腹瀉幼犬糞便中沙門氏菌的分離與鑒定

凌清標(biāo) 福建省莆田市秀嶼區(qū)笏石畜牧獸醫(yī)站 福建莆田 351146

沙門氏菌（Salmonella）屬于革蘭氏陰性桿菌，是一種重要的人獸共患致病菌，其主要在人和動物的腸道內(nèi)寄生。自1885年首次從患畜體內(nèi)分離到豬霍亂沙門氏菌至今，全世界范圍內(nèi)沙門氏菌血清型已經(jīng)達(dá)到2 500多種，部分血清型可以引起嚴(yán)重的沙門氏菌病，甚至造成死亡[1]。全世界人沙門氏菌感染有逐漸上升的趨勢，由沙門氏菌引起的細(xì)菌性疾病也在增加，對畜牧業(yè)發(fā)展、人類健康造成嚴(yán)重危害，因此，控制沙門氏菌的傳播對于食品安全和獸醫(yī)公共衛(wèi)生有著重要的意義。隨著人民生活水平的提高，寵物飼養(yǎng)越來越多，其作為人獸共患病的傳染源給寵物飼養(yǎng)者和社會公共健康造成嚴(yán)重的威脅。該研究從一例診斷為細(xì)菌性腹瀉幼犬病例的糞便中進(jìn)行細(xì)菌分離，得到一株疑似沙門氏菌，并且進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和藥敏試驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集 用棉拭子無菌采集腹瀉幼犬的直腸拭子。

1.2 主要試劑 TSA、HE瓊脂、BS瓊脂、革蘭氏染色液均購自青島海博生物科技有限公司；2×PCR Mixture、DL2000 DNA Marker購自TAKARA公司。

1.3 細(xì)菌分離 采集的拭子直接涂抹TSA平板、HE瓊脂平板、BS瓊脂平板，置37℃培養(yǎng)16~24 h，無菌挑取10~12個單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并對染色形態(tài)一致的菌落在新鮮的TSA平板劃線純培養(yǎng)。

1.4 沙門氏菌PCR鑒定 細(xì)菌DNA的提取[2]：采用熱裂解法提取DNA，挑純培養(yǎng)物單菌落在EP管重懸于100 μL蒸餾水中，煮沸10 min，12 000 r/min離心5 min，收集上清為DNA模板，置-20℃冰箱保存、備用。

PCR擴(kuò)增：參照2013年查華等報道的沙門氏菌腸毒素基因stn引物序列[3]，由福州尚亞生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 沙門氏菌基因引物序列

PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件：反應(yīng)體系見表2。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，56℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

表2 PCR反應(yīng)體系

1.5 藥敏試驗(yàn) 藥敏紙片購自杭州天和微生物有限公司，包括頭孢噻肟、氨芐西林、氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、多西環(huán)素，試驗(yàn)方案按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌菌落形態(tài) 經(jīng)過37℃培養(yǎng)，在TSA平板上長出形態(tài)均一的菌落，在HE平板上長出藍(lán)綠色、中心呈現(xiàn)黑色的菌落[1]，而在BS平板上呈現(xiàn)棕褐色、有金屬光澤、周圍培養(yǎng)基呈棕色的菌落[1]（見圖1），挑取單菌落經(jīng)革蘭氏染色、鏡檢，均為革蘭氏陰性腸桿菌，疑似為沙門氏菌。

圖1 分離菌在HE培養(yǎng)基（左）和BS培養(yǎng)基（右）上生長狀態(tài)

2.2 疑似菌PCR鑒定 采用沙門氏菌腸毒素基因stn的特異性引物，對挑取的疑似菌落進(jìn)行PCR檢測，挑取的單菌落均為陽性（見圖2）。因此，該次從腹瀉幼犬糞便中分離到的病原可確定為沙門氏菌。

圖2 可疑菌的PCR鑒定

2.3 沙門氏菌藥敏試驗(yàn) 按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，分離到的沙門氏菌對頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、氟苯尼考敏感，對氨芐西林中等耐藥，對氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素、多西環(huán)素耐藥。

3 討 論

本研究從腹瀉幼犬糞便中進(jìn)行病原分離，經(jīng)鑒定為沙門氏菌，并對該株沙門氏菌進(jìn)行了初步的藥敏試驗(yàn)分析，僅對頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、氟苯尼考敏感，與當(dāng)時使用頭孢噻肟治療的效果一致。而分離菌株對多數(shù)抗生素具有耐藥性，提示寵物飼養(yǎng)人員需要提高警惕，防止沙門氏菌對家庭成員生活環(huán)境和周圍環(huán)境造成污染引發(fā)公共衛(wèi)生健康問題。因此，要加強(qiáng)寵物管理，提高寵物飼養(yǎng)人員的衛(wèi)生健康意識，防止人獸共患病從寵物向人傳播而造成人的感染和發(fā)病。

[1]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].4版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2007.

[2]王軍.亞抑菌濃度抗生素對豬源耐藥沙門氏菌生物膜形成的影響[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[3]查華,石火英,吉貞穎,等.2010-2012年蘇皖兩省雞白痢沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國家禽,2013,35(4)：17-20.