福建黃兔微生物和寄生蟲感染狀況調查與分析

俞春英 林 瑋 謝金東 王訓立福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心 福州 350122

福建黃兔是福建省獨有的家兔品種，是長期的地理隔離演變來的。據報道，福建黃兔耐粗飼、繁殖率和成活率高，這對于在養(yǎng)殖業(yè)中難度較大的兔類飼養(yǎng)來講是極其有利的優(yōu)勢[1-3]。福建省連江玉華山兔場是我省福建黃兔的種源基地，該兔場繁殖生產的家兔屬于非等級實驗兔，飼養(yǎng)于普通的開放環(huán)境，主要供肉用和當地高等院校的教學實驗用動物。我校長期教學用家兔主要來源于該兔場，鑒于該家兔為非等級實驗兔，由于在教學用家兔的使用環(huán)節(jié)中存在多種可能發(fā)生的生物安全隱患，如學生偶爾被抓傷、咬傷，進行采血、灌胃、解剖實驗等，倘若發(fā)生具有危害性的病原體感染事故，將會嚴重影響到實驗人員及學生的身體健康，甚至帶來局部的傳播。因此，動物的微生物學和寄生蟲學質量控制與我們的實驗環(huán)境安全和身體健康息息相關。為防范于未然，定期抽查我校所使用的教學實驗用家兔的微生物和寄生蟲攜帶情況，以最大程度控制和避免教學生物安全事故的發(fā)生[4-6]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 福建省連江縣玉華山種兔場飼養(yǎng)的4月齡福建黃兔，四批次動物按春、夏、秋、冬四個季度采樣，每季度隨機挑選25只，于我校實驗動物中心[SYXK(閩2014-0006)]適應性飼養(yǎng)一周，觀察無異常癥狀表現后進行相關項目的檢測。

1.2 試劑及設備

1.2.1 細菌檢測試劑 SF培養(yǎng)基、NAC養(yǎng)基、高鹽甘露醇培養(yǎng)基、DHL培養(yǎng)基、血瓊脂平板、生化鑒定管購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；兔泰澤病原體抗體檢測試劑盒購自蘇州西山生物技術有限公司；戊巴比妥鈉由索萊寶生物科技有限公司分裝，批號為1014P034和701O034。

1.2.2 病毒檢測試劑 兔出血癥病毒檢測ELISA試劑盒購自Express BIO。

1.2.3 寄生蟲檢測試劑 弓形蟲間接血凝試驗 （I-HA）試劑購自中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.2.4 其他試劑 其他試劑均采用國產分析純或進口分析純試劑。

1.2.5 主要儀器設備 生化培養(yǎng)箱（MIR-254，日本三洋）；生物光學顯微鏡（E100，尼康）；全自動酶標儀（ELX808，美國寶特）；洗板機（ELX50，美國寶特）；高壓滅菌鍋（MLS-3750，日本三洋）；超凈工作臺 （SW-CJ-2FD，蘇州安泰）；電熱恒溫干燥箱（DHG-9053A，上海一恒）。

1.3 檢測程序 動物→編號→外觀檢查 （正常）→皮膚取樣（體外寄生蟲檢查）→采血（分離血清，檢查病毒抗體和其他病原的抗體）→麻醉→無菌解剖→增菌分離培養(yǎng)→生化鑒定、血清學鑒定→結果判定。

1.4 寄生蟲檢測

1.4.1 體外寄生蟲檢測 依據國家標準GB/T 18448.1-2001[7]，采用拔毛法，逐只在兔的體表如耳、背、腹股溝等體外寄生蟲易感部位拔取少量被毛，分別散放在載玻片上，用透明膠粘住，編號，記錄取樣部位，保存于4℃冰箱。為避免蟲體降解需2 d內檢測完畢，所有玻片于顯微鏡下觀察，每一玻片重復觀察一次，并記錄結果。

1.4.2 體內寄生蟲檢測 依據國家標準GB/T 18448.2-2008[8]，清醒狀態(tài)采兔耳靜脈血，分離血清，按弓形蟲抗體、出血癥病毒抗體、泰澤病原體抗體檢測所需的血清量分裝，編號，-80℃凍存。使用購買的弓形蟲間接血凝試驗（IHA試驗）的凍干抗原，定性檢測兔血清中的弓形蟲抗體。檢測步驟：用微量加樣器在96孔有機玻璃反應板的每孔中加稀釋液，每個樣品需加4孔稀釋液，同時設陽性血清、陰性血清、空白對照；加待檢血清、陽性對照血清、陰性對照血清；樣品稀釋至第3孔，對照血清均稀釋至第7孔；將診斷液搖勻后加入每個孔，然后將反應板置微型振蕩器上振蕩1～2 min，取下反應板，蓋上與板大小相近的玻璃罩，置37℃作用2～3 h后觀察結果。結果判定：在陽性對照血清效價不低于1∶1 024，陰性對照血清除第1孔允許有前滯現象“+”，其余各孔均為“-”，稀釋液對照為“-”的前提下，對待檢血清進行判定，待檢血清效價達到或超過1∶64判為陽性，否則為陰性。

另收集兔糞球，每只數粒，裝入自封袋，編號，4℃冰箱冷藏，采用漂浮法和沉淀法檢測糞便中的線蟲，一周內檢測完畢。

1.5 病毒檢測 依據國家標準 GB/T14926.21-2001[9]，采用ELISA試劑盒檢測兔出血癥病毒。操作步驟：1∶50稀釋血清樣本，同時每個檢測項目均設陽性病毒抗原孔及陰性對照抗原孔；一抗孵育，在已包被抗原的ELISA微孔條上標上序號，再向ELISA微孔板中陽性病毒抗原孔及陰性對照抗原孔各加稀釋好的樣本及陰性、陽性對照，貼上封板膜，置37℃孵育45 min；洗板5次，吸水紙上拍干；每孔加入酶標二抗，貼上封板膜，置37℃孵育45 min；洗板步驟同上；顯色，加入 ABTS酶底物，室溫反應30 min；讀板，加入終止液反應2 min，并在15 min內用酶標儀讀數，測試波長為405 nm。結果判定：陰性對照血清的抗原孔讀數減去對照抗原孔讀數必須＜0.250、陽性對照血清抗原孔減去對照抗原孔讀數必須≧0.600時，本次試驗結果有效。樣本孔讀數OD值減去對照抗原孔OD值≧0.300時判為陽性，否則為陰性。

1.6 細菌檢測 按照國家標準GB/T 14926.1-2001[10]、GB/T 14926.5-2001[11]、GB/T 14926.14-2001[12]、GB/T 14926.17-2001[13]、GB/T 14926.10-2008[14]的方法，3%戊巴比妥鈉耳靜脈麻醉兔，在超凈臺上無菌解剖兔，挑取少量回盲部內容物分別接種SF增菌液、高鹽甘露醇培養(yǎng)基、NAC培養(yǎng)基，同時挑取少量氣管分泌物劃線接種血瓊脂平板，然后增菌分離培養(yǎng)，結合生化鑒定和血清學鑒定，分別檢測該種兔場兔的沙門氏菌、多殺巴斯德桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌感染情況。使用ELISA試劑盒檢測兔血清中泰澤病原體的抗體，步驟與兔出血癥病毒抗體檢測類似。

2 結 果

2.1 福建黃兔體內外寄生蟲檢測 四批次家兔體內寄生蟲檢測結果均為陰性，說明該家兔群體沒有弓形蟲病原的感染，兔糞球中也未查到線蟲，但四批次均有不同程度的體外寄生蟲（螨蟲）感染，結果見表1。

表1 福建黃兔體外寄生蟲（節(jié)肢動物）、弓形蟲、線蟲檢測結果

2.2 福建黃兔出血癥病毒檢測 該兔場有實施兔出血癥病毒的免疫程序，四批次福建黃兔的出血癥病毒抗體檢測均為陽性，表明經過免疫的福建黃兔能很好地得到抗體的保護，避免感染出血癥病毒。結果見表2。

表2 福建黃兔出血癥病毒抗體的檢測結果

2.3 福建黃兔細菌學檢測 四批次共100只黃兔的細菌檢測結果均為陰性，表明該群體無沙門氏菌、多殺巴斯德桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、泰澤病原體的流行，符合國家標準規(guī)定的普通級家兔的細菌檢測標準，不存在普通級家兔所要排除的人畜共患病和動物烈性傳染病病原體。但據悉該兔場有實施一定的細菌免疫程序，因此，還無法達到國家標準中規(guī)定的不能免疫又必須陰性的要求，僅能作為實驗用動物，結果見表3。

3 討 論

近幾年在高等院校發(fā)生了多起因實驗動物所引發(fā)的教學生物安全事故，因此，在高校及科研院所的科研和教學動物實驗中提高生物安全意識，警惕生物安全事故的發(fā)生顯得極其重要。由于我省沒有正規(guī)的實驗兔供應機構，所有標準等級的科研用兔均購自北京、上海等地，導致提高動物成本和延長供應時限。我校每年教學兔用量達1 000只左右，教學兔用量大，而教學實驗對動物質量要求不高，受制于教學實驗經費和使用的便利性，因此，該兔場繁殖生產的非等級福建黃兔就成為我校教學用家兔的主要供應來源。目前，福建黃兔為非等級家兔，飼養(yǎng)于普通開放環(huán)境中，為了預防動物疫病及防范教學動物實驗的生物安全事故，有必要了解該兔的微生物和寄生蟲流行情況，為此開展了該項調查研究。

由于微生物和寄生蟲的流行情況往往有季節(jié)性特點，為了全面了解不同季節(jié)該兔的微生物和寄生蟲感染情況，本試驗按季度對兔場的生產繁殖群進行抽檢采樣，參照實驗動物國家標準中普通級家兔的檢測要求選擇檢測項目[15]，另增加多殺巴斯德桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、泰澤病原體項目。

結果表明，抽查的四批次福建黃兔未發(fā)現感染沙門氏菌、多殺巴斯德桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和泰澤病原體，每只兔都檢測到出血癥病毒保護抗體，100只福建黃兔均無弓形蟲感染，但體外寄生蟲螨蟲的平均檢出率達36%。由此可知，福建黃兔不存在人畜共患病和烈性傳染病的病原體感染，兔的健康狀況良好。但該兔場的兔體外寄生蟲如螨蟲的感染率較高，可能是因為飼養(yǎng)于普通環(huán)境，且該兔場生產的家兔大部分供作肉用，在飼養(yǎng)上未達到國家標準中普通級家兔的飼養(yǎng)環(huán)境標準和飼養(yǎng)管理要求。此外，也不能排除兔在運輸過程和飼養(yǎng)于我校動物中心這一階段所帶來的微生物和寄生蟲感染的可能，因此，今后若進行階段性的抽查，需到現場采樣以排除這一可能。螨蟲的存在雖不會對環(huán)境和人體造成致命性危害，但影響動物的質量和人的身體健康。而要消除螨蟲感染，需從凈化種群、凈化飼養(yǎng)環(huán)境和加強飼養(yǎng)管理入手，但對于這類非等級的實驗動物生產供應商的地方性養(yǎng)殖場而言是難以實現的。因此，要改變教學實驗用家兔的現狀，首先，需從學校層面出發(fā)，提高教學實驗經費，購買標準的實驗動物用于教學；其次，提高學校師生的生物安全意識，培養(yǎng)學生的規(guī)范操作技能和習慣；最后，學校需要制定相應的應急預案，從而最大程度避免教學生物安全事故的發(fā)生，以保障實驗環(huán)境不被致病性生物污染、師生健康不受傷害[16]。

表3 福建黃兔細菌學檢測結果

[1]張愛華.淺談福建黃毛兔[J].畜牧獸醫(yī)雜志,2004,23(6)：41.

[2]謝喜平,陳巖鋒,孫世坤,等.福建黃兔報種及創(chuàng)新利用的研究與實踐[J].中國養(yǎng)兔雜志,2006(6)：3-5.

[3]林和官,謝喜平.福建黃兔品種特性之一-繁殖和生長發(fā)育[J].中國養(yǎng)兔雜志,1998(6)：3-5.

[4]羅小泉,陳麗玲,徐彭,等.對教學動物實驗安全事故的反思及對策研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2014(4)：164-165.

[5]錢軍,孫玉成.實驗動物與生物安全[J].中國比較醫(yī)學雜志,2011,21(10/11)：15-19.

[6]張永斌，郭學軍.高校實驗動物與生物安全[J].畜牧與飼料科學,2016,37(2)：91-93.

[7]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 18448.1-2001實驗動物 體外寄生蟲檢測方法[S].2001.

[8]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 18448.2-2008實驗動物 弓形蟲檢測方法[S].2008.

[9]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T14926.21-2001實驗動物 兔出血癥病毒檢測方法[S].2001.

[10]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T14926.1-2001實驗動物 沙門菌檢測方法[S].2001.

[11]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T14926.5-2001實驗動物 多殺巴斯德桿菌檢測方法[S].2001.

[12]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T14926.14-2001實驗動物 金黃色葡萄球菌檢測方法[S].2001.

[13]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T14926.17-2001實驗動物 綠膿桿菌檢測方法[S].2001.

[14]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T14926.10-2008實驗動物 泰澤病原體檢測方法[S].2008.

[15]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T14922.2-2001實驗動物 微生物等級及監(jiān)測[S].2001.

[16]張慧儉,張娜.中醫(yī)院校實驗動物生物安全教育現狀及對策[J].中國科技創(chuàng)新導刊,2013(32)：82.