蟬花蟲草分類地位及其遺傳多樣性研究進展*

李建平，張 鐵，曾文波**

（1.文山學(xué)院三七學(xué)院，云南 文山 663099；2.文山學(xué)院文山州生物資源開發(fā)研究中心，云南 文山 663099）

蟬花蟲草（Isaria cicadae）是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，作為1種藥食兩用真菌，在中國已有至少1 500多年的應(yīng)用歷史，比記載中冬蟲夏草的應(yīng)用還要早200多年[1-2]。蟬花蟲草中功效成分主要包括多糖、蟲草酸、水溶性核苷類成分、氨基酸、麥角甾醇、環(huán)肽類、多球殼菌素、有機酸等[3]，其中，水溶性核苷類成分包括尿嘧啶、尿苷、2’-脫氧尿苷、鳥苷、胞苷、次黃嘌呤、肌苷、胸腺嘧啶、胸苷、2’-脫氧腺苷，N6-(2-羥乙基)腺苷等[4-5]。蟬花蟲草具有免疫調(diào)節(jié)、滋補強壯、改善腎功能、抗腫瘤、抗疲勞、抗應(yīng)激、抗氧化及抗衰老、解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、降血糖、降血壓等多種功效及藥理作用[3]。因此，蟬花蟲草是1種具有巨大開發(fā)價值的藥用真菌。但是，長期以來，蟬花蟲草分類學(xué)地位幾經(jīng)變動，加上其他一些蟲草易被混淆為蟬花蟲草，使得相關(guān)文獻報道混亂，不利于蟬花蟲草的研究及開發(fā)利用。因此，有必要對蟬花蟲草的分類地位及其生物多樣性文獻進行梳理。通過對蟬花蟲草的歷史記載、分類地位及遺傳多樣性等3個方面進行了綜述，以期為蟬花蟲草的研究和開發(fā)利用等提供參考。

1 蟬花蟲草的歷史記載

關(guān)于蟬花蟲草最早的文字記載可追溯到公元5世紀南北朝，雷敩所著《雷公炮炙論》中記載：“凡使，要白花全者。凡收得后，于屋下東角懸干，去甲土后，用漿水煮一日，至夜，焙干，碾細用之”[1]。這是關(guān)于蟬花蟲草形態(tài)、保存和服用方法最早的記載。隋唐時期，甄權(quán)所著《藥性論》對蟬花蟲草的形態(tài)有了進一步的描述，并解釋了“蟬花”之名的由來，此外，還記載了其功效及藥性，該書關(guān)于蟬花蟲草的記載“其蛻殼，頭上有一角，如冠狀，謂之蟬花，最佳。味甘寒，無毒。主小兒天吊，驚癇螈，夜啼心悸”[3]。宋朝蘇頌等編寫的《圖經(jīng)本草》中關(guān)于蟬花蟲草記述“今蜀中有一種蟬，其蛻殼頭上有一角，如花冠狀，謂之蟬花人藥最奇”[6]，該書記載了蟬花蟲草的產(chǎn)地，對于蟬花蟲草形態(tài)有了更加細致的描述，即蟬花蟲草的孢梗束從寄主蟬若蟲的頭部長出，其孢梗束頂端呈花冠狀。宋代唐慎微《經(jīng)史證類備急本草》[7]關(guān)于蟬花蟲草記載“味甘，寒，無毒。主小兒天吊，驚癇螈，夜啼心悸。所在皆有，七月采。生苦竹林者良，花出土上”。該書對蟬花蟲草的生長時間、生境、毒理及藥理作用進行了記述,“所在皆有”說明蟬花普遍存在，產(chǎn)量較大。明朝李時珍所著《本草綱目》中關(guān)于蟬花蟲草記載《經(jīng)史證類備急本草》一致?？脊艑W(xué)家從西周至秦（公元前1000年～公元前200年） 的文物中發(fā)現(xiàn)貴族的隨葬品內(nèi)有口含的青玉雕刻的蟬體狀裝飾品及佩帶的玉雕僵蠶，我國著名真菌學(xué)家臧穆認為，這很可能是象征良藥治病，祈福余蔭的意思[8]，表明古人已經(jīng)認識到僵蠶及蟬花蟲草，希望死者能像僵蠶和蟬花蟲草一樣死后尸體不腐，像蟬變成蟬花一樣從長眠中醒來。筆者將蟬花蟲草的分布區(qū)域與周朝及秦朝的疆域進行了比較，周朝的疆域主要包括我國今山東、河南的大部分地區(qū)，河北、山西的南部，陜西的中部，甘肅的東部，江蘇、湖北、安徽的北部[9]；秦朝疆域為東、南到海，西到今甘肅、四川，西南至云南、廣西，北到陰山，東北至遼東[10]。蟬花蟲草分布在我國秦嶺—淮河以南18個省區(qū)[3，11]，由此可知，周朝及秦朝的疆域與蟬花產(chǎn)地大部分重合，表明古人具備認識蟬花蟲草的客觀條件?？脊艑W(xué)的發(fā)現(xiàn)及蟬花蟲草相關(guān)文字記載，表明我國勞動人民對于蟬花認識約有3 000年的歷史，應(yīng)用歷史至少有1 500多年。

根據(jù)蟬花蟲草相關(guān)記載中的描述[2-3，6-7]，“蟬花”一詞在歷史上應(yīng)指的是真菌蟬棒束孢Isaria cicadaeMiquel寄生蟬若蟲形成的蟲菌復(fù)合體。此外，在歷史上和現(xiàn)今，“蟬花”的應(yīng)用主要是以蟬棒束孢Isaria cicadae為主體，其產(chǎn)量及分布范圍是其他“蟬花”混淆品所不能比擬的[3，11]，鑒于棒束孢屬IsariaPers.已經(jīng)被Kepler等[12]于2017年廢除，本文中采用“蟬花蟲草”作為該真菌的中文名，拉丁名暫時使用Isaria cicadaeMiquel，下文將會對其分類地位進行分析討論。

2 蟬花蟲草的分類地位

“蟬花”一詞為蟬花蟲草的俗稱，不是分類學(xué)上的名詞，是真菌蟬棒束孢Isaria cicadaeMiquel寄生于蟬若蟲后形成的蟲菌復(fù)合體，孢梗束自蟲體頭部叢聚成束長出，淺黃色，長1.5 cm～6.0 cm，前端膨大，呈紡錘形。其主要鑒別特征是分生孢子梗上的分枝多局限于頂部，瓶梗粗而短，密集，分生孢子較大，常彎曲。蟬棒束孢于1838年，由Miquel首次定名[13]，之后出現(xiàn)了基生球殼孢Sphaeria basiliTaylor（1844年），辛克萊球殼孢Sphaeria sinclairii Berk.（1855年）、基生棒束孢Isaria basili（Taylor）Kobayasi=Sphaeria basiliTaylor（1941年）、蟬蟲草Cordyceps cicadae（Miquel）Massee（1895 年）、蟬擬青霉Paecilomyces cicadae（Miq.） Samson（1974 年）和大蟬草Cordyceps cicadaeShing（1975年） 和蟬擬青霉Paecilomyces cicadae（雌蟬花） 等[14-17]。自1974年以后，相關(guān)文獻記載主要以蟬擬青霉P.cicadae為主。2004年，Luangsa-ard等[18-19]通過核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔ITS、核糖體小亞基nrSSU和β-微管球蛋白β-tub等基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，擬青霉屬Paecilomyces是多元發(fā)生的，該屬不是一個自然分類單元。Luangsa-ard等[18]將蟬擬青霉P.cicadae等重新移入棒束孢屬（IsariaPers.）。棒束孢屬的特征為分生孢子梗單生或束絲狀，常由數(shù)個輪狀分支組成，其上著生由瓶梗組成的輪生體。瓶?；恐鶢罨蚺虼螅蛏献兗毘始氶L的頸部，形成離散的分生孢子鏈。分生孢子單孢，偶有雙細胞，壁光滑，透明。菌落白色、黃色、淡綠色、肉紅色、紅色或紫色等明亮色調(diào)。菌絲透明至微色，粗糙或光滑，一些種具有厚垣孢子。常見的棒束孢屬物種有蟬棒束孢Isaria cicadae、細腳棒束孢I.tenuipes、鮮紅棒束孢I.amoenerosea、斜鏈棒束孢I.cateniobliqua、玫煙色棒束孢I.fumosorosea、環(huán)鏈棒束孢I.cateniannulata和粉質(zhì)棒束孢I.farinose等。

近十多年以來，廣義蟲草屬Cordyceps(Fr.)Link s.l.的分類地位發(fā)生了較大的變化。2007年，Sung等[20]基于核糖體大亞基nrLSU、核糖體小亞基nrSSU、真核生物翻譯延伸因子1α（tef1α）、真核生物RNA聚合酶II最大亞基rpb1和第二大亞基rpb2、β-微管球蛋白β-tubulin和線粒體atp6七個基因片段對蟲草及相關(guān)真菌162個分類群的分子系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，廣義蟲草屬Cordyceps(Fr.)Link s.l.和廣義麥角菌科Clavicipitaceae s.l.并不是一個單系類群，并根據(jù)聚類關(guān)系把廣義麥角菌科分為3個科，分別是蟲草科 Cordycipitaceae、線蟲草科 Ophiocordycipitaceae、狹義的麥角菌科 Clavicipitaceae s.s.，廣義蟲草屬分為4個屬，分別是狹義蟲草屬Cordycepss.s.、泛蟲草屬Metacordyceps、線蟲草屬Ophiocordyceps和大團囊蟲草屬Elaphocordyceps，棒束孢屬物種隸屬于蟲草科 Cordycipitaceae、蟲草屬Cordycepss.s.，這也產(chǎn)生了矛盾，即狹義蟲草屬下包含了棒束孢屬Isaria、蚧霉屬Lecanicillium、蟲殼屬Torrubiella和白僵菌屬Beauveria等多個屬，有待進一步的研究并修訂；Kepler等[12]采用nrLSU、nrSSU、tef1α、rpb1和rpb2等5個基因片段開展蟲草科Cordycipitaceae系統(tǒng)分類研究，將蟲草科Cordycipitaceae狹義蟲草屬Cordycepss.s.劃分為 11個屬，分別為蟲草屬Cordycepss.s.、刺束梗孢屬AkanthomycesLebert、球束梗孢屬GibellulaCavara、白僵菌屬BeauveriaVuill.、多孔囊菌屬AscopolyporusM?ller,Bot.Mitt.、側(cè)齒霉屬Engyodontiumde Hoog、厚蓋霉屬HyperdermiumJ.F.White,R.F.Sullivan,Bills&Hywel-Jones、擬側(cè)齒霉屬ParengyodontiumC.C.Tsang et al.、單梗霉屬SimplicilliumW.Gams&Zare、哈利埃文斯菌屬HevansiaLuangsa-ard，Hywel-Jones&Spatafora、布萊克威爾霉屬BlackwellomycesSpatafora&Luangsa-ard。Kepler等（2017）[12]研究發(fā)現(xiàn)棒束孢屬為多系起源，部分該屬物種甚至超出了蟲草科的范疇，Kepler等建議廢除該屬名，Kepler等已經(jīng)將細腳棒束孢I.tenuipes、粉質(zhì)棒束孢I.farinose等與蟬棒束孢I.cicadae具有較近親緣關(guān)系的物種，分別修訂為細腳蟲草Cordyceps tenuipes和粉質(zhì)蟲草C.farinose，蟬棒束孢I.cicadae可能將被移入到狹義蟲草屬Cordycepss.s.，歷史上Massee和我國學(xué)者幸興球都曾使用Cordyceps cicadae進行物種命名，但都是不合格命名[3]。因此，其種加詞有待進一步的研究確定，考慮到該真菌為我國傳統(tǒng)中藥材，具有重要的開發(fā)價值，中文名建議使用蟬花蟲草。

3 蟬花蟲草遺傳多樣性

生物多樣性包括生態(tài)多樣性、物種多樣性和遺傳多樣性。檢測遺傳多樣性的方法隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展而不斷提高和完善。通常依據(jù)時間線，遺傳多樣性的檢測分為形態(tài)學(xué)水平、細胞學(xué)水平、生化水平、核酸水平。任何一種檢測遺傳多樣性的方法都存在各自的優(yōu)點和局限，各種方法都能從各自的角度提供有價值的信息，都有助于人們認識遺傳多樣性及其生物學(xué)意義。蟬花蟲草屬于全球廣布種，產(chǎn)地眾多，蟬花蟲草在生境、形態(tài)、化學(xué)成分和核酸水平等多個層次具有多樣性[3-4，11，13，21-22]。

3.1 生態(tài)多樣性

蟬花蟲草為世界性廣布種，包括中國、韓國、日本、南亞、歐洲、北美等國家及地區(qū)，在我國分布于秦嶺—淮河以南18個省區(qū)，分布在海拔10 m～2 800 m，生長期為6月～10月，適宜溫度18℃～30℃。蟬花蟲草的繁盛期根據(jù)各地水熱條件有一定的差異，蟬花蟲草生長于熱帶和亞熱帶的常綠闊葉林、落葉闊葉林、針闊葉混交林及竹林等生境，蟬花蟲草在上海、浙江、福建、安徽、江蘇、廣東和江西等地多分布于竹林，在云南、四川、貴州、陜西、海南和廣西等地則多生長于闊葉林和針闊葉混交林[3，11]。筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蟬花蟲草在竹林的產(chǎn)量明顯高于其它生境。蟬花蟲草寄主包括山蟬Cicadae flammata、蟪姑Platypleura kaempferi、黑蚱Crytotympana pustulata、竹蟬Platylomia pieli、云南黑蟬Cicadatra shaluensis和鳴鳴蟬Oncotympana maculatieollis等蟬科昆蟲的若蟲[3，11]。由上可知，蟬花蟲草分布廣，可感染多種寄主，對生長條件要求不嚴格，能適應(yīng)多種生態(tài)環(huán)境。

3.2 形態(tài)多樣性

陳祝安等[3]和劉愛英等[13]均對蟬花蟲草的形態(tài)及無性型菌絲體形態(tài)多樣性進行描述，但相關(guān)描述主要針對少數(shù)個體，而不是以居群為單位進行統(tǒng)計分析，不能反映蟬花蟲草物種水平、居群水平的形態(tài)多樣性。李建平等和曾文波等分別開展了不同居群（population）的蟬花蟲草及其無性型菌絲體形態(tài)性狀研究，一定程度上揭示了蟬花蟲草形態(tài)變異式樣[21-22]。

李建平等[21]對蟬花蟲草的形態(tài)多樣性進行了分析，該研究選取了10個居群的蟬花蟲草，測定了其菌核長、菌核周長、孢梗束分枝數(shù)、分枝長、分枝周長、菌核質(zhì)量、孢梗束質(zhì)量、子實體質(zhì)量等12個形態(tài)性狀。采用SAS 8.1軟件對蟬花蟲草形態(tài)性狀數(shù)據(jù)進行描述性、巢式方差和Q聚類分析。描述性分析表明，蟬花蟲草居群12個形態(tài)性狀的變異系數(shù)（CV值） 在12.97%～162.57%之間，在物種水平表現(xiàn)出豐富的變異；巢式方差分析表明，蟬花蟲草12個形態(tài)性狀在居群間平均方差分量占總變異的33.79%，居群內(nèi)個體間平均方差分量占總變異的66.21%，說明蟬花蟲草居群內(nèi)個體形態(tài)性狀變異豐富，是形態(tài)性狀變異的主要來源，居群間形態(tài)性狀分化不明顯。此外，Q聚類分析表明蟬花蟲草居群形態(tài)性狀具有一定的地理相關(guān)性[21]。

曾文波等（2017）[22]開展了蟬花蟲草無性型菌絲體形態(tài)多樣性研究，選取了15個居群，共75個菌株，觀察和測量了菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子等部位共17個顯微形態(tài)性狀，采用SAS 8.1軟件對蟬花蟲草無性型顯微形態(tài)性狀數(shù)據(jù)進行描述性、巢式方差和Q聚類分析。結(jié)果表明，蟬花蟲草無性型具有大小兩型分生孢子，產(chǎn)孢細胞的形態(tài)可分為葫蘆狀和瓶狀2種類型；蟬花蟲草在PDA培養(yǎng)基中易形成數(shù)量眾多的厚垣孢子，菌絲間多能形成融合菌絲，并可觀察到少量的融合菌絲在厚垣孢子與菌絲間、產(chǎn)孢細胞間形成。描述性分析表明，蟬花蟲草居群17個形態(tài)性狀的變異系數(shù)（CV值）在 13.07%～104.09%，在物種水平表現(xiàn)出豐富的變異；巢式方差分析表明，蟬花蟲草菌株顯微形態(tài)性狀在居群間平均方差分量占總變異的11.29%，居群內(nèi)個體間平均方差分量占總變異的15.27%，菌株內(nèi)觀察值間平均方差分量占總變異的73.44%。蟬花蟲草菌株形態(tài)性狀變異豐富，是形態(tài)性狀變異的主要來源，蟬花蟲草居群顯微形態(tài)性狀不存在明顯的地理相關(guān)性[22]，這與蟬花蟲草宏觀形態(tài)的結(jié)論不一致，這可能與其寄主和生境有關(guān)，即不同產(chǎn)地的蟬花蟲草寄主不同，對于蟬花蟲草菌核的大小、重量，孢梗束等影響明顯，不同生境的表層土壤及枯枝落葉等對其孢梗束的形態(tài)具有較大的影響[3]，使得蟬花蟲草宏觀形態(tài)具有地域特征，而蟬花蟲草菌絲體形態(tài)性狀只與菌株本身遺傳特性有關(guān)，使得菌絲體形態(tài)性狀在居群間的平均方差分量占比（11.29%） 小于宏觀形態(tài)性狀（33.79%）。

由上可知，蟬花蟲草宏觀形態(tài)及菌絲體形態(tài)變異式樣基本一致，即形態(tài)變異主要來自居群內(nèi)個體，居群間分化不明顯。這可能與蟬花蟲草的繁育方式有關(guān)，即蟬花蟲草自然條件下主要是以產(chǎn)生無性分生孢子的方式進行無性繁殖，這使得其遺傳物質(zhì)相對穩(wěn)定，另外，結(jié)合蟬花蟲草在全球的分布情況，說明蟬花蟲草具有較強的擴散傳播能力，使得居群間分化也較小。

3.3 生化水平多樣性

核苷類成分是蟲草中主要的有效成分，包括尿嘧啶、尿苷、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、腺苷、2-脫氧腺苷和蟲草素等。Zeng等[4]測定了10個居群的蟬花蟲草的菌核及孢梗束中的尿嘧啶、尿苷、2’-脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2-脫氧腺苷9個核苷類成分，采用SAS 8.1軟件對蟬花蟲草菌核及蟬花蟲草中核苷類成分進行描述性、巢式方差和Q聚類分析。描述性分析結(jié)果顯示，菌核部分和孢梗束部分核苷類成分的變異系數(shù)（CV值）分別在 10.77%～155.87%，以及 8.36%～112.36%，巢式方差分析表明，孢梗束中核苷類居群間平均方差分量百分比為42.29%，居群內(nèi)個體間平均方差分量占比為57.71%，表明核苷類成分的變異來源有42.29%來自于居群間，57.71%變異來自居群內(nèi)個體間，表明蟬花蟲草孢梗束部分居群內(nèi)個體間核苷類成分含量變異較居群間多，但是居群間核苷類成分含量也出現(xiàn)了一定的分化。菌核中核苷類成分有28.94%的變異源自居群間，71.06%的變異來自于居群內(nèi)個體間，表明蟬花蟲草菌核中核苷類成分居群內(nèi)個體變異十分豐富。此外，龍良鯤等[23]檢測了4個蟬花蟲草菌株的產(chǎn)透明質(zhì)酸情況，其中2個能生成透明質(zhì)酸，其中編號C1502的蟬花蟲草菌株產(chǎn)透明質(zhì)酸的能力可達 2.45 mg·mL-1。胡海燕[24]測定了不同產(chǎn)地 22 個蟬花蟲草菌株產(chǎn)胞外多糖和透明質(zhì)酸的能力，結(jié)果顯示，胞外多糖和透明質(zhì)酸的產(chǎn)量，最高的菌株是最低菌株的3倍。

以上結(jié)果顯示，蟬花蟲草核苷類成分、透明質(zhì)酸、胞外多糖等次生代謝產(chǎn)物，居群內(nèi)個體是變異的主要來源，蟬花蟲草生化水平具有豐富的多樣性，在選取優(yōu)良菌株用于生產(chǎn)時應(yīng)重視菌株間的差異。

3.4 核酸水平多樣性

目前，關(guān)于蟬花蟲草基因片段的測序，主要是針對少數(shù)個體的片段測序，開展其居群核酸水平多樣性研究還很少，相關(guān)研究需要進一步開展。曾文波等[22]測定15個居群75個蟬花蟲草菌株的ITS片段，并于國際核酸數(shù)據(jù)庫NCBI中下載蟬花蟲草ITS序列，共獲得蟬花蟲草ITS序列100條。比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蟬花蟲草ITS序列無位點多態(tài)性，即在ITS序列中，無種內(nèi)多樣性，核苷酸多樣性為0。但是，ITS片段提供的信息有限，關(guān)于蟬花蟲草核酸水平多樣性的研究工作還有待深入開展。

Fan等[25]首次報道了蟬花蟲草線粒體基因組，一共測定了3個蟬花蟲草菌株，菌株號分別為CCAD02、BA-001、ARSEF11726，線粒體基因組的長度分別為56581bp、56080bp和49138bp，CCAD02的線粒體基因組長度比ARSEF11726的長約7 kb，這是由于CCAD02的線粒體基因組比ARSEF11726多了6個內(nèi)含子，蟬花蟲草線粒體基因組在長度上具有多態(tài)性。

蟬花蟲草基因組初步分析顯示，基因組大小為36.9 Mb，其蛋白編碼基因數(shù)量以及基因密度遠高于蛹蟲草、球孢白僵菌、金龜子綠僵菌等蟲草真菌，表明蟬花蟲草含有豐富的遺傳基因，可能表達豐富的活性物質(zhì)[3]。

4 展望

結(jié)合蟬花蟲草的歷史記載及蟲草類真菌最新系統(tǒng)分類研究進展，確認了蟬花蟲草的分類地位，并探討了蟬花蟲草的遺傳多樣性，以避免混亂，為今后開展蟬花蟲草的研究、開發(fā)和利用提供了參考。

蟬花蟲草與冬蟲夏草含有相似的功效成分，例如多糖、蟲草酸、水溶性核苷類成分等，且具有相似的功效及藥理作用，例如免疫調(diào)節(jié)、滋補強壯、改善腎功能、抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化及抗衰老、降血脂、降血糖[26-27]，冬蟲夏草生長于海拔3 500 m～5 000 m的高山灌叢草甸帶和高寒草甸帶，年產(chǎn)量逐年減少，價格最高達30萬元/kg，人工栽培技術(shù)還有很多問題有待解決[28]，與冬蟲夏草相比較，蟬花蟲草易于人工培養(yǎng)，栽培成本低，現(xiàn)已實現(xiàn)人工規(guī)?；耘郲3]，人工培養(yǎng)蟬花蟲草可作為冬蟲夏草的代用品，接下來應(yīng)進一步開展蟬花蟲草種質(zhì)資源收集、基因功能、化學(xué)成分、藥理作用及功效、產(chǎn)品開發(fā)等方面的研究工作。