質(zhì)量18～22 g，購于湖南動物實驗中心，動物許可證號SCXK 20120005。

半夏瀉心湯全方由生半夏、黃芩、黃蓮、干姜、人參、大棗、甘草組成，清熱解毒組分由黃芩、黃連組成，扶正補益組分由人參、大棗組成，藥劑科按常規(guī)煎煮,濃縮為1 g/ml的溶液。

幽門螺旋桿菌SS1(ATCC公司)；RIPA蛋白裂解液和BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 Hp培養(yǎng)及菌液制備方法

將SS1幽門螺旋桿菌在含有8%脫纖維羊血清的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基中復(fù)蘇，在15% CO2、5%O2、80%NO2的微需氧環(huán)境下培養(yǎng)48～72 h，陽性菌落擴增培養(yǎng)，經(jīng)快速尿素酶鑒定后用布氏肉湯收集SS1幽門螺旋桿菌并調(diào)節(jié)密度至109CFU/ml，備用。

1.2.2 動物分組及造模方法

實驗動物隨機分為對照組、模型組、干預(yù)A組、干預(yù)B組、干預(yù)C組。模型組及3組干預(yù)組均按下列方法建立幽門螺旋桿菌感染的動物模型：禁食24 h后給予5%碳酸氫鈉溶液灌胃，30 min后給予含有109CFU/ml SS1幽門螺旋桿菌的菌液0.2 ml灌胃，連續(xù)灌胃4次、每次間隔48 h。對照組每次給予等劑量生理鹽水灌胃。

1.2.3 藥物干預(yù)方法

干預(yù)A組給予半夏瀉心湯全方進行干預(yù)，用全方原藥材濃度為1 g/mL的藥液灌胃，0.2 ml/次,1次/天,連續(xù)8天。干預(yù)B組給予半夏瀉心湯清熱解毒組分(黃芩、黃連)進行干預(yù)，用黃芩、黃連原藥材濃度為1 g/mL的藥液灌胃，0.2 ml/次,1次/天,連續(xù)8天。干預(yù)C組給予半夏瀉心湯扶正補益組分(人參、大棗)進行干預(yù)，用人參、大棗原藥材濃度為1 g/mL的藥液灌胃，0.2 ml/次,1次/天,連續(xù)8天。模型組用0.2 ml的生理鹽水灌胃。

1.2.4 幽門螺旋桿菌根除評估方法

干預(yù)8天后，處死5組小鼠，取胃組織并沿胃大彎剪開，DEPC水沖洗胃內(nèi)容物后取一半胃黏膜組織，分別進行快速尿素酶(RUT)試驗和W-S染色，RUT試驗和W-S染色均為陰性的樣本為幽門螺旋桿菌陰性,判定幽門螺旋桿菌根除。

1.2.5 胃黏膜內(nèi)炎癥反應(yīng)程度評估方法

取DEPC水沖洗后的另一半胃黏膜組織，加入RIPA裂解液后充分勻漿，提取組織中的蛋白質(zhì)，采用BCA試劑盒測定總蛋白含量，酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定TLR2、TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8的含量，計算每毫克總蛋白中TLR2、TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8的表達量。

1.2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS20.0軟件錄入數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計分析，多組間計量資料的比較采用方差分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 幽門螺旋桿菌根除情況

模型組幽門螺旋桿菌的感染率為100%、根除率0%；干預(yù)A組幽門螺旋桿菌治療后的感染率為25.0%(2/8)、根除率75.0%；干預(yù)B組幽門螺旋桿菌治療后的感染率為62.5%(5/8)、根除率37.5%；干預(yù)C組幽門螺旋桿菌治療后的感染率為75.0%(6/8)、根除率25.0%。經(jīng)卡方檢驗，干預(yù)A組、干預(yù)B組、干預(yù)C組的幽門螺旋桿菌根除率均高于模型組(P<0.05)，干預(yù)A組的幽門螺旋桿菌根除率高于干預(yù)B組和干預(yù)C組(P<0.05)，干預(yù)B組與干預(yù)C組間幽門螺旋桿菌的根除率比較無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 胃黏膜中TLRs/NF-κB通路表達量的比較

模型組小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表達量顯著高于對照組(P<0.05)，干預(yù)B組和C組、干預(yù)B組、干預(yù)C組小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表達量顯著低于模型組(P<0.05)，干預(yù)A組小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表達量顯著高于干預(yù)A組(P<0.05)，干預(yù)B組與干預(yù)C組間胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表達量比較無顯著性差異(P>0.05)。具體情況見表1。

表1 各組小鼠胃黏膜中TLRs/NF-κB通路表達量的比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，&P<0.05；與干預(yù)A組比較，aP<0.05

2.3 炎癥介質(zhì)表達量的比較

模型組小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表達量顯著高于對照組(P<0.05)，干預(yù)A組、干預(yù)B組、干預(yù)C組小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表達量顯著低于模型組(P<0.05)，干預(yù)B組和C組小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表達量顯著高于干預(yù)A組(P<0.05)，干預(yù)B組與干預(yù)C組間胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表達量比較無顯著性差異(P>0.05)。具體情況見表2。

表2 各組小鼠胃黏膜中炎癥介質(zhì)表達量的比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，&P<0.05；與干預(yù)A組比較，aP<0.05

3 討論

幽門螺旋桿菌(Hp)感染是引起慢性胃炎、消化性潰瘍等慢性上消化道疾病的主要致病因素，Hp長期未能根除會誘導(dǎo)胃黏膜萎縮以及腸上皮化生，進而增加胃癌、胃相關(guān)惡性淋巴瘤等惡性腫瘤的發(fā)生風險[5-6]。因此，根除Hp是治療和預(yù)防多種上消化道疾病的有效手段。中醫(yī)學認為，Hp感染能夠引起寒熱錯雜、胃熱脾寒，清熱解毒、扶正補益是中醫(yī)根除Hp感染的常規(guī)思路。已有臨床研究表明，半夏瀉心湯治療Hp陽性的消化性潰瘍能夠取得確切療效[7]；相關(guān)基礎(chǔ)研究證實，半夏瀉心湯的含藥血清能夠有效抑制Hp的體外繁殖[8]。在本研究中，為了明確半夏瀉心湯對Hp在體繁殖的影響，我們對半夏瀉心湯全方及各組分干預(yù)后的Hp清除率進行了分析，半夏瀉心湯全方干預(yù)后的Hp清除率達到75.0%，而熱解毒組分及扶正補益組分干預(yù)后的Hp清除率達到37.5%和25.0%。這就說明半夏瀉心湯全方及各組分均具有一定的Hp清除作用，半夏瀉心湯全方對Hp的清除價值優(yōu)于清熱解毒組分及扶正補益組分干預(yù)。由此也提示，半夏瀉心湯對Hp的清除作用依賴于各種藥物成分的配伍，單獨使用各組分無法達到半夏瀉心湯全方的藥理價值。

Toll樣受體(TLRs)是體內(nèi)重要的模式識別受體，能夠識別多種病原模式分子并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[9-10]。在Hp的感染過程中，TLRs中的TLR2和TLR4能夠識別局部胃黏膜中的Hp，進而通過下游MyD88、IRAK、TRAF6等接頭分子來激活NF-κB，激活后的NF-κB轉(zhuǎn)位進入細胞核并啟動多種炎癥介質(zhì)的表達、激活胃黏膜內(nèi)的炎癥反應(yīng)[11-12]。本研究證實，模型組小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表達量顯著高于對照組,說明幽門螺旋桿菌作為一種病原模式分子，能夠顯著激活TLR2、TLR4，進而增加核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達。進一步分析半夏瀉心湯對幽門螺旋桿菌感染過程中TLRs/NF-κB通路的影響,可知經(jīng)過半夏瀉心湯全方及各組分干預(yù)后，小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表達量顯著低于模型組，且半夏瀉心湯全方干預(yù)后，小鼠胃黏膜中TLR2、TLR4、NF-κB的表達量顯著低于各組分的干預(yù)。由此說明半夏瀉心湯全方及清熱解毒組分、扶正補益組分均能顯著抑制幽門螺旋桿菌感染過程中TLRs/NF-κB通路的激活，且半夏瀉心湯全方干預(yù)對TLRs/NF-κB通路的抑制效應(yīng)優(yōu)于單獨使用清熱解毒組分及扶正補益組分進行干預(yù)。

TLR2和TLR4激活所介導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)位入核能夠啟動TNF-α、IL-6、IL-8等多種炎性因子的表達[13]。TNF-α是在炎癥反應(yīng)啟動過程中最先發(fā)生改變的細胞因子，不僅能夠直接造成局部組織發(fā)生炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)炎癥性損傷，還能促進多種炎癥細胞在病灶內(nèi)浸潤、放大炎癥反應(yīng)[14]。IL-6是具有多種生物學效應(yīng)的細胞因子，能夠調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，在炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。IL-8是重要的內(nèi)源性趨化因子，能夠促進單核巨噬細胞、淋巴細胞等炎癥細胞在病灶內(nèi)的遷移和浸潤，進而激活炎癥反應(yīng)[16]。本研究對胃黏膜中上述炎癥介質(zhì)表達量的分析證實,模型組小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表達量顯著高于對照組。這就說明幽門螺旋桿菌感染過程中，TLRs/NF-κB通路的激活能夠顯著增加炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6、IL-8的表達。進一步分析半夏瀉心湯對幽門螺旋桿菌感染過程中TLRs/NF-κB通路下游炎癥介質(zhì)表達的影響可知,半夏瀉心湯全方及各組分干預(yù)后，小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表達量顯著低于模型組,且半夏瀉心湯全方干預(yù)后，小鼠胃黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8的表達量顯著低于各組分的干預(yù)。由此說明半夏瀉心湯全方及清熱解毒組分、扶正補益組分均能顯著抑制幽門螺旋桿菌感染過程中TNF-α、IL-6、IL-8的分泌，且半夏瀉心湯全方干預(yù)對TNF-α、IL-6、IL-8分泌和表達的抑制效應(yīng)優(yōu)于單獨使用清熱解毒組分及扶正補益組分進行干預(yù)。

綜上所述，半夏瀉心湯全方及各組分均能根除Hp并抑制TLRs/NF-κB信號通路，且全方的療效優(yōu)于各組分；在臨床實踐中應(yīng)用半夏瀉心湯全方治療Hp感染能夠取得積極臨床療效。

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