不同品種棉花與棉鈴蟲互作過程中的酶活力變化

張肖麗 ，張帥 ，雒珺瑜 ，張桂寅 ，崔金杰 *

（1.河北農(nóng)業(yè)大學/教育部華北作物種質(zhì)資源研究與利用重點實驗室,河北 保定071001；2.中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽455000）

在受到植食性昆蟲危害后，植物會產(chǎn)生一系列的防御反應以提高自身防御能力，進行自我保護，這種自我防御被稱為植物的誘導抗性。植物的防御機制有多種如產(chǎn)生防御蛋白、有毒次生代謝物或誘導天敵的揮發(fā)性化合物。植物在漫長的進化過程中產(chǎn)生的次生代謝物能夠在昆蟲體內(nèi)積累擾亂昆蟲的消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等從而影響昆蟲的生長發(fā)育及繁殖能力[1]，影響昆蟲體內(nèi)解毒酶活力，干擾昆蟲代謝活動，甚至導致昆蟲死亡[2]，提高植株抗性[3]。比如，棉酚（文中簡稱“酚”）主要由棉花根部產(chǎn)生存儲于根莖葉等組織中，是由異戊二烯單位重復組成的黃色二聚倍半萜烯類化合物，是棉花重要的抗生性次生代謝物[4]。在昆蟲與植物互作過程中，昆蟲也會增強自身的解毒能力，以應對植物的防御反應[5-6]。

過氧化物酶（Peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶 （Superoxide dismutase，SOD）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是棉花重要的防御酶，是植物在受到不良環(huán)境脅迫時進行代謝防御反應的關鍵酶[7]。POD、SOD與過氧化氫酶（Catalase，CAT）3種酶相互作用清除植物在受到環(huán)境脅迫時體內(nèi)產(chǎn)生的過?；钚匝踝杂苫?（Reactive oxygen species，ROS）[8]，使植物體內(nèi)活性氧處于動態(tài)平衡狀態(tài)以提高植物的抵御能力[9]。PPO是廣泛分布于自然界各類植物體內(nèi)的金屬蛋白酶，屬于抗氧化酶類[10]，不僅參與木質(zhì)素的合成，還參與酚類物質(zhì)氧化反應生成醌[11]。有研究表明，植物次生代謝物可誘導解毒酶活力產(chǎn)生變化[12]。酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）、谷胱甘肽-S轉移酶 （Glutathione-S-transferase，GST）屬于昆蟲的主要解毒酶系。 乙酰膽堿酯酶（Acetyl cholinesterase，AChE）活力變化通常被用來反映昆蟲對有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感程度，現(xiàn)有許多研究證實取食不同的寄主食物可以影響昆蟲AChE酶活力[13]。

本文研究了棉鈴蟲幼蟲取食誘導棉酚含量不同的棉花前后，棉花防御酶以及棉鈴蟲幼蟲解毒酶、AChE酶活力的變化，以期為抗蟲棉育種以及棉鈴蟲的綜合治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試棉花。供試棉花品種或品系 （以下統(tǒng)稱“品種”）分別為魯棉 12（低酚）、中棉所 22（低酚）、Giza77（低酚）、美 9101（高酚）、中棉所 12（高酚）、石遠 321（高酚）、HG-BR-8（感蟲對照），由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所種質(zhì)資源庫提供。前6個品種棉籽的棉酚含量依次為0.008%、0.005%、0.023%、1.116%、1.005%、0.468%，各品種酚含量數(shù)據(jù)由種質(zhì)資源庫提供或參考文獻所得[14-15]。各品種棉花種于光照培養(yǎng)室內(nèi)種植，種植條件為溫度（26±1）℃，相對濕度（75±5）%，光周期（光暗時間）14 h/10 h。

1.1.2供試昆蟲。供試棉鈴蟲蟲卵購于濟源白云實業(yè)有限公司。于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)孵化，孵化條件為溫度（28±1） ℃，相對濕度（75±5）%，光周期（光暗時間）14 h/10 h。

1.2 試驗方法

1.2.1棉鈴蟲幼蟲取食誘導。（1）幼蟲質(zhì)量測定試驗。待棉花長至6～8葉期，取棉花頂部展開的倒三葉接入棉鈴蟲初孵幼蟲5頭，以微型養(yǎng)蟲籠固定，3 d后稱量棉鈴蟲幼蟲質(zhì)量。（2）室內(nèi)抗蟲性鑒定。取棉花頂部展開的倒三葉插入加有瓊脂的塑料杯內(nèi)，接入初孵棉鈴蟲幼蟲5頭，并封口防止其逃逸。每個品種隨機取10株，設3次重復。5 d后調(diào)查計算各品種棉鈴蟲幼蟲校正死亡率（rA）及葉片被害級別（DL）。公式：rA（%）=（ri－rCK）/（ 1－rCK）×100。式中，ri為某鑒定材料的棉鈴蟲幼蟲死亡率，rCK為對照材料的幼蟲死亡率。DL=（∑i×Ni）/N。 式中，i為葉片某被害級別，Ni為i級別葉片數(shù)，N為調(diào)查葉片總數(shù)。

具體評判標準參照雒珺瑜等方法[16]。將目測葉片被害級別分為4個等級，根據(jù)葉片被取食程度依次為：1級―受害成針眼狀且不連片；2級―受害呈片狀，小于葉面積的25%；3級―受害呈片狀，受害面積在≥25%～＜50%；4級及以上―受害呈片狀，受害面積≥50%。室內(nèi)抗性鑒定綜合評定時取各指標最低值，抗性級別標準為：高抗，幼蟲校正死亡率≥90%，葉片被害級別為1級；抗，幼蟲校正死亡率在≥60%～＜90%，葉片被害級別為2級；中抗，幼蟲校正死亡率在≥40%～＜60%，葉片被害級別為3級；感及以下，幼蟲校正死亡率小于40%，葉片被害級別為4級及以上。

1.2.2各品種棉花保護酶活力測定。選取長勢相同的同時期各品種棉花頂部倒三葉接入初孵棉鈴蟲幼蟲5頭，用微型養(yǎng)蟲籠固定，待取食0 h、24 h、48 h、72 h后收取這些棉葉，液氮速凍，－80℃保存待用。

棉花POD酶活力測定采用POD測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），測定470 nm處的吸光度的變化值。棉花SOD酶活力測定采用SOD測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），利用SOD專一性抑制超氧離子自由基的原理，以分光光度計測其吸光度值來計算。棉花PPO酶活力選用PPO測試試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定，以分光光度計測定420 nm處的吸光度值變化來計算。棉花POD酶活力以每克新鮮棉葉在1 mL反應體系中470 nm處的吸光度0.01為1個酶活力單位（U）。棉花PPO酶活力單位定義為每分鐘每克新鮮棉葉在1 mL反應體系中420 nm處的吸光度值變化0.01為1個酶活力單位（U）。SOD以反應體系中SOD抑制率達50%時所對應的酶量為1個酶活力單位（U）。計算方式見說明書[17-19]。

1.2.3棉鈴蟲解毒酶及AChE酶活力測定。選取長勢相同的同時期各品種棉花，在頂部倒三葉接入初孵棉鈴蟲幼蟲5頭，用微型養(yǎng)蟲籠固定。待取食24 h、48 h、72 h后收取棉鈴蟲幼蟲樣品，液氮速凍后－80℃保存。棉鈴蟲幼蟲ACP、GST與AChE 3種酶活力均采用酶活力測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定。

ACP酶活力單位（金氏單位）定義：37℃下每克組織蛋白與基質(zhì)反應30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位。GST酶活力單位定義：37℃下1 mg組織蛋白扣除非酶促反應，使反應體系中非還原性谷胱甘肽濃度降低 1 μmol·L－1為 1個酶活力單位。AChE酶活力單位定義：1 mg組織蛋白37℃保溫6 min后，使反應體系中1 μmol基質(zhì)水解為1個酶活力單位。計算方式見說明書[20-22]。

1.2.4數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20進行單因素方差分析判斷差異顯著性，以Turkey HSD法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 抗蟲性鑒定結果

接蟲3 d后，取食不同棉酚含量品種棉花葉片的棉鈴蟲幼蟲質(zhì)量為取食低酚棉＞取食高酚棉，但差異未達顯著水平。取食高酚品種美9101棉花葉片的棉鈴蟲幼蟲質(zhì)量較取食低酚品種魯棉12、Giza77、中棉所22的幼蟲質(zhì)量分別低3.35%、0.69%、2.03%。取食高酚品種石遠321的棉鈴蟲幼蟲質(zhì)量分別較取食低酚品種魯棉12、Giza77、中棉所 22的低 3.52%、0.87% 、2.2%（表 1）。

室內(nèi)葉片接蟲5 d時的抗性鑒定結果顯示：取食魯棉12的棉鈴蟲幼蟲校正死亡率最高，取食中棉所12的棉鈴蟲幼蟲校正死亡率最低，但各品種之間無顯著差異。中棉所12葉片被害級別最高，與魯棉12、Giza77有顯著差異（表1）。各品種棉花對棉鈴蟲抗性水平均為感蟲。

表1 棉花抗蟲性鑒定結果

2.2 棉花防御酶活力比較

棉鈴蟲取食前各品種棉花葉片防御酶活力比較結果顯示：美9101的POD酶活力最低，Giza77最高；PPO酶活力最低的是中棉所12，最高的是魯棉12；SOD酶活力最低的是魯棉12，最高的是中棉所22（表2）。棉鈴蟲幼蟲取食前各品種間棉花防御酶活力有差異，且部分差異達顯著水平，但此時防御酶的活力與棉酚含量無相關性。

棉鈴蟲幼蟲取食后各品種棉花葉片POD酶活力均隨著取食時間的增加逐漸升高，且除魯棉12以外的低酚棉品種POD酶活力增幅較高酚棉品種小。棉鈴蟲幼蟲取食24 h時，美9101、中棉所12、石遠321葉片PPO酶活力顯著升高，而魯棉12、Giza77、中棉所22無顯著變化；取食48 h時，美9101、中棉所12葉片PPO酶活力低于魯棉12、中棉所22、Giza77，但差異均不顯著。除中棉所22外，其余各品種棉花葉片SOD酶活力在棉鈴蟲幼蟲取食誘導48h時均較取食0h、24h時顯著增高（表2）。

表2 棉鈴蟲幼蟲取食不同時間后各品種棉花防御酶活力

2.3 棉鈴蟲幼蟲解毒酶及AChE酶活力比較

測定結果（表3）顯示：在取食各品種棉花24～48 h時，棉鈴蟲幼蟲AChE酶活力顯著降低；48 h時，取食高酚品種美9101、中棉所12的棉鈴蟲幼蟲AChE酶活力顯著高于取食各低酚品種的，但取食石遠321的棉鈴蟲幼蟲AChE酶活力僅顯著高于取食魯棉12的。取食各品種棉花后，幾乎所有棉鈴蟲幼蟲ACP酶活力在取食24～48 h時變化不顯著，但在取食72 h時，取食魯棉12、Giza77、中棉所22、美9101、石遠321的棉鈴蟲幼蟲ACP酶活力均顯著增高。在取食24～48 h時，取食高酚品種美9101、中棉所12、石遠321的棉鈴蟲幼蟲GST酶活力均顯著增高，而低酚品種間并未呈現(xiàn)一致的增高或下降趨勢。

表3 取食不同品種棉花后棉鈴蟲幼蟲體內(nèi)酶活力變化

3 結論與討論

植物在受到病蟲害、旱澇、鹽堿等脅迫時，會誘導或抑制植物次生代謝物質(zhì)的合成從而提高植物的自我防御以及適應不良環(huán)境的能力[23]。在受到蚜蟲危害后，抗性棉花品種苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）、POD 和 PPO 酶活力均顯著高于感蟲品種，PPO的活力變化與棉花的抗蚜性強弱相關[24]。任茂瓊等研究發(fā)現(xiàn)朱砂葉螨取食玉米的抗性越強體內(nèi)解毒酶活力越高[6]。毛紅等研究發(fā)現(xiàn)綠盲蝽危害后棉花PPO酶活力升高，且抗性品種PPO酶活力上升速率要高于感蟲品種[25]。曾永三等研究發(fā)現(xiàn)棉花防御酶中PPO酶活力的增加可以促使植物體內(nèi)酚類合成與木質(zhì)素的積累來抵御銹菌，POD通過參與植物木質(zhì)素的合成，增加細胞壁木質(zhì)化程度來增加植株抗性[26]。SOD是植物在逆境下體內(nèi)活性氧清除過程中的重要抗氧化酶，SOD酶活力與植物的抗逆性成正相關[27]。

本研究通過分析不同品種棉花受到棉鈴蟲幼蟲取食危害前后SOD、PPO、POD酶活力的變化來判定不同棉花品種誘導抗性的強弱。本試驗中不同品種棉花中酶活力在受危害之前存在明顯差異，且與棉酚含量不相關；但是在受到棉鈴蟲危害后，不同棉酚含量的棉花葉片POD酶活力均顯著增高，且多數(shù)低酚品種POD酶活力增幅較高酚品種小。高酚品種在受棉鈴蟲脅迫后，棉花葉片PPO酶活力在24 h內(nèi)顯著增高，低酚品種在48 h內(nèi)PPO酶活力也上升但不顯著。棉鈴蟲持續(xù)取食48 h后各品種SOD酶活力均升高，取食72 h時較取食48 h增加或下降。受棉鈴蟲危害后，棉花通過防御酶活力的變化一定程度上提高了棉花的抗性水平，其中高酚棉花品種PPO、POD酶活力變化受棉鈴蟲脅迫影響較大，也反映了高酚品種誘導抗性水平高于低酚品種。

植物與昆蟲之間的互作是1種防御與反防御的過程。植物次生物質(zhì)既可以毒殺昆蟲，也可以誘導昆蟲通過調(diào)控解毒酶以及AChE酶活力以提高其適應能力[28-30]。李時榮等研究發(fā)現(xiàn)解毒酶促進了麥長管蚜對不同品種寄主的適應性[31]。本試驗中，棉鈴蟲幼蟲AChE酶活力在一定時間內(nèi)隨著取食時間呈降低趨勢，且與酚含量相關。除取食中棉所12以外的棉鈴蟲幼蟲ACP酶活力在取食72 h時均顯著增高，但其變化趨勢與酚含量之間無關。取食高酚品種的棉鈴蟲幼蟲GST酶活力在取食48 h時較取食24 h時顯著增高，取食低酚品種棉花的棉鈴蟲幼蟲GST酶活力變化趨勢不一致。

本試驗中對不同品種棉花的室內(nèi)生物學抗性測定結果表明，在飼喂條件相同的情況下，取食不同品種棉花的棉鈴蟲3 d齡幼蟲質(zhì)量無明顯差異。這可能與所選棉花品種棉鈴蟲抗性一致有關。棉鈴蟲幼蟲取食后的棉花防御酶的活力測定結果顯示不同棉酚含量品種棉花在受到棉鈴蟲危害后POD、PPO酶活力的變化不僅與受害時間有關，且受棉酚含量的高低影響。取食不同棉花品種后的棉鈴蟲幼蟲AChE、GST酶活力的變化表明昆蟲解毒酶活力變化與取食棉花的酚含量相關。綜上所述，棉花防御酶、棉鈴蟲解毒酶及乙酰膽堿酯酶活力變化受棉花品種酚含量高低、棉鈴蟲危害時間等因素綜合影響，低酚品種誘導抗性低于高酚品種。

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