面向現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的高分辨Blu-ray成像技術(shù)研究

徐鵬濤,任雙寶,張校亮

(1.中國(guó)船舶重工集團(tuán)公司第七二三研究所,江蘇 揚(yáng)州 225101;2.太原理工大學(xué),山西 太原 030024)

0 引 言

傳統(tǒng)的生化檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附法、分光光度法、色譜法和光譜法等，這些成熟的檢測(cè)方法存在檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、檢測(cè)成本昂貴和儀器操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。因此，許多研究致力于開發(fā)面向普通大眾的低成本現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)(POCT)設(shè)備。其中，利用大眾身邊常用的一些電子設(shè)備如手機(jī)、掃描儀和數(shù)碼相機(jī)等，通過對(duì)其簡(jiǎn)單的改裝或者以編寫軟件的方式實(shí)現(xiàn)自定義的控制，進(jìn)而使其作為生物分子傳感器的快速讀出設(shè)備有效地實(shí)現(xiàn)分子診斷或有害物質(zhì)的檢測(cè)，是近年來的研究熱點(diǎn)[1-2]。隨著光盤技術(shù)的不斷發(fā)展，許多學(xué)者以標(biāo)準(zhǔn)光盤/光驅(qū)技術(shù)為基礎(chǔ)，研究了以光盤為反應(yīng)基底、光驅(qū)為檢測(cè)器的生物化學(xué)檢測(cè)方法，將標(biāo)準(zhǔn)的或改裝后的光盤/光驅(qū)作為一種新型的POCT工具，廣泛運(yùn)用到諸多檢測(cè)領(lǐng)域。這種檢測(cè)方法主要分為標(biāo)準(zhǔn)光驅(qū)檢測(cè)法和光驅(qū)改造檢測(cè)法。Lange等[3]將光驅(qū)激光頭置于暗場(chǎng)光學(xué)顯微鏡的頂部,使其改裝成為“光驅(qū)成像儀”，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)限達(dá)到單個(gè)分子水平的納米金顆粒標(biāo)記銀染色后的免疫反應(yīng)的檢測(cè)；Potyrailo等[4]從光驅(qū)電路板上提取光學(xué)頭光電探測(cè)器模擬信號(hào)，然后使用數(shù)據(jù)采集卡采集和LabVIEW編寫程序?qū)怛?qū)控制和成像從而實(shí)現(xiàn)了CD光盤表面的金屬離子的定量檢測(cè)；Harisha等[5]開發(fā)了一套具有溫度閉環(huán)控制、轉(zhuǎn)速控制的HIV疾病診斷設(shè)備并且特殊制作了半透射半反射的微流控生物光盤，再將標(biāo)準(zhǔn)DVD光驅(qū)置于這套設(shè)備中，增加光電探測(cè)器使其成為了激光掃描儀并用于血液細(xì)胞中CD4+離子的鑒別與計(jì)數(shù)，最小成像精度接近1 μm。上述幾種方法由于對(duì)標(biāo)準(zhǔn)光驅(qū)采取了過度改造，導(dǎo)致普通用戶無法使用光驅(qū)的原有功能，破壞了光驅(qū)的原始使用性。加拿大于化忠教授的課題組提出并開發(fā)了一種全新的基于標(biāo)準(zhǔn)光盤/光驅(qū)的數(shù)字化生物分子檢測(cè)技術(shù)[6-8]，該檢測(cè)方法充分利用了光盤技術(shù)的數(shù)據(jù)保護(hù)機(jī)制，使用標(biāo)準(zhǔn)光驅(qū)結(jié)合光盤質(zhì)量診斷軟件的方式實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。

藍(lán)光光盤(BD)是CD、DVD之后發(fā)展起來的一種具有高存儲(chǔ)容量的光盤格式。區(qū)別于CD和DVD的780 nm、650 nm讀取波長(zhǎng)，藍(lán)光光盤的命名是由于它采用了更短的405 nm藍(lán)色激光和更高的數(shù)值孔徑來進(jìn)行光盤的讀取與刻錄。藍(lán)光光盤更小的聚焦光斑對(duì)基于光驅(qū)的檢測(cè)技術(shù)而言，意味著更高的檢測(cè)通量和靈敏度[9]，基于此，本文研究了基于BD技術(shù)的高分辨成像檢測(cè)方法，通過水解反應(yīng)成功地將惰性的BD表面轉(zhuǎn)化為有活性的生物基底，并使用C++、LabVIEW和MATLAB混合編程開發(fā)了一套完整的光驅(qū)成像檢測(cè)系統(tǒng)。并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該系統(tǒng)的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：BD-ROM(25 GB BD-R，日本威寶公司)，藍(lán)光刻錄機(jī)(日本Plextor公司)，臺(tái)式計(jì)算機(jī)(Vostro 230s，美國(guó)戴爾公司)，數(shù)據(jù)采集卡(PCI8514，阿爾泰)。

試劑：磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、氫氧化鈉(NaOH)、氯化鈉(NaCl)、BSA(牛血清白蛋白)購(gòu)買于 Aladdin(中國(guó)，上海)。AFB1-BSA(牛血清白蛋白包被黃曲霉素B1(Aflatoxin B1))、AFB1 抗體、AFB1 的標(biāo)準(zhǔn)試劑、檸檬酸、Tween 20(吐溫-20)、Gelatin(明膠)、NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)、EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)購(gòu)于 Sigma(美國(guó)，圣路易斯)。甲醇(CH3OH)、對(duì)苯二酚、硝酸銀(AgNO3)購(gòu)于科密歐(中國(guó)，天津)。疊氮化鈉(NaN3)購(gòu)于索萊寶科技有限公司(中國(guó)，北京)。生物素標(biāo)記試劑盒-氨基購(gòu)于同仁化學(xué)研究所(日本)。納米金標(biāo)記的鏈霉親和素(直徑為 1.4 nm)購(gòu)于 Nanoprobes 公司(美國(guó)，紐約)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.20 MΩ·cm)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 墨點(diǎn)陣列的制備與讀取

(1) 選擇表面干凈、無劃痕的空白BD-R光盤(威寶公司，Verbatim)并使用紫外臭氧清洗機(jī)(NANOSCAN)對(duì)BD-R光盤表面進(jìn)行5～10 min活化處理。

(2) 根據(jù)需要使用光盤設(shè)計(jì)軟件EPSON Print CD進(jìn)行圖案設(shè)計(jì)(在本實(shí)驗(yàn)中，共設(shè)計(jì)了3種不同的打印圖案，分別是不同直徑點(diǎn)陣列、不同顏色的打印條帶陣列和不同灰度的打印條帶陣列)，并將打印參數(shù)中的“打印顏色校正”設(shè)置為“較亮(+3)”，以使出墨量最小，之后將打印機(jī)前置可拆卸托盤按鈕按下，然后將光盤數(shù)據(jù)面朝上放入打印托盤，開始打印。

(3) 光盤打印完成后，將光盤取出置于干燥箱內(nèi)，在室溫下干燥20 min左右后，取出靜置一天以將表面墨汁干涸，防止在讀取過程中，光盤轉(zhuǎn)速太快而出現(xiàn)甩墨的情況。

1.2.2 AFB1免疫優(yōu)化反應(yīng)陣列的制備與讀取

(1) 選擇表面干凈的空白BD-R光盤，將光盤浸泡在濃度為0.1 M的NaOH溶液中1.5 h，溫度控制在55 ℃±1 ℃范圍內(nèi)，隨后將光盤取出，用超純水清洗干凈光盤表面，用氮?dú)鈱⒐獗P吹干。

(2) 將濃度為100 mM的EDC和45 mM的NHS(緩沖液是pH為6的PBS溶液,0.1 M的PBS緩沖溶液由87.7 mL的0.2 M NaH2PO4溶液和12.3 mL的Na2HPO4溶液混合并加超純水稀釋至200 mL配制)的活化液滴加于光盤表面的標(biāo)記區(qū)域，活化4 h。

(3) 首先將 PDMS 微通道緊貼在光盤表面標(biāo)記區(qū)域，然后在各通道的加樣孔注入濃度為100 μg/ml的AFB1-BSA 溶液并在對(duì)應(yīng)的出樣孔使用真空泵抽吸使溶液充滿通道，之后靜置一夜(室溫下)，使 AFB1-BSA 充分固定在光盤表面，使用pH 7.4的緩沖液沖洗通道，注入緩沖液1(pH 7.4: 150 mM NaCl,0.8% BSA,0.1% gelatin,0.05% Tween 20,and 0.05% NaN3)，封閉 3 h，然后注入buffer 2 (pH 7.4: 150 mM NaCl,0.8% BSA,0.1% gelatin,0.05% Tween 20,0.05% NaN3)，封閉1 h，之后再用 10 mM PBS 緩沖液沖洗微通道。

(4) 將2 μL生物素標(biāo)記的AFB1 抗體(濃度1～25 μg/ml)注入通道內(nèi)反應(yīng)1 h。

(5) 注入濃度為 1.6 μg/mL 的 Nanogold-Streptavidin 溶液(20 mM pH為7.4的PBS緩沖液，150 mM NaCl,0.1% BSA,and 0.05% NaN3)，室溫下反應(yīng) 1 h。

(6) 揭下 PDMS 微通道后，先使用超純水將BD光盤表面沖洗干凈，再用氮?dú)獯蹈伞?/p>

(7) 將新配制的濃度為48 mM的silver nitrate和 濃度為182 mM的hydroquinone按照 1∶1 比例均勻混合后鋪設(shè)到標(biāo)記的反應(yīng)區(qū)域，銀染6 min左右，整個(gè)銀染過程需保證在避光環(huán)境中操作。

(8) 用超純水沖洗光盤表面，并用氮?dú)獯蹈?，最后將光盤放入光驅(qū)中，使用本文開發(fā)的光驅(qū)成像檢測(cè)系統(tǒng)完成生物光盤的讀取采集和成像分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 光驅(qū)成像檢測(cè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

基于標(biāo)準(zhǔn)藍(lán)光光盤/光驅(qū)的成像檢測(cè)系統(tǒng)由標(biāo)準(zhǔn)藍(lán)光光驅(qū)、數(shù)據(jù)采集卡、個(gè)人計(jì)算機(jī)和應(yīng)用軟件四部分構(gòu)成。采集信號(hào)由光驅(qū)中電路板接出，經(jīng)BNC接口由數(shù)據(jù)采集卡采集。由于數(shù)據(jù)采集卡與主機(jī)之間PCI接口的需要，本系統(tǒng)使用了Dell 的Vostro 230s臺(tái)式計(jì)算機(jī)作為采集數(shù)據(jù)的接收、存儲(chǔ)與處理分析的平臺(tái)。應(yīng)用軟件開發(fā)在Windows環(huán)境下完成，使用LabVIEW開發(fā)了系統(tǒng)UI和部分功能，C++編寫了光驅(qū)控制的動(dòng)態(tài)鏈接庫，MATLAB完成了數(shù)據(jù)圖像處理的一些功能。通過動(dòng)態(tài)鏈接庫和ActiveX技術(shù)將所有功能整合至同一LabVIEW工程，開發(fā)了一套完整的應(yīng)用軟件。軟件整體工作流程圖和操作界面如圖1所示。

圖1 光驅(qū)成像系統(tǒng)工作流程圖和操作界面

2.2 光驅(qū)成像檢測(cè)的原理和系統(tǒng)可行性分析

本文所提出的基于標(biāo)準(zhǔn)藍(lán)光光盤/光驅(qū)成像檢測(cè)技術(shù)是根據(jù)BD光驅(qū)讀取光盤時(shí)激光頭的光學(xué)精確掃描原理，即BD光盤表面發(fā)生生物識(shí)別反應(yīng)的位點(diǎn)(經(jīng)金/銀納米粒子信號(hào)擴(kuò)增后)會(huì)干擾讀取激光束對(duì)刻錄在光盤上的信息的正常讀取，光驅(qū)激光頭中光電二極管接收到的光束強(qiáng)度就會(huì)隨之降低，相應(yīng)的幅值變化可以用于量化分析。同時(shí)，在讀取過程中激光頭呈螺旋線精確掃描光盤表面，相鄰螺旋線軌道間距可達(dá)0.32 μm。而利用該原理實(shí)現(xiàn)分子定量檢測(cè)的關(guān)鍵問題是建立掃描光盤的光學(xué)信號(hào)數(shù)據(jù)提取、處理與成像分析，得到待檢物濃度變化的關(guān)系。為此，在BD光盤表面打印了6條灰度不同的線段組成的陣列，如圖2所示。之后使用基于標(biāo)準(zhǔn)藍(lán)光光盤/光驅(qū)成像檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)光盤進(jìn)行測(cè)試。檢測(cè)結(jié)果表明，在光盤讀取至相應(yīng)位置時(shí)，BD表面的陣列產(chǎn)生了6個(gè)幅度變化依次升高的峰，而這6個(gè)峰的峰值與打印線段一一對(duì)應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了該方案的可行性。

圖2 BD表面打印線段陣列模擬檢測(cè)

2.3 基于標(biāo)準(zhǔn)藍(lán)光光盤/光驅(qū)成像檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)靈敏度與分辨率

實(shí)驗(yàn)中使用的BD光盤表面顏色呈深色，打印的陣列圖案在燈光反射下方能看得清。因此，拍照對(duì)其上打印的檢測(cè)陣列的灰度分析變得不太容易實(shí)現(xiàn)。而由光驅(qū)成像檢測(cè)系統(tǒng)原理可知，這種精密聚焦掃描的成像方式可以解決這一問題。

為了驗(yàn)證基于標(biāo)準(zhǔn)藍(lán)光光盤/光驅(qū)成像檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)靈敏度與分辨率，在BD表面打印12個(gè)不同尺寸的墨點(diǎn)陣列進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。如圖3(a)所示，每個(gè)墨點(diǎn)陣列均為打印的2個(gè)直徑從100 μm 到600 μm的6×12個(gè)點(diǎn)的陣列，圖3(b)為打印BD光盤的光學(xué)圖片及使用基于標(biāo)準(zhǔn)藍(lán)光光盤/光驅(qū)成像檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行成像檢測(cè)的結(jié)果。從圖中可以看出，打印的點(diǎn)全部可以檢測(cè)到，因此使用基于標(biāo)準(zhǔn)藍(lán)光光盤/光驅(qū)成像檢測(cè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)很高的靈敏度和檢測(cè)通量。

圖3 高檢測(cè)通量測(cè)試

2.4 BD表面AFB1優(yōu)化反應(yīng)的定量檢測(cè)

BD表面AFB1優(yōu)化反應(yīng)的定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)后的BD光盤如圖4所示。

圖4 AFB1免疫優(yōu)化反應(yīng)陣列BD光盤

圖4 (a)中，標(biāo)準(zhǔn)樣品陣列共6個(gè)條帶，濃度分別為：1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、14 μg/mL、18 μg/mL。使用本文開發(fā)的光驅(qū)成像檢測(cè)系統(tǒng)成像結(jié)果如圖4(b)所示，光盤上的標(biāo)準(zhǔn)線和樣品陣列可以完整地檢測(cè)出來，且在偽色圖Color bar為hot的圖像中，可以直觀地看到標(biāo)準(zhǔn)線中6個(gè)條帶的亮度值有逐漸升高的趨勢(shì)。對(duì)生成的圖像分別使用“檢測(cè)分析”和“附加模塊”進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。

圖5(a)為使用“附加模塊”對(duì)所成圖像的8位灰度圖進(jìn)行線像素值測(cè)試，直觀地從數(shù)值上分析，6個(gè)反應(yīng)條帶的像素峰值分別約為92、110、127、162、195、223。為了進(jìn)一步更精確地檢測(cè)，使用“圖像分析”對(duì)所成圖像的16位tif格式圖進(jìn)行全圖像分析，結(jié)果如圖5(b)所示。相較于圖5(a)中線像素值測(cè)試，圖5(b)則對(duì)反應(yīng)條帶內(nèi)的所有像素值取均值，避免了可能存在的條帶灰度不均勻，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。圖5(c)為(b)中標(biāo)準(zhǔn)線區(qū)域的放大圖，可以看到6個(gè)反應(yīng)條帶的像素均值分別為21 937.18、25 487.98、30 530.92、34 678.58、39 015.89、44 166.13。

為了通過標(biāo)準(zhǔn)線得出檢測(cè)待測(cè)樣品的濃度，首先由圖5(b)得出3個(gè)待測(cè)樣品條帶的像素均值分別為39 563.79、31 793.08、28 304.67，然后將標(biāo)準(zhǔn)線中每個(gè)條帶對(duì)應(yīng)的生物素標(biāo)記的AFB1 抗體濃度和像素均值分別輸入標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度和標(biāo)準(zhǔn)像素值中，將待測(cè)樣品條帶的像素均值輸入標(biāo)準(zhǔn)像素值中，通過曲線擬合計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)品曲線方程，繼而求出3個(gè)待測(cè)樣品的濃度分別為：13.081 μg/mL、5.836 μg/mL、3.496 μg/mL，如圖6所示。

圖5 AFB1免疫優(yōu)化反應(yīng)陣列BD光盤所成圖像的檢測(cè)分析

圖6 AFB1免疫優(yōu)化反應(yīng)陣列BD光盤檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)束語

本文提出了基于藍(lán)光技術(shù)的數(shù)字化分子檢測(cè)方案，使用C++、LabVIEW和MATLAB混合編程技術(shù)，對(duì)基于標(biāo)準(zhǔn)藍(lán)光光盤/光驅(qū)的成像檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行了研究、設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)，使標(biāo)準(zhǔn)藍(lán)光光驅(qū)經(jīng)過簡(jiǎn)單的光學(xué)信號(hào)提取就可以成為專業(yè)化的POCT診斷設(shè)備。通過對(duì)光盤表面微尺度墨點(diǎn)陣列的分析，表明了藍(lán)光檢測(cè)系統(tǒng)的橫向分辨率小于藍(lán)光光盤表面的光斑直徑(138 μm)，可以檢測(cè)出直徑小于100 μm的墨點(diǎn)；通過對(duì)AFB1優(yōu)化反應(yīng)的分析，得出其可以作為生物反應(yīng)灰度學(xué)分析測(cè)試的平臺(tái)，應(yīng)用于醫(yī)療診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及食品安全等領(lǐng)域。

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