軟棗獼猴桃外植體消毒及繼代增殖研究

李 強

（國營寬甸滿族自治縣黎明林場，遼寧 寬甸 118200）

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）是遼寧山地地區(qū)著名的經(jīng)濟野果，其所含營養(yǎng)成分具有良好的保健作用，研究表明，軟棗獼猴桃中的營養(yǎng)成分具有提高機體的免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老等功效，果實所含營養(yǎng)成分是中華獼猴桃的幾倍。因此，極具開發(fā)潛力，并且具有巨大的應(yīng)用前景和推廣價值。近年來，軟棗獼猴桃主要采用嫩（硬）枝扦插和組織培養(yǎng)進行苗木繁育。由于組織培養(yǎng)技術(shù)不受自然環(huán)境和季節(jié)條件的影響，可以在一定時期內(nèi)大量繁殖，因此能夠很好的解決人們對軟棗獼猴桃苗木的市場需求。在整個組培過程中，如何減少外植體的初培污染率和提高組培苗增殖系數(shù)是提高組培效率的兩個關(guān)鍵因素，本研究就軟棗獼猴桃外植體的滅菌消毒及繼代增殖進行了研究，為今后軟棗獼猴桃的工廠化組培育苗提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

6月中旬，剪取寬甸地區(qū)軟棗獼猴桃基地2～3年生幼嫩枝條，帶回實驗室水培催芽20天，剪取新萌發(fā)和幼嫩的長勢良好的腋芽及莖段為外植體，進行下一步的初代培養(yǎng)。

1.2 外植體的消毒滅菌

先剪取1.2～1.5厘米長的腋芽，再將莖段剪至3.0～5.0厘米，用流水沖洗1～1.5小時，再用無菌水沖洗3次。在無菌室的超凈工作臺上，先用75%乙醇浸泡30秒，無菌水沖洗3遍后，用0.1%的氯化汞將腋芽分別浸泡2、3、4、5分鐘；莖段浸泡4、5、6、7分鐘，之后用無菌水沖洗5次左右，無菌濾紙吸干水分后，將腋芽3剪至1.0～1.2厘米，莖段剪成1.5～2.0厘米的單芽莖段，接種于培養(yǎng)基上，每瓶種接種1個外植體，每個處理接種20瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)10天后觀察兩種外植體的污染情況并統(tǒng)計污染率，30天觀察兩種外植體的成活情況并統(tǒng)計成活率。

1.3 培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)條件

初代培養(yǎng)基為MS+2.0毫克/升6-BA+0.1毫克/升NAA；本研究通過叢生芽增殖途徑和莖段扦插增殖途徑進行繼代增殖培養(yǎng)。將初代培養(yǎng)后無菌苗1.5厘米左右的頂芽接種到以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA（1.0、2.0、3.0毫克/升）和NAA（0.1、0.2、0.3毫克/升）組合的繼代培養(yǎng)基中；將初代培養(yǎng)獲得的無菌苗剪取1.5厘米長的莖段接種到以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA（0.5、1.0、2.0毫克/升）和NAA（0.1、0.2、0.3毫克/升）組合的繼代培養(yǎng)基中。以上每種處理均接種30瓶，每瓶接種1株，重復(fù)3次，所有培養(yǎng)條件均為：日光燈照明，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，空氣相對濕度50%～60%，光照時間13小時/天，光強為2000～3000Lx。培養(yǎng)30天后統(tǒng)計增殖系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌時間對外植體接種效果的影響

在組培過程中，外植體的消毒是控制組培苗污染率的首要步驟，選擇適宜的消毒劑，篩選最佳的消毒時間，才能獲得生長良好的初代組培苗。本研究采用0.1%氯化汞溶液對軟棗獼猴桃的腋芽和莖段兩種外植體分別進行滅菌消毒處理，結(jié)果表明：隨著滅菌時間的延長，幾種處理的外植體的污染率均呈下降趨勢。從表1可以看出，以腋芽為外植體的植株在滅菌時間為4分鐘時成活率達(dá)到最高（84%），當(dāng)滅菌時間為5分鐘時，雖然污染率差異不明顯，但成活率顯著下降。因此，腋芽的滅菌時間在4分鐘時為最佳，既可以很好的控制污染率，又具有很高的成活率。

從表2可以看出，隨著滅菌時間的延長，以莖段為外植體的初代培養(yǎng)污染率隨滅菌時間的延長成上升趨勢，而成活率呈先上升，后下降趨勢，在滅菌時間為5分鐘時成活率達(dá)到最高（92.4%），污染率達(dá)到比較好的效果（6.1）。因此，以軟棗獼猴桃莖段外植體在濃度為0.1%的氯化汞中滅菌5分鐘為最宜。

2.2 不同激素濃度對軟棗獼猴桃叢生芽增殖的影響

表1 滅菌時間對腋芽外植體培養(yǎng)的影響

表2 滅菌時間對莖段外植體培養(yǎng)的影響

芽的增殖和生長受細(xì)胞分裂素和生長素濃度比例的影響，細(xì)胞分裂素能刺激芽的分化，生長素控制芽的增長。由表3可以看出，不同濃度配比的6-BA和 NAA對芽增殖效果也不相同。6-BA濃度一定時，隨著NAA濃度的增高，平均株高也隨之增高；6-BA對芽的增殖系數(shù)影響較大，當(dāng)6-BA為3.0毫克/升時，增殖系數(shù)達(dá)到最大（4.89），但在此濃度下，苗基部會偶有遇上組織產(chǎn)生，且玻璃化苗開始增多，故綜合考慮，選擇MS+2.0毫克/升6-BA+0.2毫克/升NAA為最佳叢生芽增殖培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中的苗生長健壯，葉平展?jié)饩G。

表3 不同濃度的6-BA和NAA對叢生芽增殖的影響

2.3 不同激素濃度對軟棗獼猴桃莖段繼代增殖的影響

由表4可以看出，6-BA和NAA對莖段繼代增殖的影響與芽增殖表現(xiàn)比較一致，即6-BA濃度增加有利于芽的增殖，NAA濃度與芽增殖無線性關(guān)系，但可促進莖段的生長。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為2.0毫克/升，NAA質(zhì)量濃度為0.3毫克/升時，增殖系數(shù)達(dá)到最大為5.13，并且植株長勢健壯，葉色濃綠，莖粗。因此，在莖段增殖培養(yǎng)中最佳的培養(yǎng)基為MS+2.0毫克/升6-BA+0.3毫克/升NAA。

3 結(jié)論與討論

本研究使用軟棗獼猴桃的腋芽和莖段為外植體材料，篩選了兩種外植體的最佳消毒滅菌時間和適宜的繼代增殖培養(yǎng)基，結(jié)果表明，腋芽最佳滅菌時間為4分鐘，成活率達(dá)84%；莖段為5分鐘成活率達(dá)到最高為92.4%，污染率均相對較低。通過觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)滅菌時間過長時，成活率降低，這是由于消毒劑的處理時間過長，雖可降低污染率，但同時也會對植株造成一定的傷害，植株受損害后會變褐死亡。不同的外植體的消毒滅菌時間也有所不同，因此在接種前要進行必要的篩選。

表4 不同激素濃度配比對莖段繼代增殖的影響

通過篩選，軟棗獼猴桃的叢生芽最佳增殖培養(yǎng)基為MS+2.0毫克/升6-BA+0.2毫克/升NAA，叢生芽的增殖系數(shù)為4.86，植株長勢健壯，葉色濃綠，這與已有相關(guān)研究結(jié)果較為一致。6-BA和NAA的濃度較低時，無法滿足植株對生長激素的需求。因此，會影響芽的增殖系數(shù)和長勢，當(dāng)6-BA和NAA的濃度過高時，莖段基部會出現(xiàn)愈傷組織，并有一定玻璃化苗產(chǎn)生，嚴(yán)重影響叢生芽的生長。因此，植物激素的使用濃度不宜過高。在莖段增殖途徑中，雖然在2.0毫克/升6-BA+0.2毫克/升NAA的質(zhì)量配比組合中在株高最高，但增殖系數(shù)較低，故綜合考慮以M S+2.0毫克/升6-BA+0.3毫克/升 NAA為最佳增殖培養(yǎng)基。