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    5406放線菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗

    2018-06-14 12:00:58秦秀麗
    吉林蔬菜 2018年6期
    關(guān)鍵詞:高氏放線菌氮源

    李 麗 楊 倩 邢 力 秦秀麗

    (吉林農(nóng)業(yè)科技學院 吉林市 132101)

    5406放線菌又稱細黃放線菌(Actinomyces microflavus),在代謝過程中能夠產(chǎn)生次級代謝抗菌素、生長素以及細胞分裂素等生物活性物質(zhì),能夠刺激種子生根、發(fā)芽,對土著性病原菌具有較好的抑菌作用,減少種子受病害侵害,使土壤中無效磷、鉀得到轉(zhuǎn)化[1-2]。因此能促進作物生長,防止作物及果蔬枯萎病、白粉病等多種病害的發(fā)生,提高作物及果蔬的品質(zhì)及產(chǎn)量[3-4],是具有解鉀、解磷、抗病、促生、保苗等多功能的抗生菌肥[5-6],在綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有較好的應(yīng)用前景。目前培養(yǎng)5406放線菌試管菌種常用高氏1號培養(yǎng)基,由于長期使用該培養(yǎng)基以及對其生長的環(huán)境條件不甚了解,在5406放線菌培養(yǎng)過程中常發(fā)生菌絲生長慢、甚至停止生長,雜菌污染嚴重問題等,針對這些問題本試驗對培養(yǎng)5406放線菌常用的高氏1號加富培養(yǎng)基以及生長的環(huán)境條件進行研究,對高氏1號加富培養(yǎng)基配方及生長的環(huán)境條件進行了優(yōu)化,為5406放線菌菌種培養(yǎng)及菌肥的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種:5406放線菌試管菌種由吉林農(nóng)業(yè)科技學院生物工程學院微生物實驗室提供。

    1.1.2 供試藥劑:葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、(NH4)2S04、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4、NaCL、瓊脂、NaOH、維生素 B1、維生素 B2、維生素 B6、維生素B12均為分析純。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    1.1.3.1 菌種活化培養(yǎng)基:以高氏1號培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及菌種活化培養(yǎng)基。其配方為可溶性淀粉20g、KNO33g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g、NaCl 0.5g、瓊脂 18g、H2O 1000mL、pH為7.2。

    1.1.3.2 供試培養(yǎng)基:以高氏1號培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別添加10g葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖等供試碳源至,配制供試高氏1號碳源加富培養(yǎng)基。

    以高氏1號培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別添加10g酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、(NH4)2SO4等供試氮源,配制供試高氏1號氮源加富培養(yǎng)基。

    維生素供試培養(yǎng)基:以高氏1號培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別添加0.2g維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12等供試維生素,配制供試高氏1號維生素加富培養(yǎng)基。

    1.1.4 主要設(shè)備及用具

    超凈工作臺(SW-CJ-2FD型,上海新苗醫(yī)療器械);高壓蒸汽鍋(MLS-3781L-CP型,松下醫(yī)療器械);生化培養(yǎng)箱(HPS-280型,哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司);智能培養(yǎng)箱(PGX-350A型);電子天平(BSA224S-CW型,賽多利斯科學儀器);游標卡尺;分析天平;移液槍等。

    1.2 方法

    1.2.1 供試菌種的活化

    配制高氏1號基礎(chǔ)試管培養(yǎng)基,在無菌條件下,用接種環(huán)從5406放線菌母種中挑取少許菌絲及孢子,試管培養(yǎng)基上劃線接種,27℃恒溫培養(yǎng)7天,選取菌落表面干燥、堅實多皺、菌絲潔白、致密的試管作為供試菌種,制備成104/mL孢子懸浮液。

    1.2.2 高氏1號加富培養(yǎng)基(碳源、氮源、維生素)單因素試驗

    在高氏1號基礎(chǔ)培養(yǎng)基按1.1.3.2分別加入供試碳源、氮源、維生素制備平板培養(yǎng)基,每個平板中接104/mL孢子懸浮液0.1mL,每個因素接20個平板,在27℃恒溫培養(yǎng)7天,觀測菌絲的長勢以菌落直徑[7],確定高氏1號加富培養(yǎng)基中適宜的碳源、氮源、維生素。

    1.2.3 高氏1號加富培養(yǎng)基最適配方的確定

    根據(jù)1.2.2單因素試驗結(jié)果,以篩選出的適宜碳源、氮源、維生素、pH為試驗因素,設(shè)計L9(34)正交試驗[8](設(shè)計見表1),配制9種高氏1號加富培養(yǎng)基,每個試驗組接20個平板。在27℃恒溫培養(yǎng)7天,觀測菌絲的長勢以菌落直徑,確定高氏1號加富培養(yǎng)基最佳組合。

    表1 L9(34)營養(yǎng)液正交試驗因素及水平

    1.2.4 5406放線菌生長環(huán)境條件的單因素試驗

    1.2.4.1 5406放線菌生長適宜溫度的確定:按照優(yōu)化出的高氏1號加富培養(yǎng)基最適配方制作平板培養(yǎng)基,每個平板中接104/mL孢子懸浮液 0.1mL,分別放置于 25℃、30℃、35℃、40℃、45℃生化培養(yǎng)箱中在無光條件下培養(yǎng)7天,每個水平接20個平板,觀測菌絲的長勢以菌落直徑,確定5406放線菌生長的適宜的溫度條件。

    1.2.4.2 5406放線菌生長適宜光照條件的確定:按照優(yōu)化出的高氏1號加富培養(yǎng)基最適配方制作平板培養(yǎng)基,每個平板中接104/mL 孢子懸浮液 0.1mL,分別放置于無光、100Lx、200Lx、300Lx、500Lx條件下,在最適溫度下進行培養(yǎng)7天。每個水平接20個平板,觀測菌絲的長勢以菌落直徑,確定5406放線菌生長的適宜的光照條件。

    1.2.4.3 5406放線菌生長適宜空氣相對濕度的確定:按照優(yōu)化出的高氏1號加富培養(yǎng)基最適配方制作平板培養(yǎng)基,每個平板中接104/mL孢子懸浮液0.1mL,分別放置于空氣濕度為40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%條件下,在最適溫度和光照條件下進行培養(yǎng)7天。每個水平接20個平板,觀測菌絲的長勢以菌落直徑,確定5406放線菌生長的適宜的光照條件。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 高氏1號加富培養(yǎng)基(碳源、氮源、維生素)單因素試驗結(jié)果

    2.1.1 高氏1號碳源加富培養(yǎng)基的篩選

    圖1 5406放線菌在高氏1號不同碳源加富培養(yǎng)基上生長情況

    試驗結(jié)果見圖1。試驗結(jié)果表明,在高氏1號基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同的供試碳源5406放線菌菌絲生長速度的影響是不同的。從圖1中可以看出5406放線菌在添加麥芽糖加富培養(yǎng)基上菌絲生長最快,接種7天后菌落直徑達到6.35mm,比對照培養(yǎng)基上菌落直徑大2.73mm,觀察菌落表面特征,菌絲呈白色,致密;其次是在蔗糖和葡萄糖加富培養(yǎng)基上生長較快,菌落直徑分別比對照培養(yǎng)基上菌落直徑大1.84mm和1.56mm,菌落表面白色,較致密;以乳糖為碳源加富培養(yǎng)基上菌落生長速度最慢,接種7天后菌落直徑達到4.54mm,比對照培養(yǎng)基上的菌落直徑大0.92mm,菌落表面白色,較致密。因此,通過試驗篩選出高氏1號碳源加富培養(yǎng)基為麥芽糖,其次為蔗糖和葡萄糖,生長最慢的為乳糖。

    2.1.2 高氏1號氮源加富培養(yǎng)基的篩選

    圖2 5406放線菌在高氏1號不同氮源加富培養(yǎng)基上生長情況

    試驗結(jié)果見圖2。試驗結(jié)果表明,在高氏1號基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同供試氮源,對5406放線菌菌落生長速度的影響是不同的。從圖2中可以看出5406放線菌在添加牛肉膏氮源加富培養(yǎng)基上菌絲生長最快,接種7天后菌落直徑達到6.16mm,比對照培養(yǎng)基上菌落直徑大2.54mm,觀察菌落表面特征,菌絲呈白色,致密;其次是在蛋白胨和酵母膏氮源加富培養(yǎng)基上生長較快,菌落直徑分別比對照培養(yǎng)基上菌落直徑大1.60mm和1.55mm,菌落表面白色,較致密;在(NH4)2SO4氮源加富培養(yǎng)基上菌落生長速度最慢,與對照相近,接種7天后菌落直徑達到3.86mm,只比對照培養(yǎng)基上的菌落直徑大0.24mm。因此,通過試驗篩選出高氏1號氮源加富培養(yǎng)基為牛肉膏,其次為蛋白胨和酵母膏藥,而(NH4)2SO4氮源加富培養(yǎng)基生長上菌落生長最慢。

    2.1.3 高氏1號維生素加富培養(yǎng)基的篩選

    圖3 5406放線菌在高氏1號不同維生素加富培養(yǎng)基上生長情況

    試驗結(jié)果見圖3。試驗結(jié)果表明,在高氏1號基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同供試維生素,5406放線菌菌落生長速度的影響是不同的。從圖3中可以看出,5406放線菌在添加VB1加富培養(yǎng)基上菌落生長最快,接種7天后菌落直徑達到6.24mm,比對照培養(yǎng)基上菌落直徑大2.62mm,觀察菌落表面特征,菌絲呈白色,致密;其次是在VB12加富培養(yǎng)基上生長較快,菌落直徑分別比對照培養(yǎng)基上菌落直徑大2.25mm,在VB6加富培養(yǎng)基上菌落直徑比對照培養(yǎng)基上菌落直徑大1.84mm;在VB2加富培養(yǎng)基上菌落生長速度最慢,比對照培養(yǎng)基上菌落直徑大1.23mm;因此,通過試驗篩選出高氏1號維生素加富培養(yǎng)基為VB1,其次為VB12,在VB2加富培養(yǎng)基生長上菌絲生長最慢。

    2.2 高氏1號加富培養(yǎng)基最適配方的確定

    試驗結(jié)果見表3。由表3可知,不同組合之間5406放線菌菌落生長速度是不同的,以A3B2C1D3組合放線菌菌落的生長速度最快,菌落的平均直徑為6.64mm,菌落表面為白色,菌落表面致密,長勢好。從極差分析結(jié)果可以看出,對5406放線菌生長速率影響的排序為麥芽糖>pH>VB1>牛肉膏,通過試驗確定高氏1號加富培養(yǎng)基最適配方為可溶性淀粉20g、麥芽糖15g、牛肉膏4g、B120.1g、KNO33g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g、NaCL0.5g、瓊脂 18g、H2O1000mL、pH 為 7.5。

    表3L9(34)正交試驗結(jié)果

    2.3 5406放線菌生長環(huán)境條件的單因素試驗結(jié)果

    2.3.1 5406放線菌生長適宜溫度的確定

    圖4 不同溫度對5406放線菌生長的影響

    試驗結(jié)果見圖4。由圖4可知,5406放線菌菌落隨著溫度的升高,生長速度逐漸加快,在35℃下生長速度最快,培養(yǎng)7天菌落直徑達6.35mm,菌落表面白色致密,長勢好,當超過35℃時,生長速度逐漸下降,當溫度達到45℃時,培養(yǎng)7天的菌落直徑為3.24mm,菌落表面菌絲稀疏,長勢差。由此可知,5406放線菌生長的適宜溫度為35℃。

    2.3.2 5406放線菌生長適宜空氣相對濕度的確定

    圖5 不同空氣相對濕度對5406放線菌生長的影響

    試驗結(jié)果見圖5。由圖5可知,5406放線菌菌落隨著空氣相對濕度的升高,生長速度逐漸加快,當空氣相對濕度達到60%時,生長速度最快,培養(yǎng)7天菌落直徑達6.54mm,菌落表面白色致密,長勢好;當空氣濕度超過60%時,菌落的生長速度逐漸下降,特別是空氣濕度達到80%時,平板培養(yǎng)基污染較重,表明5406放線菌不宜在高濕條件下培養(yǎng),最適的空氣相對濕度為60%左右。2.3.3 5406放線菌生長的適宜光照條件的確定

    試驗結(jié)果見圖6。由圖6可知,5406放線菌菌落在無光或弱光條件生長速度較快,隨著光照的增強,生長速度逐漸下降。觀察菌落表面特征,在無光或弱光條件下菌落致密,較厚,長勢好;當光照達到300Lx后,菌落薄,長勢較差。

    圖6 不同光照強度對5406放線菌生長的影響

    3 結(jié)論與討論

    3.1 在高氏1號碳源加富培養(yǎng)基的篩選試驗中,從理論上看葡萄糖作為單糖要比雙糖更容易被吸收,但本研究中在高氏1號基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入麥芽糖為速效碳源時,5406放線菌菌落生長速度最快,長勢最好,說明麥芽糖更易于5406放線菌吸收利用;進行高氏1號氮源加富培養(yǎng)基篩選時,試驗結(jié)果證明有機氮源有利于5406放線菌吸收和利用,特別是牛肉膏氮源加富培養(yǎng)基,菌落的生長的較快,長勢好,而在高氏1號基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入無機氮源(NH4)2SO4時,菌落的生長速度與對照相近,說明5406放線菌對無機氮源吸收利用不充分;在高氏1號維生素加富培養(yǎng)基篩選試驗中,添加不同的維生素時5406放線菌與對照相比較均有促進作用,添加VB1和VB12時效果最佳。

    3.2 試驗結(jié)果表明,所用的高氏1號加富培養(yǎng)基與高氏1號基礎(chǔ)

    培養(yǎng)基(對照)相比,均能夠促進5406放線菌的生長,但通過正交試驗篩選出適合5406放線菌生長的高氏1號加富培養(yǎng)基配方為可溶性淀粉20g、麥芽糖15g、牛肉膏4g、B10.1g、KNO33g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g、NaCL 0.5g、瓊脂 18g、H2O1000mL、pH為7.5。該配方與高氏1號基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比,營養(yǎng)更充分,更有利于5406放線菌的生長。

    3.3 5406放線菌生長不僅需要充足的營養(yǎng)條件,還需要適宜的環(huán)境條件。為了確定5406放線菌生長適宜的環(huán)境條件,本試驗對溫度、光照、空氣相對濕度進行了單因素試驗研究。試驗結(jié)果表明,5406放線菌生長適宜的環(huán)境條件為適宜溫度為35℃,適宜的空氣相對濕度為60%左右,在無光或弱光條件下生長快,菌落較厚,表面致密,長勢好。

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